韓馨蕊，李朝蕊，范 鑫，李保玲，曹云剛,*，熊幼翎*

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.肯塔基大學(xué)動(dòng)物與食品科學(xué)系，美國(guó) 肯塔基 列克星頓 40546）

肉制品加工業(yè)是我國(guó)食品加工業(yè)的重要組成部分。原料肉的保藏方法有很多，冷凍是目前應(yīng)用最廣、效果最好、最經(jīng)濟(jì)、最安全的保藏方法[1]。肉經(jīng)冷凍處理可以抑制肉中微生物的生長(zhǎng)、鈍化酶的活性、減少脂肪及蛋白的氧化[2-3]。然而冷凍會(huì)因大冰晶的形成破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子原有的高級(jí)空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，因而長(zhǎng)期冷凍儲(chǔ)藏原料肉的一個(gè)顯著變化為其主要功能性蛋白——肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）的損傷變性，主要表現(xiàn)為溶解度及凝膠性能下降，最終影響產(chǎn)品品質(zhì)及得率[4-6]。現(xiàn)有研究主要是通過革新冷凍及解凍方法或添加抗凍劑等手段降低原料肉由于冷凍解凍等過程導(dǎo)致的蛋白損傷，但存在效果有限或者由于技術(shù)不成熟、成本高昂等原因尚不能大范圍應(yīng)用推廣等實(shí)際問題。實(shí)際情況是作為企業(yè)主要加工原料的冷凍肉很大一部分已經(jīng)發(fā)生了冷凍損傷。因此，有效修復(fù)已損傷蛋白的功能特性具有非常重要的理論與應(yīng)用價(jià)值。

賴氨酸（L-lysine，L-Lys）是一種堿性氨基酸，廣泛存在于豆類植物和酪蛋白等蛋白的水解物中，具有安全性高、成本低等特點(diǎn)，在肉制品加工領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。Fu Yuan等[7]研究發(fā)現(xiàn)L-Lys的添加可以改變肌球蛋白分子粒徑及分布以及凝膠分子間作用力，從而影響凝膠的持水性和硬度。Lei Zhen等[8]研究發(fā)現(xiàn)添加L-Lys增加了雞胸肉肌動(dòng)球蛋白表面疏水殘基和活性巰基的數(shù)量，進(jìn)而提高了凝膠硬度及持水性。Wang Yaosong等[9]研究發(fā)現(xiàn)添加L-Lys可以促進(jìn)乳清蛋白形成均一、多孔的熱誘導(dǎo)凝膠。Gao Ruichang等[10]研究發(fā)現(xiàn)添加L-His能顯著提高天然肌球蛋白在低/高離子強(qiáng)度溶液中的溶解度。Zhou Cunliu等[11]發(fā)現(xiàn)，添加L-Lys使得豬肉腸具有更好的色澤，并且提高了其持水性和質(zhì)構(gòu)特性（硬度、彈性、咀嚼性）。基于以上研究，推測(cè)添加L-Lys有望改善冷凍損傷MP的溶解度和凝膠性能，但相關(guān)研究鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建反復(fù)凍融體系獲得冷凍損傷原料肉，提取冷凍損傷MP后，研究不同濃度L-Lys（0、1、3、5 mmol/L和10 mmol/L）對(duì)冷凍損傷MP結(jié)構(gòu)、溶解度、流變學(xué)特性、凝膠質(zhì)構(gòu)及微觀結(jié)構(gòu)的影響及其內(nèi)在機(jī)制，以期為L(zhǎng)-Lys作為品質(zhì)改良劑在肉制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬外脊肉（longissimus lumborum），購(gòu)于陜西西安市未央?yún)^(qū)潤(rùn)家超市，置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剔除可見脂肪組織后，垂直于肌纖維走向切成100 g左右的肉排，采用聚乙烯袋真空包裝，備用。

L-Lys 源葉生物科技有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid，EGTA） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；UV2900紫外-可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TA.Plus物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro System公司；Fluoro Max-4熒光分光光度計(jì)日本Horiba公司；CM-5分光測(cè)色計(jì) 柯尼卡美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀 英國(guó)Malvern Instruments有限公司；Haake-Mars 60流變儀、DXR2顯微共聚焦拉曼光譜儀 德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；FEI Q45+EDAX Octane Prime環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司；圓二色光譜儀 英國(guó)Applied Photophysics公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍損傷原料肉的制備

參照Xia Xiufang等[12]的方法進(jìn)行冷凍損傷原料肉的處理：將分裝好的新鮮原料肉隨機(jī)分為兩組；一組置于-18 ℃的冰箱作為空白進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定；另一組進(jìn)行冷凍-解凍循環(huán)處理：將新鮮肉置于-18 ℃冷凍，3 d后取出，在室溫下用自來(lái)水進(jìn)行解凍直到肉樣中心溫度達(dá)到0～2 ℃后，即完成第1次冷凍-解凍過程，重復(fù)上述步驟3 次后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 MP的提取

參照Park等[13]的方法進(jìn)行。將不同處理樣品肉在流水下進(jìn)行解凍后，用刀切成若干小條稱量，放置于組織搗碎機(jī)中，加入4 倍體積的僵直液（0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Na2HPO4、1 mmol/L EGTA，pH 7.0），進(jìn)行勻漿搗碎（15 s，4 次），4 ℃、2 000×g離心15 min后棄上清液，所得沉淀再次加入4 倍體積的僵直液，重復(fù)上述步驟共3 次。所得沉淀加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，攪拌均勻后經(jīng)4 層紗布過濾，使用0.1 mol/L HCl溶液將濾液的pH值調(diào)至6.2，離心后所得沉淀即為MP。整個(gè)提取過程保持在0～4 ℃，將所得蛋白置于離心杯中，保存于碎冰中，并保證在48 h內(nèi)使用。蛋白濃度采用雙縮脲法測(cè)定。

1.3.3 MP-賴氨酸混合體系的制備

使用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.4 mol/L NaCl，pH 6.2）將冷凍損傷MP蛋白膏稀釋為40 mg/mL，分別加入不同量的L-Lys，用上述緩沖液對(duì)體系進(jìn)行稀釋，使得最終體系中蛋白質(zhì)量濃度為30 mg/mL，L-Lys濃度分別為0、1、3、5、10 mmol/L，用玻璃棒輕輕攪拌均勻，將樣品4 ℃放置12 h。同時(shí)設(shè)置未冷凍損傷（不添加L-Lys）樣品為空白對(duì)照。

1.3.4 圓二色譜測(cè)定

使用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.4 mol/L NaCl，pH 6.2）將MP樣品稀釋至0.2 mg/mL，以120 nm/min的掃描速率從200 nm掃描到260 nm，累計(jì)掃描3 次取其平均值并扣除緩沖液背景，使用CDNN軟件計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.5 內(nèi)源性色氨酸熒光測(cè)定

使用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.4 mol/L NaCl，pH 6.2）將MP樣品稀釋為0.4 mg/mL，以283 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)利用Fluoro Max-4熒光分光光度計(jì)記錄290～400 nm的發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為1.5 nm。相同條件下記錄樣品緩沖液發(fā)射光譜，并從樣品發(fā)射光譜中扣除以排除干擾。

1.3.6 粒度測(cè)定

在25 ℃使用Mastersizer 2000激光粒度分析儀采用靜態(tài)光散射法對(duì)不同處理的MP樣品的平均粒徑進(jìn)行分析，將稀釋后的MP樣品（2 mg/mL）分散在蒸餾水（分散介質(zhì)）中，直至遮光效果達(dá)到10%～13%，以避免多次散射。設(shè)置MP顆粒折射率為1.570，分散劑折射率為1.330，吸收指數(shù)為0.001，重復(fù)測(cè)定3 次取其平均值。

1.3.7 溶解度的測(cè)定

使用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.4 mol/L NaCl，pH 6.2）將MP樣品稀釋至2 mg/mL，在5 000×g離心15 min，采用雙縮脲法測(cè)定上清液的蛋白含量，溶解度計(jì)算如下式所示：

1.3.8 流變學(xué)性能的測(cè)定

根據(jù)Li Chuangqiang等[14]的方法進(jìn)行動(dòng)態(tài)流變學(xué)的測(cè)定。將樣品混合物置于塑料離心管中4 ℃、1 000×g離心1 min，脫氣后，置于間距為1 mm的流變儀平板之間，下壓后輕輕拭去平板周圍多余的樣品，用硅油進(jìn)行密封，防止加熱過程中水分蒸發(fā)，平衡2 min后，在振蕩模式下使樣品以1 ℃/min的升溫速率從20 ℃加熱至75 ℃進(jìn)行凝膠化。振蕩頻率設(shè)置為0.1 Hz，最大應(yīng)變?yōu)?.02。記錄實(shí)驗(yàn)中的彈性模量G’作為流變性能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3.9 MP熱誘導(dǎo)凝膠的制備

準(zhǔn)確稱取5 g脫氣后的MP樣品（30 mg/mL）于玻璃瓶中，封口后置于水浴鍋中以1 ℃/min的升溫速率從20 ℃加熱至75 ℃，并在75 ℃保溫10 min，取出后立刻置于冰水混合物中冷卻30 min，隨后放入4 ℃冰箱冷藏過夜。在測(cè)定MP樣品凝膠性能之前，需將樣品提前取出在室溫條件下平衡2 h[15]。

1.3.10 蒸煮損失率的測(cè)定

用小鏟輕輕將凝膠與瓶壁剝離，并倒扣于濾紙上，靜置20 min，使其蒸煮汁液流盡之后，對(duì)凝膠進(jìn)行稱量[16]。蒸煮損失率計(jì)算公式如下：

1.3.11 MP凝膠質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

采用TPA質(zhì)構(gòu)分析法[17]，測(cè)定凝膠的硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復(fù)性等指標(biāo)。使用小鏟子輕輕將凝膠與小玻璃瓶壁剝離，將凝膠取出放置于平板上進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定。測(cè)定參數(shù)設(shè)置如下：測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速率均為2 mm/s；下壓百分比30%；兩次下壓時(shí)間間隔5 s；探頭型號(hào)P/75；觸發(fā)力10 g。

1.3.12 MP凝膠白度的測(cè)定

參照Xia Xiufang等[3]方法，分光測(cè)色計(jì)經(jīng)自檢及零點(diǎn)、白板校正后，進(jìn)行樣品測(cè)定。每個(gè)樣品3 組平行，取平均值。凝膠白度值W按下式計(jì)算：

式中：L*為亮度值；a*為紅度值（正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠）；b*為黃度值（正值表示偏黃，負(fù)值表示偏藍(lán)）。

1.3.13 MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)表征

參照Cao Yungang等[18]的方法并略作修改。將MP凝膠樣品切成小方塊后使用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）固定4 h，使用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次，然后通過一系列體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（50%、70%、90%、95%、100%）進(jìn)行梯度脫水，用叔丁醇置換3 次，每次30 min。對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干燥后噴金，然后使用掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓為2.0 kV，放大倍數(shù)為5 000。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用Statistical 9.0分析軟件通用線性模型程序（Analytical software，Tallahassee，F(xiàn)L，USA）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。采用LSD全配對(duì)多重比較方法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，并使用SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-Lys濃度對(duì)冷凍損傷MP結(jié)構(gòu)的影響

不同處理MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化使用圓二色譜儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1a所示。未經(jīng)反復(fù)凍融處理MP的CD圖譜在208、222 nm處有兩個(gè)負(fù)峰，表明MP中α-螺旋相對(duì)含量較高[19]。經(jīng)反復(fù)凍融處理后這2個(gè)峰的大小顯著降低，說(shuō)明反復(fù)凍融處理導(dǎo)致MP的α-螺旋相對(duì)含量下降，這可能是由于肌球蛋白尾部的α-超螺旋結(jié)構(gòu)解旋[20]，二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算結(jié)果顯示，α-螺旋相對(duì)含量下降伴隨著β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的顯著上升（圖1b）。L-Lys添加顯著改變了冷凍損傷MP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，添加1、3、5、10 mmol/LL-Lys使得冷凍損傷MP的α-螺旋相對(duì)含量分別提高10.2%、11.5%、10.8%和10.6%，添加L-Lys使得冷凍損傷MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成比例接近于未經(jīng)反復(fù)凍融處理組（圖1b）。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由氫鍵維系，L-Lys含有的羧基（—COOH）及氨基（—NH2）可能破壞了原有的氫鍵，并誘導(dǎo)新的氫鍵形成，從而引起蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

蛋白質(zhì)內(nèi)源性色氨酸熒光對(duì)于其周邊微環(huán)境的極性非常敏感，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時(shí)，色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)核這樣的疏水環(huán)境中，此時(shí)被激發(fā)的色氨酸具有相對(duì)較高的熒光強(qiáng)度；而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)部分或完全展開時(shí)，色氨酸殘基就會(huì)更多的暴露于蛋白質(zhì)分子表面，此時(shí)被激發(fā)的色氨酸熒光強(qiáng)度降低。因此，內(nèi)源性色氨酸熒光特性經(jīng)常被用于反映蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[15]。如圖1c所示，經(jīng)反復(fù)凍融后MP的熒光強(qiáng)度顯著下降，表明蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開。反復(fù)凍融破壞了MP天然的排列方式，蛋白展開變性使得原本位于內(nèi)部的色氨酸殘基暴露于表面而處于溶劑的極性環(huán)境中，從而引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降。L-Lys添加顯著改變了冷凍損傷MP的內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度，當(dāng)L-Lys添加量為1、3 mmol/L時(shí)，冷凍損傷MP的熒光強(qiáng)度顯著上升，接近于未經(jīng)反復(fù)凍融處理MP的熒光強(qiáng)度；當(dāng)L-Lys添加量為5 mmol/L時(shí)反而促使熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低；當(dāng)L-Lys添加量為10 mmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度略微上升但變化不顯著。一方面L-Lys的添加會(huì)引起氫鍵重排導(dǎo)致蛋白構(gòu)象的變化，另一方面作為生物小分子物質(zhì)L-Lys可能與MP中色氨酸殘基靜態(tài)結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅效應(yīng)，因此不同濃度L-Lys對(duì)冷凍損傷MP熒光強(qiáng)度的影響是二者綜合作用的結(jié)果。

圖1 L-Lys濃度對(duì)MP溶液二級(jí)結(jié)構(gòu)（a、b）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（c）的影響Fig. 1 Effect of L-Lys concentration on secondary structure (a, b) and tertiary structure (c) of MP solution

2.2 L-Lys濃度對(duì)冷凍損傷MP粒度的影響

蛋白質(zhì)的粒度是影響蛋白質(zhì)功能特性的因素之一[21]，也是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的宏觀表現(xiàn)。粒徑反映可溶性蛋白的粒度分布和聚集情況[22]。如圖2所示，與未經(jīng)反復(fù)凍融MP相比，經(jīng)反復(fù)凍融MP的表面積平均粒徑d（3,2）和體積平均粒徑d（4,3）分別增加了4.841 μm和17.427 μm。這是由于反復(fù)凍融誘導(dǎo)MP結(jié)構(gòu)展開，使得MP分子間S—S形成及疏水相互作用增強(qiáng)、蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集加劇、導(dǎo)致MP的平均粒徑增大[23-24]。不同濃度L-Lys處理對(duì)反復(fù)凍融MP的d（3,2）和d（4,3）產(chǎn)生了顯著的影響，整體來(lái)看L-Lys處理傾向于降低冷凍損傷MP的粒徑，且L-Lys濃度越大效果越好。與本研究結(jié)果類似，F(xiàn)u Yuan等[7]在不同pH值處理?xiàng)l件下研究發(fā)現(xiàn)L-Lys和L-Arg的添加引起MP粒徑減小。而馬文慧等[25]研究發(fā)現(xiàn)在氧化條件下添加L-Arg引起MP粒徑增大。不一致的研究結(jié)果表明堿性氨基酸對(duì)MP粒徑的影響可能受原料肉、離子強(qiáng)度、氧化或冷凍處理等多種因素的影響。

圖2 L-Lys濃度對(duì)MP粒度的影響Fig. 2 Effect of L-Lys concentration on MP particle size

2.3 L-Lys濃度對(duì)冷凍損傷MP溶解度的影響

溶解度反映了蛋白分子間以及蛋白與水分子之間相互作用力的變化，能夠間接反映出蛋白質(zhì)變性和聚集情況[26-27]。如圖3所示，未經(jīng)反復(fù)凍融的MP樣品的溶解度為61.10%，反復(fù)凍融導(dǎo)致MP的溶解度下降至41.61%（P＜0.05）。這與Srikar等[28]報(bào)道的粉紅鱸魚蛋白在冷凍過程中溶解度下降的結(jié)果基本一致，這是因?yàn)槔鋬鰧?dǎo)致蛋白發(fā)生變性，蛋白分子間二硫鍵及疏水相互作用增強(qiáng)，蛋白-蛋白交聯(lián)形成聚集體[29]。不同濃度L-Lys處理對(duì)反復(fù)凍融MP的溶解度產(chǎn)生顯著影響。添加1、3、5、10 mmol/LL-Lys使得反復(fù)凍融MP的溶解度分別增加至42.66%、50.66%、69.10%和64.93%，從整體來(lái)看，說(shuō)明L-Lys對(duì)于MP的增溶作用隨著L-Lys濃度的升高而增強(qiáng)。Guo等[30]也發(fā)現(xiàn)L-Lys能夠顯著提高豬肌球蛋白的溶解度。

圖3 L-Lys濃度對(duì)MP溶解度的影響Fig. 3 Effect of L-Lys concentration on MP solubility

2.4 L-Lys濃度對(duì)冷凍損傷MP流變學(xué)性能的影響

儲(chǔ)能模量G’反映蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)屬性，同時(shí)與凝膠強(qiáng)度聯(lián)系密切[31]。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)反復(fù)凍融的MP樣品的G’在45～56 ℃顯著上升，這是因?yàn)榧∏虻鞍最^部開始發(fā)生變性聚合，肌球蛋白溶液開始逐漸由于熱變性而形成結(jié)構(gòu)較為疏松的凝膠；56～62 ℃急劇下降，這是由于肌球蛋白的尾部展開破壞了已形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；在最后的加熱過程中（62～75 ℃）G’隨溫度升高持續(xù)上升，說(shuō)明蛋白質(zhì)進(jìn)一步發(fā)生交聯(lián)聚集，最終形成了永久性、不可逆的、更強(qiáng)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[17]。與未經(jīng)反復(fù)凍融樣品相比，冷凍損傷MP的G’值在整個(gè)熱誘導(dǎo)成膠過程中均較低，說(shuō)明反復(fù)凍融降低了MP的凝膠性能（包括肌球蛋白頭部交聯(lián)和尾部交聯(lián)）。L-Lys的添加并不能提高熱誘導(dǎo)凝膠過程中冷凍損傷MP的G’，相反會(huì)促進(jìn)G’的損失，且L-Lys濃度越高M(jìn)P的G’越低。這可能是由于L-Lys的存在抑制了加熱過程中肌球蛋白結(jié)構(gòu)的展開和交聯(lián)，阻礙了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[32]。

圖4 L-Lys濃度對(duì)MP流變學(xué)性能的影響Fig. 4 Effect of L-Lys concentration on rheological properties of MP

2.5 L-Lys濃度對(duì)冷凍損傷MP凝膠蒸煮損失及白度的影響

如圖5所示，未經(jīng)反復(fù)凍融MP熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失率為12.65%，經(jīng)反復(fù)凍融處理并未引起MP熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失率（12.76%）的顯著變化，與本研究結(jié)果一致，Jittinandana等[33]研究15 次反復(fù)凍融并未引起鱒（Squaliobarbus ourriculus）蒸煮損失的顯著變化。而Xia Xiufang等[12]發(fā)現(xiàn)豬MP凝膠蒸煮損失隨著反復(fù)凍融次數(shù)的增加而增加，這可能是由于反復(fù)凍融導(dǎo)致肌球蛋白變性增加，也可能是由于反復(fù)凍融破壞了肌纖維的結(jié)構(gòu)使得蛋白形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)能力減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致可能與肉的種類、實(shí)驗(yàn)條件等不同有關(guān)。L-Lys添加顯著降低了MP凝膠的蒸煮損失，且隨著L-Lys濃度的增加蒸煮損失顯著降低（P＜0.05）。

如圖5所示，未經(jīng)反復(fù)凍融的MP凝膠白度為67.314，經(jīng)反復(fù)凍融處理導(dǎo)致MP凝膠白度值下降，這可能與冷凍導(dǎo)致的脂肪和蛋白氧化以及色素變化等因素有關(guān)[17]。反復(fù)凍融MP凝膠白度值隨著L-Lys濃度的增加而降低，這可能是由于實(shí)驗(yàn)所用L-Lys自身略帶顏色。

圖5 L-Lys濃度對(duì)MP凝膠性能的影響Fig. 5 Effect of L-Lys concentration on gel properties of MP

2.6 L-Lys濃度對(duì)冷凍損傷MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

如表1所示，與未經(jīng)反復(fù)凍融MP相比，反復(fù)凍融處理導(dǎo)致MP樣品的硬度下降了3.011 g。這與陳金玉等[34]研究發(fā)現(xiàn)蝦蛄MP的熱誘導(dǎo)凝膠強(qiáng)度隨著凍融次數(shù)的增加顯著下降一致。添加L-Lys導(dǎo)致冷凍損傷MP樣品的凝膠強(qiáng)度明顯降低，且MP凝膠的強(qiáng)度隨著L-Lys添加量的增加而逐漸降低（P＜0.05），這與流變測(cè)定結(jié)果一致。與本研究結(jié)果一致，付淵[32]研究發(fā)現(xiàn)L-Lys添加到雞胸肉肌球蛋白凝膠中會(huì)導(dǎo)致凝膠硬度下降，并且隨著L-Lys濃度的增加而降低。而雷振[35]發(fā)現(xiàn)添加L-Lys能夠明顯提高雞肉肌動(dòng)球蛋白凝膠硬度，這可能與肉的種類的不同有關(guān)。

表1 L-Lys濃度對(duì)MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effect of L-Lys concentration on the texture of MP gel

與未經(jīng)反復(fù)凍融MP凝膠相比，冷凍損傷MP凝膠的彈性、內(nèi)聚性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)性均有所上升。當(dāng)L-Lys濃度為1 mmol/L時(shí)，全面提高了冷凍損傷MP凝膠的彈性、內(nèi)聚性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)性；當(dāng)濃度為3、5 mmol/L時(shí)，對(duì)冷凍損傷MP凝膠的上述質(zhì)構(gòu)特性影響不大；當(dāng)濃度為10 mmol/L時(shí)，顯著降低了所有質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的數(shù)值（P＜0.05）。

2.7 L-Lys濃度對(duì)冷凍損傷MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

凝膠的微觀結(jié)構(gòu)與質(zhì)構(gòu)、保水和流變特性相關(guān)。由圖6可以看出，未經(jīng)反復(fù)凍融MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)連續(xù)、均勻、致密，而反復(fù)凍融MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)粗糙，孔徑大且不均勻。這也是冷凍損傷MP凝膠強(qiáng)度和蒸煮損失降低的原因。L-Lys添加對(duì)冷凍損傷MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的影響，隨著L-Lys濃度的增加，冷凍損傷MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的孔徑逐漸減小，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加致密均勻。Sun Jingxin等[36]研究發(fā)現(xiàn)均勻致密的凝膠結(jié)構(gòu)有利于凝膠基質(zhì)中水分的截留，這進(jìn)一步解釋了L-Lys添加顯著降低了蒸煮損失。

圖6 L-Lys濃度對(duì)MP微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Effect of L-Lys concentration on microstructure of MP

3 結(jié) 論

探究不同濃度L-Lys對(duì)反復(fù)凍融誘導(dǎo)的冷凍損傷MP結(jié)構(gòu)及凝膠性能的影響。結(jié)果表明：L-Lys添加改變了冷凍損傷MP的結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為α-螺旋相對(duì)含量和內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度上升，經(jīng)L-Lys處理的冷凍損傷MP蛋白結(jié)構(gòu)特性接近于未經(jīng)反復(fù)凍融MP的結(jié)構(gòu)特性。整體來(lái)看，隨著L-Lys濃度（1～10 mmol/L）的升高，冷凍損傷MP的溶解度逐漸升高，G’及凝膠強(qiáng)度逐漸降低，蒸煮損失逐漸減小，凝膠微觀結(jié)構(gòu)逐漸趨于致密均勻。因此，L-Lys添加能有效降低冷凍損傷MP的蒸煮損失和凝膠強(qiáng)度，這說(shuō)明添加L-Lys有望顯著提升冷凍原料肉制品的得率并改善其嫩度和多汁性。