封 銳,王丹丹,師 帥,魏娜敏,張安晶,胡元會(huì)(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)內(nèi)一科,北京 100026;通訊作者,E-mail:huiyuhui55@sohu.com)

心血管疾病已成為我國居民健康的頭號(hào)威脅,其中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性疾病居于心源性致死疾病的前列[1]。其中,動(dòng)脈粥樣硬化所誘發(fā)的冠心病、缺血性腦卒中和外周血管疾病危害極大[2],給社會(huì)、患者及其家庭均帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和難以估量的損失。因此,推進(jìn)動(dòng)脈粥樣防治藥物的研發(fā)和藥理研究,有著積極而深遠(yuǎn)的意義。

中醫(yī)典籍中并無動(dòng)脈粥樣硬化的記載,但根據(jù)臨床實(shí)踐的觀察和總結(jié),動(dòng)脈粥樣硬化性臨證特點(diǎn)散布于我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“胸痹”“真心痛”“中風(fēng)”等的癥狀表現(xiàn)中,與中醫(yī)“痰、瘀”等病理產(chǎn)物所導(dǎo)致的證候特點(diǎn)高度吻合[3]。騏龍血脈健方為胡元會(huì)教授依據(jù)多年臨床實(shí)踐創(chuàng)制的方劑,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的療效確切[4]。本研究通過復(fù)制ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(AS)模型,探討騏龍血脈健方對(duì)血脂代謝、動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥材

騏龍血脈健方:由黃連、法半夏、瓜蔞、乳香、沒藥、絞股藍(lán)等中藥顆粒組成,購自四川綠色藥業(yè)公司。阿托伐他汀鈣片(立普妥,20 mg/片×7片/盒,輝瑞制藥)。

1.2 動(dòng)物與飼料

選取SPF級(jí)8周齡雄性C57BL/6J小鼠8只、ApoE-/-小鼠40只,購自北京維通利華公司,許可證SCXK(京)2016-0006,于北京廣安門醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)。以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飲食飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠;用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)C57BL/6J野生型小鼠。本實(shí)驗(yàn)中所有動(dòng)物飼養(yǎng)及操作均嚴(yán)格遵守國家動(dòng)物福利倫理及保護(hù)規(guī)定。

1.3 主要設(shè)備與器械

MSE125P-1CE-DU精密電子分析天平(Sartorius,Germany)、低溫高速離心機(jī)(Sigma,Germany)、IX70顯微鏡(Olympus,Japan)、AU5822全自動(dòng)生化儀(Beckman,USA)、Milli-Q mini-sub cell GT電泳槽(BIO-RAD,USA)、Chemi DOC NP凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD,USA)、Navios多功能酶標(biāo)儀(雷杜,China)。

1.4 主要試劑

油紅O試劑盒(Sigma,USA,MAK194)、Anti-CD36抗體(abcam,England,ab133625)、Ox-LDL ELISA Kit(武漢華美生物,China,CSB-E07933m)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

1.5.1 分組及模型構(gòu)建 將40只8周齡雄性ApoE-/-小鼠按隨機(jī)數(shù)表法進(jìn)行隨機(jī)分組:模型組、阿托伐組、騏龍血脈健方大、中、小劑量組,每組8只,均給予含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飲食飼料,連續(xù)喂養(yǎng)14周,以構(gòu)建小鼠高脂血癥模型。另選取8只8周齡雄性C57BL/6J小鼠作為空白組,給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.5.2 給藥方式 將顆粒劑騏龍血脈健方研磨后用生理鹽水配制成中藥混懸液,現(xiàn)用現(xiàn)配,配好后于4 ℃冰箱保存。將阿托伐他汀鈣片研磨后用生理鹽水配制成阿托伐他汀鈣溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配,配好后于4 ℃冰箱保存。正常對(duì)照組和模型組予生理鹽水灌胃,阿托伐他汀鈣組給予阿托伐他汀鈣溶液灌胃,騏龍血脈健方顆粒劑不同劑量組分別給予大、中、小相應(yīng)劑量中藥混懸液灌胃。具體安排如下:①正常組及模型組按照每天0.1 ml/10 g體質(zhì)量予小鼠氯化鈉注射液(0.009 g/ml);②阿托伐組按照每天0.1 ml/10 g體質(zhì)量予小鼠阿托伐他汀鈣溶液(0.300 3 mg/ml);③騏龍血脈健方大劑量組以臨床用量20倍(36.04 g/ml)、中劑量組以臨床用量10倍(18.02 g/ml)、小劑量組以臨床用量5倍(9.01 g/ml)配置溶液,按照每天0.1 ml/10 g體質(zhì)量來灌胃。共灌胃14周,每日一次,本實(shí)驗(yàn)的用藥量根據(jù)每周實(shí)測(cè)體質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整。

1.5.3 取材及處理 所有動(dòng)物在最后一次灌胃結(jié)束空腹12 h后取材。①通過摘眼球方式取血,保存于采血管中,離心(3 000 r/min,4 ℃,10 min)獲得血清和血漿,放-80 ℃冰箱長期存儲(chǔ)。②采用頸椎脫臼法處死小鼠后,沿腹中線剪開皮膚及薄膜,剪開胸腔去除各個(gè)器官,使用注射器將生理鹽水從小鼠心尖部刺入左心室進(jìn)行沖洗。仔細(xì)分離開主動(dòng)脈周圍包繞的脂肪組織直至完整暴露,隨后將主動(dòng)脈束小心剝離下來,放于凍存管中,液氮快速冷凍后存入-80 ℃冰箱。

1.6 血脂、Ox-LDL水平及主動(dòng)脈CD36蛋白表達(dá)檢測(cè)

在喂養(yǎng)14周結(jié)束后進(jìn)行取血,用生化儀檢測(cè)各組小鼠血清甘油三脂(triglyceride,TG)、血清總膽固醇(total serum cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)。ELISA法測(cè)定血清氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)濃度[5]。Western blot檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈CD36蛋白表達(dá)[6]。

1.7 斑塊面積檢測(cè)

主動(dòng)脈經(jīng)油紅O染色,檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)脂質(zhì)沉積及斑塊面積,測(cè)量主動(dòng)脈斑塊面積和管腔面積,計(jì)算斑塊面積與管腔面積之比。主動(dòng)脈HE染色切片,觀察主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)的病理變化。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 騏龍血脈健方對(duì)血脂的影響

14周結(jié)束時(shí),與空白組比較,模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高(P<0.01,見表1)。與模型組比較,阿托伐組小鼠TC、TG、LDL-C均顯著降低(P<0.01),騏龍血脈健方大劑量組TC、TG、LDL-C均顯著降低(P<0.01),騏龍血脈健方中劑量組和騏龍血脈健方小劑量組小鼠血清TC顯著降低(P<0.01)。與阿托伐組比較,大劑量組TC、LDL-C水平顯著降低(P<0.05),而TG水平升高(P<0.05),中、小劑量組TC水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05,見表1)。各組間比較HDL-C水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠血脂水平

2.2 動(dòng)脈硬化斑塊面積/內(nèi)膜總面積情況

油紅O特異性地將組織和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)以及脂蛋白等染色,呈紅色部位為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(見圖1)。與空白組相比,模型組小鼠動(dòng)脈硬化斑塊面積與內(nèi)膜總面積比值顯著增加(P<0.05);與模型組比較,阿托伐組和騏龍血脈健方大劑量組動(dòng)脈硬化斑塊面積與內(nèi)膜總面積比值顯著降低(P<0.05);騏龍血脈健大劑量組與阿托伐組動(dòng)脈硬化斑塊面積與內(nèi)膜總面積比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化情況Figure 1 Aortic atherosclerosis of mice in each group

與空白組相比較,##P<0.01;與模型組相比較,**P<0.01圖2 各組小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊面積/內(nèi)膜總面積情況比較Figure 2 Comparison of atherosclerotic plaque area/total aortic intima area in mice between groups

2.3 主動(dòng)脈橫截面HE染色

空白組血管平滑肌形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,各層分界清晰,內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整,未見炎癥及AS斑塊形成;模型組血管內(nèi)膜增厚,管腔內(nèi)出現(xiàn)AS斑塊,血管平滑肌形態(tài)異常,結(jié)構(gòu)紊亂,排列散亂,可見散在泡沫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞;阿托伐組和騏龍血脈健方大劑量組血管平滑肌形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整,分界清晰,可見少量脫落細(xì)胞;騏龍血脈健方中劑量組血管平滑肌形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,管壁可見散在泡沫細(xì)胞浸潤。騏龍血脈健方小劑量組血管內(nèi)膜明顯增厚,管腔內(nèi)可見散在AS斑塊,血管平滑肌結(jié)構(gòu)紊亂,可見散在泡沫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞(見圖3)。

2.4 騏龍血脈健方對(duì)ApoE-/-小鼠血清Ox-LDL的影響

與空白組相比,模型組的Ox-LDL明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,騏龍血脈健方大劑量組血清Ox-LDL含量顯著下降(P<0.01),阿托伐組和騏龍血脈健方中劑量組血清Ox-LDL含量也明顯減少(P<0.05),騏龍血脈健方小劑量組血清Ox-LDL含量無明顯變化(P>0.05)。騏龍血脈健大、中劑量組Ox-LDL水平與阿托伐組比較無顯著差異(P>0.05),大劑量組與中劑量組Ox-LDL水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,見圖4)。

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈切片HE染色情況 (×10)Figure 3 HE staining of aortic sections of mice in each group (×10)

與空白組相比較,##P<0.01;與模型組相比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 各組小鼠血清Ox-LDL含量Figure 4 Serum Ox-LDL content in mice in each group

2.5 對(duì)主動(dòng)脈CD36蛋白表達(dá)影響

與空白組相比,模型組主動(dòng)脈中CD36蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與模型組相比,阿托伐組的CD36蛋白表達(dá)量有所減少(P<0.05),騏龍血脈健方大劑量組CD36蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.01,見圖5)。騏龍血脈健大劑量組主動(dòng)脈CD36蛋白表達(dá)與阿托伐組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,見圖5)。

3 討論

隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的提高,心腦血管疾病呈現(xiàn)高發(fā)趨勢(shì)[7],而動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的元兇,是多種心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素和病理基礎(chǔ)。中醫(yī)典籍中無動(dòng)脈粥樣硬化的論述,根據(jù)臨床疾病的證候特點(diǎn),其散布于“胸痹、真心痛、中風(fēng)”等疾病的范疇,其病機(jī)的要點(diǎn)主要為“痰、瘀、虛”等。其中痰瘀互結(jié)證在諸多證候中占據(jù)最大的比重[8],是心腦血管疾病的主要證素[3]。

騏龍血脈健方是胡元會(huì)教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié),是治療以痰瘀互結(jié)型高血壓、冠心病及腦血管疾病的常用方劑。其中黃連、半夏、瓜蔞為傷寒論經(jīng)典名方小陷胸湯,乳香、沒藥、血竭為活血化瘀之品,絞股藍(lán)、茯苓益氣健脾杜絕生痰之源。研究證實(shí),黃連能夠降低心肌耗氧量、改善心肌缺血,半夏能夠治療心律失常,瓜蔞能夠降脂、化痰,三藥合用起到滌痰活血、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[9]。乳香、沒藥、血竭能夠抗血小板活化[10]、改善血液流變學(xué)[11]。而絞股藍(lán)降脂、抗氧化的作用早已被國內(nèi)外研究證實(shí)[12,13]。茯苓健脾利濕、寧心安神的作用能夠有效改善AS患者心悸失眠等癥狀。

與空白組相比較,##P<0.01;與模型組相比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 各組小鼠主動(dòng)脈CD36蛋白表達(dá)Figure 5 The expression of CD36 protein in the aorta of mice in each group

動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制有多種,其中Ox-LDL是最重要的致動(dòng)脈硬化因子,它通過介導(dǎo)內(nèi)皮損傷和參與泡沫細(xì)胞的形成來加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程[14]。CD36廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板等多種細(xì)胞表面,可與多種配體結(jié)合,介導(dǎo)先天性免疫、血栓形成、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化等不同的生物過程。作為B族清道夫受體(SR-B)中的主要亞型之一,CD36能夠無限制地?cái)z取Ox-LDL[15,16],加速泡沫細(xì)胞形成及脂質(zhì)沉積,形成最早的動(dòng)脈粥樣病變。而巨噬細(xì)胞通過CD36攝取Ox-LDL,并激活過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(PPARγ)在轉(zhuǎn)錄水平上活化PPARγ,從而形成一個(gè)正反饋增加CD36的表達(dá),誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成并釋放促炎細(xì)胞因子、活性氧(ROS)和金屬蛋白酶,擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[17]。

本研究結(jié)果顯示,騏龍血脈健方能夠有效降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積,改善TC、TG、LDL-C水平。與模型組相比,阿托伐組與騏龍血脈健方大劑量組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著降低(P<0.05);與阿托伐組相比,騏龍血脈健大劑量組斑塊面積與內(nèi)膜總面積比值無明顯變化(P>0.05)。與模型組相比,阿托伐組、騏龍血脈健方大、中、小劑量組ApoE-/-小鼠TC水平均顯著降低(P<0.01);阿托伐組和騏龍血脈健方大劑量組TG、LDL-C水平與模型組相比亦明顯降低(P<0.01),而騏龍血脈健方中、小劑量組TG、LDL-C水平與模型組無明顯差異(P>0.05),其中騏龍血脈健大劑量組在TC、LDL-L水平方面降低幅度優(yōu)于阿托伐組。結(jié)果表明,騏龍血脈健方大劑量組與阿托伐組動(dòng)脈粥樣硬化程度無明顯差異,部分血脂指標(biāo)降低情況不遜于甚至優(yōu)于阿托伐他汀組,表明騏龍血脈健方在達(dá)到一定劑量水平時(shí)在降脂、改善動(dòng)脈硬化方面療效確切。

本研究顯示,與模型組相比,阿托伐組、騏龍血脈健方大劑量組和中劑量組Ox-LDL水平均有所下降(P<0.05),而以騏龍血脈健方大劑量組Ox-LDL水平下降最明顯(P<0.01)。與模型組相比,阿托伐組和騏龍血脈健方大劑量組主動(dòng)脈CD36蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。而騏龍血脈健方大劑量組降低Ox-LDL水平和CD36蛋白表達(dá)方面效果與阿托伐組無顯著差異(P>0.05)。

有研究表明,活血化瘀藥物能夠有效降低動(dòng)脈粥樣硬化模型血脂水平和主動(dòng)脈Ox-LDL表達(dá)[18],而活血化痰中藥合理配伍使用對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷有保護(hù)作用[19]。不同研究表明,活血化瘀中藥對(duì)CD36表達(dá)呈下調(diào)作用[20,21],抑制泡沫細(xì)胞的形成,延緩動(dòng)脈硬化的進(jìn)展。本研究結(jié)果證實(shí)了騏龍血脈健方調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠血脂水平和抗動(dòng)脈粥樣硬化的效果,并提示騏龍血脈健方可能通過降低血清Ox-LDL水平、下調(diào)主動(dòng)脈CD36蛋白表達(dá),抑制泡沫細(xì)胞形成,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展速度的作用機(jī)制,為中醫(yī)藥治療動(dòng)脈粥樣硬化的研究提供了一定的參考。