程 杰，王 彤，黃云艷，陳 星，于殿宇,*，羅淑年

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.九三集團惠康食品有限公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

Pickering乳液是一種以固體顆粒為乳化劑制成的乳液，這些固體顆粒有明確的粒徑分布和可控的表面特性，因此可以在油水界面上產(chǎn)生不可逆吸附，比傳統(tǒng)乳液更加穩(wěn)定[1]。Pickering乳液除具有傳統(tǒng)乳液的功能特性之外，利用固體顆粒穩(wěn)定乳液不僅降低了體系的自由能，為液滴之間提供了良好的界面機械屏障，保護了乳液的液滴形態(tài)，使乳液更加穩(wěn)定，而且具有粒徑分布可控、低毒性、制備方法簡單等諸多優(yōu)點[2]。

已有大量研究表明，各種固體顆粒如二氧化硅[3]、二氧化鈦[4]、殼聚糖[5]、纖維素、氧化鋅[6]以及四氧化三鐵[7]等是有效的Pickering乳液穩(wěn)定劑。近年來，磁性粒子穩(wěn)定的Pickering乳液備受關(guān)注。Rajarshi等[8]以殼聚糖和Fe3O4磁性納米粒子為固體穩(wěn)定劑制備了pH值響應(yīng)型磁性Pickering Janus乳液，并且提出Pickering乳液的形成，需要將磁性納米粒子加入到油相中而不是分散在水相中。Wang Guangshuo等[9]將磁性納米粒子加入到還原氧化石墨烯中，并進一步利用其制備用于磁共振成像和藥物傳遞的磁響應(yīng)Pickering乳液，實驗結(jié)果改善了磁共振成像表現(xiàn)以及敏感的持續(xù)藥物釋放行為。Low等[10]成功地以Fe3O4@纖維素納米晶納米復(fù)合材料為穩(wěn)定劑制備了磁性Pickering乳劑。磁性納米粒子與纖維素納米晶表面的結(jié)合增加了納米復(fù)合材料的表面疏水性，從而提高了磁性生物高聚物穩(wěn)定Pickering乳液的穩(wěn)定性。

纖維素具有較高的熱和機械穩(wěn)定性，可生物降解性以及對環(huán)境的低毒性等優(yōu)點[11]。從纖維素中可以獲得多種不同材料，例如微纖化纖維素、羥乙基纖維素、微晶纖維素和纖維素納米晶體[12]。Thunnalin等[13]從山竹果皮中提取出微纖化纖維素，研究pH≈7.0時，10%的O/W Pickering乳液性能和穩(wěn)定性的影響。Veronika等[14]研究了羧基化纖維素納米晶形成水/油性乳液的影響，發(fā)現(xiàn)乳化性能主要受連續(xù)相的影響。盡管對于纖維素類材料有較多報道，但是對于磁性纖維素微晶報道較少。

因此，本實驗通過制備磁性纖維素微晶顆粒，采用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜和視頻光學(xué)接觸角對磁性纖維素微晶復(fù)合物進行表征，探究磁性纖維素微晶復(fù)合物添加量、油水比及高壓均質(zhì)次數(shù)對乳液穩(wěn)定性的影響。為后續(xù)藥物遞送、乳液界面催化等應(yīng)用研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

纖維素微晶（≤25 μm） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；正己烷 美國Sigma-Aldrich公司；氨水（水中含氨氣≥28%）、FeCl2·H2O、FeCl3·6H2O 沈陽試劑化工貿(mào)易有限公司；所用化學(xué)藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AXTD5A臺式離心機 鹽城市安信實驗儀器有限公司；MixPlus旋渦振蕩器 合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；KQ3200B超聲振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計 上海大營儀器有限公司；FA2204B電子分析天平 山東晨拓科學(xué)儀器有限公司；DF-101S磁性攪拌器 金壇區(qū)水北盛威實驗儀器廠；FJ200-T實驗室定時高速分散均質(zhì)機 韜越（上海）機械科技有限公司；AVP-2000型高壓均質(zhì)機 英國Stansted Fluid Power公司；科研級正置顯微成像系統(tǒng) 奧林巴斯（中國）有限公司；SL200L1視頻光學(xué)接觸角測量儀美國科諾工業(yè)有限公司；SU8010掃描電子顯微鏡、H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；振動樣品磁（VSM,NO.735） 美國Lake-shore公司；NIB610-FL/NIB620-FL倒置熒光顯微鏡 上?？茖W(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磁性纖維素微晶復(fù)合物的制備

參考Chen Xin等[15]的方法并作適當(dāng)修改。磁性纖維素微晶復(fù)合物通過超聲輔助原位共沉淀法制備。首先，將0.04 g纖維素微晶在超聲波下分散在80 g水中以制備0.05 g/100 mL的纖維素分散體。接下來，將FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O（Fe3+/Fe2+物質(zhì)的量比為1.5∶1）添加到纖維素分散體中，攪拌并加熱到50 ℃。然后，將混合物內(nèi)添加適量氨水，用pH計調(diào)節(jié)混合體系的pH值為11。之后，沉淀出所得磁性纖維素微晶復(fù)合物，磁力分離并用乙醇洗滌3 次以除去所有殘留的氫氧化銨。將收集的磁性微晶復(fù)合物以6 000 r/min離心20 min，然后在烤箱中干燥過夜。存儲收獲的磁性纖維素微晶復(fù)合物，用于后續(xù)表征。

1.3.1.1 掃描電子顯微鏡測定

參考Sonam等[16]的方法。取適量樣品粉末，利用掃描電子顯微鏡分析磁性樣品的形貌變化。采用日本JEOL公司生產(chǎn)的JSM 6360模型進行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.1.2 透射電子顯微鏡測定

參考Zheng Tingting等[17]的方法。取適量樣品粉末，利用透射電子顯微鏡觀察。將樣品置于乙醇中，超聲分散5 min，用移液器滴于銅網(wǎng)上，進行透射電子顯微鏡觀察。

1.3.1.3 紅外光譜分析

參考Zhang Damin等[18]的方法。在本研究中，采用KBr壓片法，具體操作步驟如下：分別取2 mg上述制備的Fe3O4粒子、纖維素微晶以及磁性纖維素微晶粒子和200 mg光譜級的KBr（200 ℃脫水處理24 h）混合碾磨均勻，隨后，分別取90 mg混合物在不銹鋼模具中壓制成約1 mm厚的直徑為13 mm的圓片。使用紅外光譜儀在室溫（25 ℃）于400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)以4 cm-1的分辨率掃描32 次收集樣品光譜信息。以空白KBr壓片作為參考，消除KBr雜質(zhì)、水和CO2對光譜結(jié)果的影響。整個操作在紅外燈下進行并且迅速完成，防止空氣中的水汽影響實驗結(jié)果。

1.3.1.4 三相接觸角分析

參考Yang Tao等[19]的方法，并作適當(dāng)修改。用壓片機將制成的固體顆粒進行壓片，制備直徑13 mm、厚度2 mm的薄膜。使用高精度注射器將一滴水（5 μL）沉積在薄膜的表面上。在通過攝像機從注射器下落之后立即記錄液滴圖像，并且液滴的輪廓被數(shù)值求解并且適合于Laplace-Young方程，可確定其界面張力。每個樣品在3個顆粒中的每一個上測量接觸角，并對每個顆粒進行3 次測量。

1.3.2 Pickering乳液的制備

參照Galvez-vergara等[20]的方法，以正己烷作為油相，制備乳液并作適當(dāng)修改。取適量磁性纖維素微晶復(fù)合物置于100 mL燒杯中，添加水相pH 8.5的磷酸鹽緩沖溶液，添加適量油相，將混合體系經(jīng)過15 000 r/min均質(zhì)處理2 min，得到初乳液。再經(jīng)過高壓均質(zhì)機40 MPa循環(huán)不同次數(shù)，以形成O/W型Pickering乳液。本實驗大致流程如圖1所示。

圖1 制備磁性纖維素微晶復(fù)合物顆粒及其Pickering乳液Fig. 1 Preparation of magnetic cellulose microcrystalline composite particles and their application to stabilize Pickering emulsion

1.3.2.1 磁性纖維素微晶復(fù)合物添加量對Pickering乳液的影響

參照1.3.2節(jié)方法，分別設(shè)置磁性纖維素微晶復(fù)合物添加量分別為0.5、1.5、2.5 g/100 mL，添加水相為體積分?jǐn)?shù)80%，油相體積分?jǐn)?shù)為20%，將混合體系經(jīng)過均質(zhì)處理，得到初乳液之后，再經(jīng)過高壓均質(zhì)2 次，以研究磁性纖維素微晶添加量對Pickering乳液的影響。

1.3.2.2 油水比對Pickering乳液的影響

參照1.3.2節(jié)方法，磁性纖維素微晶復(fù)合物的添加量為1.5 g/100 mL，分別設(shè)置不同油水比為4∶6、3∶7、2∶8（V/V），將混合體系經(jīng)過均質(zhì)處理，得到初乳液之后，再經(jīng)過高壓均質(zhì)2 次，以研究油水比對Pickering乳液的影響。

1.3.2.3 均質(zhì)次數(shù)對Pickering乳液的影響

參照1.3.2節(jié)方法，磁性纖維素微晶復(fù)合物添加量為1.5 g/100 mL，添加水相為70%，油相為30%，將混合體系經(jīng)過均質(zhì)處理，得到初乳液之后，循環(huán)不同的高壓均質(zhì)次數(shù)分別為0、2、4 次，以研究均質(zhì)次數(shù)對Pickering乳液的影響。

1.3.3 Pickering乳液微觀結(jié)構(gòu)

參考劉佩等[2]的方法。取Pickering乳液乳化層少量，稀釋一定的倍數(shù)，分散均勻后取10 μL分散液進行制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察乳液的微觀形貌并拍照分析。

1.3.4 Pickering乳液熒光顯微鏡分析

使用倒置熒光顯微鏡在10 倍放大倍數(shù)下檢查磁性纖維素微晶復(fù)合物在油水界面的定位。采用雙染色法在pH 8.5條件下制備熒光顯微鏡用的乳液樣品。乳液制備前，將正己烷用尼羅紅染色，然后用異硫氰染色水相，觀察乳液形態(tài)時稀釋一定倍數(shù)置于載玻片上。

1.3.5 Pickering乳液的重復(fù)性

利用振動樣品磁強計測定室溫條件下（25 ℃）磁性纖維素微晶復(fù)合物的直流磁滯回線，施加磁場強度的范圍為-15 000～15 000 Oe，從磁滯回線中能得出磁性材料的飽和磁化強度值。將制得的Pickering乳液用磁性進行吸附，此時乳液會發(fā)生破乳現(xiàn)象，將磁性纖維素微晶復(fù)合物進行回收，測定磁性顆粒的磁化強度值，用于重新穩(wěn)定Pickering乳液，循環(huán)測定乳液粒徑和磁性顆粒的磁化強度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗獲取的數(shù)據(jù)，用3 次重復(fù)實驗的平均值表示，采用SPSS 16.0軟件進行方差分析及多重比較分析，并利用Origin 9.0軟件處理實驗所得數(shù)據(jù)及畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電子顯微鏡分析

從圖2a可以清晰看出，纖維素微晶呈現(xiàn)出完整的棒狀結(jié)構(gòu)，管壁較為光滑，具有良好的長徑比。圖2b為摻雜Fe3O4納米粒子的纖維素微晶，可以看出具有明顯的形態(tài)變化，磁性纖維素微晶復(fù)合物表面變得較為粗糙，管壁變得不平整，且磁性纖維素微晶復(fù)合物的平均長度約為14.2 μm。

圖2 樣品的掃描電子顯微鏡圖像Fig. 2 SEM images of the samples

2.2 透射電子顯微鏡分析

從圖3可以看出，纖維素微晶負載前和負載后仍然保持棒狀結(jié)構(gòu)，與掃描電子顯微鏡的結(jié)果吻合。由圖3c可以看到Fe3O4粒子均勻分布，分散良好，平均粒徑為10 nm左右。圖3b與3a相比，F(xiàn)e3O4納米顆粒均勻地附著在纖維素微晶體表面。

圖3 樣品的透射電子顯微鏡圖像Fig. 3 TEM images of the samples

2.3 FTIR光譜分析

利用FTIR光譜對磁性纖維素微晶復(fù)合物的相互作用進行表征，結(jié)果如圖4所示。3種粒子在3 404、1 578 cm-1附近均出現(xiàn)了相同的吸收峰，表明粒子上存在—OH基團；此外在圖4b和c譜線中的565 cm-1處均出現(xiàn)吸收峰，這歸因于Fe3O4顆粒光譜中Fe—O鍵的伸縮振動[21]，因此可以判斷纖維素微晶上成功結(jié)合了磁性粒子，這與掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的結(jié)果一致。

圖4 樣品的FTIR光譜圖像Fig. 4 FTIR spectra of the samples

2.4 視頻光學(xué)接觸角分析

固體顆粒的潤濕性是制備Pickering乳液的重要標(biāo)準(zhǔn)，因為它控制形成的Pickering乳液類型及其穩(wěn)定性，并且固體顆粒的潤濕性由接觸角（θ）的值決定[22]。當(dāng)接觸角小于90°時，表明顆粒是親水的，易于形成O/W型乳液；當(dāng)接觸角大于90°時，表明顆粒是親油的，易于形成W/O型乳液；當(dāng)接觸角90°時，此時形成的乳液穩(wěn)定性最好[23]。因此，開發(fā)具有兩親性質(zhì)或具有適當(dāng)潤濕性的顆粒是配制Pickering乳液最重要步驟之一[24]。合適的潤濕性可增強顆粒在水/油界面處的吸附，并隨后提供防止乳液液滴聚結(jié)的位阻。

如圖5所示，F(xiàn)e3O4的接觸角為46.67°，纖維素微晶的接觸角為42.48°，磁性纖維素微晶復(fù)合物的接觸角為69.58°。相對于Fe3O4和纖維素微晶，磁性纖維素微晶復(fù)合物的疏水性更強，因為磁性纖維素微晶復(fù)合物的水接觸角大于Fe3O4和纖維素微晶，這可能是由于Fe3O4和纖維素微晶在共沉淀過程中，纖維素微晶表面的親水基團（-OH基團）減少導(dǎo)致[25]。因此，磁性纖維素微晶復(fù)合物形成穩(wěn)定乳液的能力更強。

圖5 固體顆粒的接觸角Fig. 5 Contact angle of solid particles

2.5 磁性纖維素微晶復(fù)合物添加量對Pickering乳液穩(wěn)定性的影響

一般情況下，當(dāng)粒子濃度過低時無法形成穩(wěn)定的Pickering乳液，這種乳液穩(wěn)定一段時間后可能會出現(xiàn)破乳現(xiàn)象。當(dāng)粒子濃度升高時，Pickering乳液的穩(wěn)定性提高。因此，顆粒濃度只有適當(dāng)時才會形成穩(wěn)定的Pickering乳液。如圖6所示，當(dāng)磁性纖維素微晶復(fù)合物添加量為0.5 g/100 mL時，能夠形成少量乳液并且粒徑分布不均勻。繼續(xù)提高磁性纖維素微晶復(fù)合物用量時，形成的乳液液滴較為均勻，并且粒徑基本一致。當(dāng)磁性纖維素微晶復(fù)合物用量過多時，可能是乳液體系濃度過高，導(dǎo)致分散相中的粒子過剩或聚集[26]。綜上分析，磁性纖維素微晶復(fù)合物添加量為1.5 g/100 mL時，乳液穩(wěn)定性較好。為比較磁性纖維素微晶復(fù)合物和纖維素微晶對Pickering乳液的穩(wěn)定效果，設(shè)置纖維素微晶添加量為1.5 g/100 mL，其他條件保持不變，制備原始纖維素微晶穩(wěn)定的乳液作為對照樣品，結(jié)果表明，純纖維素微晶不能制備出穩(wěn)定的Pickering乳液。

圖6 磁性纖維素微晶復(fù)合物添加量對Pickering乳液穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of magnetic cellulose microcrystal addition on the stability of Pickering emulsion

2.6 油水比對Pickering乳液穩(wěn)定性的影響

如圖7所示，當(dāng)油相體積少時，乳液的粒徑較小，隨著油水比的增大，即油相體積增加，水相體積減少，乳液的粒徑呈現(xiàn)變大的趨勢。當(dāng)油水比為3∶7時，乳液液滴分布均勻，粒徑基本一致。但是油水比為4∶6時，乳液液滴尺寸較大，可能是由于油相含量增多時，乳化劑顆粒含量保持不變，所以穩(wěn)定乳液液滴界面的乳化劑數(shù)量相對不足，液滴碰撞頻率就會增加，以達到減少界面總面積從而維持穩(wěn)定的目的，此時乳化劑顆粒會分布在更大乳滴上，所以粒徑會越來越大，乳液產(chǎn)生不穩(wěn)定趨勢[27]。因此，選擇適宜的油水比為3∶7。為比較不同乳化劑的效果，設(shè)置纖維素微晶用量1.5 g/100 mL，油水比3∶7，其他條件保持不變，得到磁性微晶和單純纖維素微晶的乳液，可以明確看出纖維素微晶穩(wěn)定的乳液效果略低。

圖7 油水比對Pickering乳液穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of oil/water ratio on the stability of Pickering emulsion

2.7 均質(zhì)次數(shù)對Pickering乳液穩(wěn)定性的影響

高壓均質(zhì)會提高食品的加工效率，還能顯著提高乳液體系的穩(wěn)定性[28]。如圖8所示，不同均質(zhì)次數(shù)處理后乳液的平均粒徑均低于未進行高壓均質(zhì)的乳液。未經(jīng)過高壓均質(zhì)的乳液，液滴分布不均勻，且乳液的粒徑較大。隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，乳狀液粒徑分布向低粒徑趨勢轉(zhuǎn)移，即乳滴粒徑減小，可能是經(jīng)過高壓處理，乳液體系中被輸入較多能量導(dǎo)致[29]。均質(zhì)處理4 次時，乳液粒徑有增大的趨勢，可能是乳液發(fā)生了“過處理”現(xiàn)象，由于高壓處理使乳液粒徑變小，顆粒之間布朗運動速率加快，增加了相互碰撞的次數(shù)，從而破壞界面膜，導(dǎo)致固體顆粒的聚集[30]，所以乳液穩(wěn)定性降低。所以，均質(zhì)次數(shù)為2 次最佳。為了比較乳化劑的效果，設(shè)置纖維素微晶用量1.5 g/100 mL，油水比3∶7，均質(zhì)次數(shù)2 次制備Pickering乳液，與相同條件下磁性纖維素微晶復(fù)合物穩(wěn)定的乳液進行對比，清晰觀察到單純纖維素微晶穩(wěn)定的乳液效果較差。

圖8 均質(zhì)次數(shù)對Pickering乳液穩(wěn)定性的影響Fig. 8 Effect of number of homogenization cycles on the stability of Pickering emulsion

2.8 Pickering乳液的熒光顯微鏡分析

為明確Pickering乳液的類型，分別將油相用尼羅紅染為紅色，水相用異硫氰染為綠色，結(jié)果如圖9所示。圖9a中乳液液滴發(fā)出強烈的紅色熒光信號，圖9b中經(jīng)染色后水相呈現(xiàn)出綠色熒光信號，乳液液滴外殼為綠色，內(nèi)部呈現(xiàn)黑色。因此，乳液被確定為O/W型。

圖9 Pickering乳液熒光顯微圖像Fig. 9 Fluorescence microscopic image of Pickering emulsion

2.9 Pickering乳液可重復(fù)性分析

磁響應(yīng)性是磁性可回收型材料最為重要的性能之一，反映磁響應(yīng)性最為重要的參數(shù)是飽和磁化強度。磁性纖維素微晶復(fù)合物的磁性能是實現(xiàn)利用磁場控制磁性固體顆粒在乳液中破乳，從而進行快速分離的關(guān)鍵。磁性粒子的飽和磁化強度值越大，磁性分離時間越短，乳液也會快速破乳[31]。如圖10a所示，當(dāng)施加外部磁場時，磁性纖維素微晶復(fù)合物會向磁鐵周圍靠近，表現(xiàn)出典型的磁場刺激響應(yīng)性。如圖10b所示，磁性纖維素微晶復(fù)合物顆粒初始飽和磁化強度值為56.8 emu/g，磁性纖維素微晶復(fù)合物顆粒經(jīng)過重復(fù)使用5 次后飽和磁化強度值為4.2 emu/g。此時，磁性固體粒子的磁性能過低，不利于乳化劑的分離回收，因此不適合繼續(xù)使用穩(wěn)定乳液。

圖10 Pickering乳液磁場刺激響應(yīng)性（a）和磁性固體顆粒重復(fù)使用磁性能變化（b）Fig. 10 Pickering emulsions stimulated magnetic field responsiveness (a) and changes in magnetic properties after repeated use of magnetic solid particles (b)

3 結(jié) 論

將Fe3O4與纖維素微晶結(jié)合成磁性固體顆粒，制得穩(wěn)定的O/W型Pickering乳液。通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，磁性纖維素微晶復(fù)合物仍能保持良好的棒狀結(jié)構(gòu)，并且纖維素微晶表面明顯變的粗糙，F(xiàn)e3O4粒子附著在纖維素微晶表面；FTIR光譜發(fā)現(xiàn)磁性纖維素微晶復(fù)合物上出現(xiàn)Fe3O4粒子的特征峰值；視頻光學(xué)接觸角測量得出磁性纖維素微晶復(fù)合物的親水親油性優(yōu)于纖維素微晶，因此形成的乳液更加穩(wěn)定。在最優(yōu)的條件下制得O/W型Pickering乳液，該乳液表現(xiàn)出磁場刺激響應(yīng)性，磁性纖維素微晶復(fù)合物顆?？梢灾貜?fù)使用5 次。