林珮璇，張宏婧，陳繼承

（福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

美拉德反應是食品熱加工或長期貯藏后香氣和色澤至關重要的來源[1]。烷基吡嗪[2]作為揮發(fā)性美拉德反應產物其中一類獨特的風味物質，具有烤香、咖啡香、肉香、炒芝麻香、堅果香、花生香等強烈的芳香特征。烷基吡嗪既可單獨使用，也可與其他香氣產生疊加效果，使香味更加豐富多彩。對咖啡和面包等烘焙食品[3-4]，葵花籽油等糧油產品[5]，醋類、酒類和醬類等發(fā)酵制品[6-7]的風味品質評價都具有重要指導性意見。一直是香精香料學、食品加工工藝學、食品化學等領域研究熱點。

美拉德反應是羰基化合物和氨基化合物的反應，底物雖簡單但所涉及的生成路徑、反應產物復雜多樣并且受多種反應條件影響，機制復雜[8]。Zhao Jian[9]和Zhan Huan[10]等均認為反應溫度和時間是影響美拉德反應產生風味物質的重要因素。Scalone等[11]研究也發(fā)現反應pH值影響風味物質種類及含量。烷基吡嗪的形成與羰基化合物密切相關，但仍存在很大爭議[12-13]。Strecker降解是生成路徑之一[14-15]，Strecker降解涉及α-氨基羰基化合物的生成、縮合與氧化。α-氨基羰基化合物衍生自碳水化合物降解產生的二羰基化合物，在堿性、高溫等條件下與氨基酸結合生成[9,16-17]。α-氨基羰基化合物通過縮合反應生成二氫吡嗪，二氫吡嗪作為重要的中間產物發(fā)生自氧化反應或與羰基化合物反應生成吡嗪類化合物[11,18]。烷基吡嗪的形成已在各種反應體系中進行了模擬研究，但建立的反應體系大多數集中于以糖類化合物或具有相似結構的化合物為碳源。多項研究[19-23]均以抗壞血酸為主體，與不同氨基酸建立反應體系探究吡嗪等芳香化合物的生成影響，且表示吡嗪化合物的生成過程中氨基酸只提供氮源，對碳骨架沒有影響。Adams等[24]對吡嗪的生成探討也基于抗壞血酸和氨基酸反應體系。也有部分研究涉及肽類對吡嗪類化合物生成的影響，但碳源底物大多仍以糖類化合物為主[15,25-26]。在糖類化合物參與的美拉德反應中會有部分糖類化合物參與發(fā)生焦糖化反應[27]，焦糖化反應會引起褐變現象，而對風味貢獻較小。烷基吡嗪的生成途徑是從α-氨基酮開始，這是二羰基化合物與氨基酸通過Strecker降解縮合的產物[28-29]。在美拉德反應中二羰基化合物是烷基吡嗪生成的關鍵前體。Yu Ainong等[22-23]的研究也表示吡嗪芳香化合物的生成可能與L-抗壞血酸熱降解過程中產生的一系列活性中間體，如乙二醛、丙酮醛、羥基丁二酮和丁二酮等密切相關。但較少研究涉及建立以α-二羰基化合物為碳源底物的反應體系，同時關于烷基吡嗪生成動力學也缺少討論。另有研究指出乙偶姻是烷基吡嗪生成的重要前體物質之一，2,3-丁二酮（2,3-butanedione, 2,3-BD）又為乙偶姻的下游物質[30]。因此，本實驗選以2,3-BD為美拉德反應羰基化合物來源，構建丙氨酸（alanine，Ala）-2,3-BD反應體系，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法研究反應溫度、時間、pH值對烷基類吡嗪化合物生成規(guī)律的影響，并通過數學擬合構建動力學模型，確定烷基類吡嗪化合物的表觀活化能，以期為深入探討吡嗪類化合物反應機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 種標準化學品（≥99%）：2,3-二甲基吡嗪（2,3-dimethylpyrazine，2,3-DMP）、2,5-二甲基吡嗪（2,5-dimethylpyrazine，2,5-DMP）、2,6-二甲基吡嗪（2,6-dimethylpyrazine，2,6-DMP）、2,3,5-三甲基吡嗪（2,3,5-trimethylpyrazine，TriMP）、四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP）、乙基吡嗪（ethylpyrazines，EP）、2-乙基-3-甲基吡嗪（2-ethyl-3-methylpyrazine，EP-3-MP）和2-乙基-5-甲基吡嗪（2-ethyl-5-methylpyrazine，EP-5-MP） 上海源葉生物科技有限公司；Ala、2,3-BD、鹽酸、氫氧化鈉、Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜級） 德國默克公司；實驗用水是超純水，使用Millipore公司的Direct-Q UV 3系統(tǒng)（18.2 MΩ·cm）生產；所有化學藥品均為超純或分析純。

1.2 儀器與設備

FE28-standard pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；MX-S渦旋振蕩器 北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；水熱合成反應釜 上海秋佐科技有限公司；2695-2998 HPLC儀、XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 不同pH值磷酸鹽緩沖液的制備

0.2 mol/L Na2HPO4的制備：稱取71.628 0 g Na2HPO4·12H2O定容至1 000 mL容量瓶；0.2 mol/L NaH2PO4的制備：稱取31.200 0 g NaH2PO4·2H2O定容至1 000 mL容量瓶。其中0.2 mol/L NaH2PO4的pH 4.2，按照一定體積比進行均勻混合配制得pH值分別為5、6、7、8和9的磷酸鹽緩沖液（現配現用）。

1.3.2 體系反應液的制備

將Ala（1 mmol）溶解于10 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，通過0.1 mol/L NaOH溶液進行pH值調節(jié)。隨后2,3-BD（1 mmol）加入溶液中，充分渦旋混合液并密封于水熱合成反應釜中，置于鼓風干燥箱中反應。模型反應初始濃度為Ala∶2,3-BD=0.1 mol/L∶0.1 mol/L，每個樣品重復進行3 次。待反應結束，迅速冰浴冷卻終止反應，進行HPLC分析。

在反應溫度90 ℃、反應pH 9，考察反應時間（2、4、6、8、10 h和12 h）對Ala-2,3-BD反應體系生成烷基類吡嗪化合物的影響。

在反應時間4 h、反應pH 9，考察反應溫度（60、80、90、100 ℃和120 ℃）對Ala-2,3-BD反應體系生成烷基類吡嗪化合物的影響。

在反應時間2 h、反應溫度60 ℃條件下，考察pH值（4.2、5、6、7、8和9）對Ala-2,3-BD反應體系生成烷基類吡嗪化合物的影響。

1.3.3 HPLC分析

參考課題組前期方法[31]，并稍作改進。使用XBridge C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）進行色譜分離，將樣品（10 μL）注入HPLC系統(tǒng)。流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸和0.1%三氟乙酸混合溶液。流速設置為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為275 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program

1.3.4 動力學模型

通過線性或非線性方程擬合將動力學模型轉化為不同溫度下的數學模型，并根據回歸系數（R2）評估所建立模型的性能。根據零級和一級反應動力學的生成濃度（Ct，lnCt）相對于反應時間t（h）的線性回歸得到烷基類吡嗪化合物的反應速率（k）。通過Arrhenius方程確定烷基類吡嗪化合物的表觀活化能（Ea）。零級動力學、一級動力學、Arrhenius方程分別如式（1）～（3）所示：

式中：Ct為烷基類吡嗪化合物濃度/（mmol/L）；C0為反應初始濃度/（mmol/L）；k、k0和k1為反應速率常數/（mmol/（L·h））；A為指前因子/h-1；T為熱力學溫度/K；R為氣體摩爾常數（8.314 J/（mol·K））。

1.4 數據處理

使用Origin 9.0軟件（美國Origin Lab Corporation）進行線性回歸分析和動力學常數計算。應用SPSS分析軟件進行方差分析（ANOVA）和均值比較。P＜0.05，差異顯著，結果平行重復3 次，表示為。

2 結果與分析

2.1 烷基吡嗪化合物生成隨反應時間變化的關系

Ala-2,3-BD反應體系中共檢測了5 種甲基類吡嗪化合物：2,3-DMP、2,5-DMP、2,6-DMP、TriMP和TMP，其中2,3-DMP、2,5-DMP和2,6-DMP總概括為DMPs；3種乙基類吡嗪：EP、E-3-MP和E-5-MP。如圖1所示，對于甲基類吡嗪而言，總含量隨時間延長逐步累積（P＜0.05），在反應前中段范圍內（2～8 h）含量積聚變化幅度大，8 h后增速變化相對較為平緩。由圖1A觀察到，TriMP隨反應時間變化趨勢與總含量相似，反應10 h后含量趨于穩(wěn)定（P＞0.05）。DMPs反應8 h后含量增長也趨于平緩，其中2,6-DMP在體系反應中生成量最小，在2～12 h之間，質量濃度從1.28 mg/L上升至2.01 mg/L；2,5-DMP隨時間的延長穩(wěn)步增長，質量濃度最高達13.74 mg/mL；不同的是，2,3-DMP的增長速率在反應后段（12 h）含量略有下降。分子質量相同且共同具有2個甲基取代位點的2,3-DMP、2,5-DMP和2,6-DMP生成表現不同與其生成路徑密切相關[32]，在Yu Ainong等[23]研究中檢出的甲基類吡嗪中2,5-DMP也具有較高的檢出量。值得注意的是，TMP具有較大的占比，對總甲基類吡嗪化合物的貢獻率高達39.3%～42.7%，并與反應時間延長呈正相關。Xiao Zijun等[30]研究指出乙偶姻是四甲基吡嗪的前體物質，并且課題組前期研究[33]也證實乙偶姻與四甲基吡嗪生成具有良好的正相關。2,3-BD作為乙偶姻的下游物質，本實驗結果一定程度上也說明了以2,3-BD作為前體物質對TMP的生成具有一定優(yōu)勢性?？傮w而言，甲基類吡嗪化合物與反應時間具有良好的量效關系（P＜0.05）。

圖1 Ala-2,3-BD反應體系中甲基類吡嗪（A）和乙基類吡嗪（B）化合物質量濃度隨反應時間的變化Fig. 1 Relationship between methyl pyrazine (A) and ethyl pyrazine (B)concentrations and reaction time

如圖1B所示，乙基類吡嗪化合物較甲基類吡嗪化合物總生成量大，且隨時間的延長顯著增加（P＜0.05）。圖1B中明顯觀察到EP具有較大的生成量。EP是吡嗪環(huán)的2-位經甲基單取代而來，Yu Ainong等[23]在L-抗壞血酸和L-谷氨酸反應體系研究中曾指出此類乙基吡嗪類化合物是來自抗壞血酸降解產生的丁二酮，與本實驗結果具有共通性，2,3-BD為吡嗪類化合物生成直接創(chuàng)造了前體物質條件。反應時間的延長對EP和EP-5-MP都具有很大的促進作用，經12 h反應后的質量濃度最高，分別達到44.82 mg/L和28.72 mg/L。反應時間對EP-3-MP的作用不突出，EP-3-MP在整個時間范圍內整體變化較為平緩，在2～12 h之間，質量濃度僅從9.53 mg/L上升至14.83 mg/L，但在短時反應下也具有一定生成比例因此可能其于體系反應的前段已積聚產生。

2.2 烷基吡嗪化合物生成隨反應溫度變化的關系

溫度是美拉德反應中的關鍵調控因素[10]。如圖2所示，在60～120 ℃，反應4 h，體系鑒定得到烷基吡嗪種類齊全且具有顯著差異（P＜0.05）。由圖2A可知，甲基類吡嗪含量隨溫度變化顯著（P＜0.05），在100 ℃條件下總質量濃度達到最高值42.95 mg/L，隨溫度的遞增含量出現了回落。TriMP、TMP和2,3-DMP隨溫度變化趨勢均與總含量表現相似。其中TriMP和2,3-DMP在100 ℃溫度范圍內呈現上升趨勢，且生成量達到最高分別為8.87 mg/L和6.89 mg/L。TMP生成表現略有差別，在90 ℃時達到最高生成量（15.84 mg/L）隨后呈下降趨勢，但在120 ℃條件下仍有22.6%的檢出率，在所有甲基類吡嗪中具有較高的檢出比例。由圖2A明顯觀察到TMP和2,5-DMP產生量在體系中具有較高的占比，不同的是2,5-DMP在高溫條件下（90～120 ℃）含量仍呈積聚現象。2,6-DMP隨溫度變化同2,5-DMP呈增加趨勢，但積聚效果稍低?？傮w而言，甲基類吡嗪對溫度具有較大敏感性，溫度促進作用明顯，在2,3-BD的反應體系下為吡嗪化合物的生成創(chuàng)造了更明確的前體條件，減少了前期副產物的生成，但與此同時，長時間過高溫度的反應也加速了美拉德反應進程，推進物質的轉化更多生成了如類黑精等物質，從而出現吡嗪類化合物含量降低現象[34]。

圖2 Ala-2,3-BD反應體系中甲基類吡嗪（A）和乙基類吡嗪（B）化合物含量隨反應溫度的變化Fig. 2 Relationship betweenmethyl pyrazine (A) and ethyl pyrazine (B)concentrations and reaction temperature

如圖2B所示，乙基類吡嗪化合物隨溫度變化呈現正相關性（P＜0.05）。其中EP和E-5-MP隨溫度升高均呈較大幅度增加，最高質量濃度分別達到42.12 mg/L和18.64 mg/L。E-3-MP隨溫度變化最為平緩，60～120 ℃含量僅增加了27.8%，與時間變化趨勢相同。但在低溫條件下，E-5-MP在體系中的生成比例低于E-3-MP，說明E-5-MP的生成需要一定溫度條件驅動才有利于激發(fā)。對體系中烷基類吡嗪總體而言，乙基類吡嗪化合物總質量濃度較甲基類吡嗪化合物質量濃度高33.32 mg/L，這主要歸因于EP對總含量的貢獻。在100 ℃條件下，EP占比高達58.20%。譚志偉等[35]建立的抗壞血酸-賴氨酸反應體系中，2,5-DMP、E-5-MP和E-3-MP隨溫度變化具有同樣效果，進而分析高溫有利于α-二羰基化合物發(fā)生縮合反應從而利于吡嗪的生成。不同取代基的吡嗪化合物隨時間和溫度的增加表現出不同的變化趨勢這可能與復雜的美拉德反應進程，吡嗪化合物生成機理、反應速率密切相關[36]。

2.3 反應pH值對烷基吡嗪化合物生成影響

表2 pH值對Ala-2,3-BD反應體系中烷基類吡嗪化合物生成影響Table 2 Effect of pH on the formation of alkylpyrazines

在不同pH值反應體系溶液中進行8 種吡嗪化合物的生成鑒定。隨著反應pH值的升高，吡嗪含量顯著增加。由表2可知，當反應溶液pH值小于6時，除EP外體系中未檢測出其他類吡嗪；當反應溶液pH值大于6時，吡嗪檢出種類明顯豐富且含量有所增加，與前人結論一致[22]。在pH 6的溶液中開始達到3種乙基類吡嗪檢出的條件，但甲基類吡嗪仍有部分缺失。本研究中，在pH 8～9溶液中，目標烷基類吡嗪化合物得到完全檢出，值得注意的是，僅TMP和E-3-MP含量上具有顯著差異（P＜0.05），但在pH 9時，吡嗪總質量分數顯著增加至31.52 mg/L（P＜0.05），與前期研究[21,37]發(fā)現一致趨勢。結果證明，堿性條件下更有利于吡嗪化合物的生成，堿性條件下可能有利于促進氨基和羰氨的反應性，使美拉德反應發(fā)生更劇烈從而促進吡嗪的生成[20,37]。

2.4 動力學研究

相關研究表明[10]，不同美拉德反應步驟對溫度敏感性不同，它們可能不遵循相同的動力學模型。為更好地分析烷基類吡嗪化合物的生成，綜合前面不同溫度和時間的變化趨勢，建立60～90 ℃范圍內烷基類吡嗪形成的動力學模型，并用相關系數R2測量實驗數據對模型的擬合優(yōu)度。體系制備的Ala和2,3-BD的初始濃度均為0.1 mol/L。

圖3 在60、80 ℃和90 ℃處理溫度下Ala-2,3-BD反應體系6 種烷基吡嗪化合物動力學模型擬合Fig. 3 Kinetic models for the formation of six alkylpyrazines at reaction temperatures of 60, 80 and 90 ℃

表3 Ala-2,3-BD反應體系中6 種烷基吡嗪化合物動力學分析Table 3 Kinetic parameters for the formation of six alkylpyrazines

從圖3、表3可以看出，反應溫度越高，反應時間越長，產生的烷基類吡嗪也越多，這與前期研究具有一致性[34,38]。圖3A顯示DMPs的形成較好地擬合了一級動力學模型，速率常數k在60、80、90 ℃條件下分別為0.038 64、0.054 32、0.060 21 mmol/（L·h），并且R2均大于0.9。如圖3B、C所示，在60 ℃條件下反應2 h，TriMP平均產量從0.020 19 mmol/L提高到0.084 03 mmol/L（120 ℃條件下反應12 h），TMP從0.018 53 mmol/L 提高到0.174 1 mmol/L，在不同時間下TMP隨反應溫度升高的濃度變化較TriMP高。與DMPs不同，具有3個甲基取代位點和4個甲基取代位點的TriMP和TMP生成均較好的符合零級動力學模型，與前期研究一致[38]。TriMP速率常數k在60、80、90 ℃時分別為0.002 92、0.003 70、0.004 32 mmol/（L·h）；TMP分別為0.004 76、0.006 16、0.007 41 mmol/（L·h）。在各溫度下的TMP生產反應速率常數均較TriMP大，說明在Ala-2,3-BD反應體系下TMP的產生較TriMP快。通過得到的反應速率將lnk相對于1/T作圖，獲得一條直線并根據Arrhenius方程使用該線的斜率計算表觀活化能，y軸的截距等于lnA的值。由等式計算，DMPs表觀活化能為15.161 3 kJ/mol，指前因子為9.277 9 h-1（表3）。TriMP和TMP具有與DMPs相近的表觀活化能分別為12.880 3 kJ/mol和14.477 7 kJ/mol。Yu Hang等[38]在葡萄糖-甘氨酸模型體系中研究也指出2,5-DMP、TriMP和TMP三者在的表觀活化能差異不大，具有差異的是，在本研究中觀察到TMP較TriMP具有更高的表觀活化能，這可能是由于反應前體的不同而表現出不同的積聚反應。

如圖3D所示，EP的生成同DMPs遵循一級反應動力學，在不同時間下隨溫度的升高，EP表現出較高的生成量。在60 ℃條件下反應2 h，平均產量從0.098 18 mmol/L提高到0.414 49 mmol/L （120 ℃條件下反應12 h）。EP速率常數k分別為0.051 28、0.088 26、0.113 01 mmol/（L·h），相應R2值為0.975 4、0.995 8和0.961 4，具有較好地擬合效果，且具有最高的活化能（26.5036 kJ/mol）。此外2 種甲基取代的乙基類吡嗪化合物均遵循零級動力學模型（圖3E和圖3F），且具有較好的擬合效果（R2介于0.986 4～0.999 9之間）。EP-3-MP的速率常數k分別為0.003 27、0.004 06、0.004 53 mmol/（L·h）；EP-5-MP分別為0.007 34、0.007 86、0.008 10 mmol/（L·h）。在體系整個反應過程中，EP-3-MP產量變化幅度較小，可能是該體系下EP-3-MP的生成較為穩(wěn)定。相較于EP，EP-3-MP和EP-5-MP所需的活化能較低。其中EP-3-MP的表觀活化能與甲基類吡嗪具有一定接近性，但較低于三者甲基類吡嗪，為10.872 1 kJ/mol；EP-5-MP的表觀活化能為3.310 6 kJ/mol，是所有吡嗪中最低的，說明EP-5-MP的生成過程中具有較大的溫度依賴性。

3 結 論

吡嗪的形成始于α-氨基酮，這是由氨基酸與二羰基化合物在美拉德反應中通過Strecker降解縮合而成的產物。在復雜的美拉德體系中吡嗪形成的作用途徑不止一條，即使是一個非常簡單的模型體系也能產生大量、種類繁多的烷基吡嗪。本實驗建立Ala-2,3-BD美拉德反應體系，通過HPLC對2,3-DMP、2,5-DMP、2,6-DMP、TriMP、TMP、EP、E-3-MP和E-5-MP等烷基類吡嗪生成規(guī)律進行探討。吡嗪的形成雖與氨基酸側鏈無關，但不同氨基酸的反應性會決定不同吡嗪的形成程度，不同前體的選擇將決定某種生成路線更占據優(yōu)勢性。α-二羰基化合物為吡嗪化合物的生成創(chuàng)造了更明確的前體物質。2,3-丁二酮為乙偶姻的下游物質，在該體系中檢測到乙基類吡嗪相較于甲基類吡嗪具有更高的生成量，其中甲基類吡嗪中TMP和2,5-DMP生成量具有較高的占比；乙基類吡嗪中EP生成較為突出?？傮w而言，較高的反應溫度和較長的反應時間有利于吡嗪類化合物的生成，但過長的時間以及過高溫度加速了美拉德反應進程，推進物質的轉化，可能更多生成了諸如類黑精等產物，從而在反應后段觀察到TriMP、TMP和2,3-DMP出現含量降低的現象。烷基類吡嗪的形成具有堿催化效應，堿性條件下可能更有利于氨基和羰氨的反應性，使美拉德反應發(fā)生更劇烈從而促進吡嗪的生成，在pH 9的條件下吡嗪總量高達（31.52±1.35） mg/L。不同烷基吡嗪的生成過程中具有不同的生成速率，盡管烷基吡嗪在不同時間隨溫度變化生成濃度不同，但仍有部分吡嗪的生成動力學具有一定相似性。除DMPs和EP遵循一級動力學模型，其他吡嗪與零級動力學模型具有更好的擬合效果。3種甲基類吡嗪和乙基類吡嗪中的E-3-MP表觀活化能具有一定相近性，此外E-5-MP所需的活化能最低，與吡嗪生成途徑α-二羰基化合物縮合與氧化及其對溫度敏感性密切相關。本研究結果為進一步明確吡嗪類化合物生成規(guī)律和反應機理提供參考。