周婷婷 鄭小曼 歐陽(yáng)凈 魯雁秋 陳耀凱

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染所引起的一種傳染性疾病，是全球十大死因之一，2020年全球新發(fā)結(jié)核病患者987萬(wàn)例，發(fā)病率為127/10萬(wàn)[1]。結(jié)核病治療和管理在全球范圍內(nèi)面臨著MTB多藥耐藥日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。作為煙酰胺的一種衍生物，吡嗪酰胺自1952年被發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性后就一直被用于結(jié)核病的治療，具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入MTB胞內(nèi)后，在吡嗪酰胺酶作用下活化為吡嗪酸，當(dāng)MTB所處環(huán)境為低pH值條件時(shí)會(huì)促進(jìn)吡嗪酸在菌內(nèi)的累積，聚集的吡嗪酸破壞了胞內(nèi)正常的酸堿平衡從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為吡嗪酰胺的抗菌作用[2]。吡嗪酰胺在降低結(jié)核病復(fù)發(fā)率、縮短病程，以及治療異煙肼和利福平耐藥患者方面都發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。此外，在體外低pH值條件下，其他一線抗結(jié)核藥物效果不佳時(shí)，吡嗪酰胺仍對(duì)半休眠期MTB和持留菌具有較好的殺菌作用[4]。

然而，越來(lái)越多研究表明，MTB對(duì)吡嗪酰胺的耐藥性呈明顯上升趨勢(shì)[5]，其耐藥性主要是由于一些靶標(biāo)基因突變產(chǎn)生的，包括編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因、編碼30S核糖體蛋白質(zhì)S1的rpsA基因、編碼天門(mén)冬氨酸脫羧酶的panD基因等。另外，部分研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型脂肪酸合成酶FAS-I基因突變、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A連接酶D2編碼基因fadD2突變與MTB對(duì)吡嗪酰胺的耐藥性也存在一定聯(lián)系。筆者結(jié)合最新文獻(xiàn)，對(duì)幾種可能與吡嗪酰胺耐藥性相關(guān)的靶標(biāo)基因及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、吡嗪酰胺耐藥相關(guān)基因及其機(jī)制

(一)pncA

pncA基因長(zhǎng)558 bp，編碼186個(gè)氨基酸，最終轉(zhuǎn)錄翻譯為吡嗪酰胺酶。在MTB對(duì)吡嗪酰胺耐藥有關(guān)的基因突變中，pncA基因突變種類(lèi)最豐富且位點(diǎn)不固定，包括大部分的點(diǎn)突變和少數(shù)的堿基插入或缺失突變，部分菌株中pncA在不止一個(gè)位點(diǎn)均有突變。因此，pncA突變也被認(rèn)為是MTB對(duì)吡嗪酰胺耐藥的分子基礎(chǔ)[6]。Yadon等[7]在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中對(duì)MTB的pncA突變進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)pncA突變，這些突變導(dǎo)致吡嗪酰胺酶活性損失或吡嗪酰胺酶蛋白質(zhì)豐度降低；Li等[8]利用大腸桿菌pncA基因敲除菌株測(cè)試了30個(gè)新發(fā)現(xiàn)的pncA突變對(duì)吡嗪酰胺酶活性的影響，結(jié)果表明，這些新突變中的24個(gè)導(dǎo)致吡嗪酰胺酶的活性喪失。這些研究都表明，pncA的突變使吡嗪酰胺在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成有活性的吡嗪酸效率受損，進(jìn)而使該菌株具有吡嗪酰胺耐藥性。

Ei等[9]對(duì)192株MTB進(jìn)行吡嗪酰胺藥物敏感性試驗(yàn)和pncA測(cè)序分析，在82株分離株的pncA啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)65個(gè)不同的突變。Naluyange等[10]報(bào)道了K96R、T142R、R154G和V180F的突變，這些pncA的突變均使MTB表現(xiàn)出對(duì)吡嗪酰胺的耐藥性，而吡嗪酰胺敏感菌株的測(cè)序結(jié)果則顯示pncA及啟動(dòng)子區(qū)均未發(fā)生突變；Wu等[11]在一些中國(guó)耐藥株中發(fā)現(xiàn)pncA基因一些位點(diǎn)的突變率超過(guò)5%，這些突變位點(diǎn)包括第10位谷氨酰胺(Gln)突變?yōu)楦彼?Pro)，第12位天冬氨酸(Asp)突變?yōu)楸彼?Ala)，第41位酪氨酸(Tyr)突變?yōu)榻K止子，第97位甘氨酸(Gly)突變?yōu)樘於彼?Asp)，第128位纈氨酸(Val)突變?yōu)楦拾彼?Gly)和第131位FSC的突變。

雖然pncA基因突變的位點(diǎn)幾乎無(wú)規(guī)律可尋，分散于整個(gè)基因范圍內(nèi)，但Katale等[12]研究發(fā)現(xiàn)，有42.1%的突變發(fā)生在第128位，表現(xiàn)為纈氨酸(Val)突變?yōu)楦拾彼?Gly)。Aggarwal等[13]發(fā)現(xiàn)由pncA突變引起的吡嗪酰胺酶突變結(jié)構(gòu)(W68R，W68G)和天然吡嗪酰胺酶蛋白相比，與底物的親和力更低，分子動(dòng)力學(xué)模擬分析表明，吡嗪酰胺酶第68個(gè)殘基突變會(huì)導(dǎo)致其活性位點(diǎn)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，即吡嗪酰胺向吡嗪酸的轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為MTB的吡嗪酰胺抗性。

(二)rpsA

rpsA基因全長(zhǎng)1446 bp，編碼的30S核糖體蛋白質(zhì)S1(RpsA)含有481個(gè)氨基酸。rpsA的突變率介于pncA和panD之間，是吡嗪酰胺耐藥基因突變第二大高發(fā)基因[14]。RpsA是一種重要的參與核糖體轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程的蛋白質(zhì)。Shi等[15]認(rèn)為吡嗪酸的新靶標(biāo)是RpsA，即吡嗪酸與RpsA結(jié)合并與RpsA的天然輔助因子tmRNA競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制活性蛋白質(zhì)合成所需要的反式翻譯，影響MTB的活性蛋白合成，進(jìn)而達(dá)到殺菌作用。之后，該研究者對(duì)1株缺乏pncA突變的吡嗪酰胺低水平耐藥MTB臨床分離株DHM444(最低抑菌濃度為200～300 mg/ml 吡嗪酰胺)的rpsA基因進(jìn)行了序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其在RpsA蛋白的C末端含有DA438缺失，進(jìn)一步高效表達(dá)并純化了突變體RpsA DA438蛋白，發(fā)現(xiàn)與野生型H37Rv RpsA蛋白不同，它不與吡嗪酸結(jié)合；對(duì)不同分枝桿菌菌種RpsA蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，耐吡嗪酰胺的DHM444菌株中DA438缺失發(fā)生的C-末端區(qū)域也是吡嗪酰胺敏感菌株和耐藥菌株間差異最大的區(qū)域，表明該區(qū)域的變化可能改變吡嗪酰胺的易感性[15]。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺對(duì)翻譯過(guò)程的抑制可能會(huì)干擾MTB在應(yīng)激、脅迫條件下的存活能力。這一發(fā)現(xiàn)有助于解釋不同應(yīng)激條件下，如酸性pH值、低氧、饑餓、存在能量抑制劑和其他藥物，都可增強(qiáng)吡嗪酰胺的滅菌活性；也有助于解釋吡嗪酸與RpsA結(jié)合并抑制反式翻譯過(guò)程[15]。

然而，Dillon等[16]的研究則提出MTB中的活性RpsA與RNA單鏈相互作用，并非是吡嗪酸的靶標(biāo)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，一些在吡嗪酰胺抗性菌株中發(fā)現(xiàn)的rpsA突變株，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株中重建時(shí)并不會(huì)表現(xiàn)出吡嗪酰胺抗性；利用純化的MTB核糖體進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)一種干擾寡核苷酸可以抑制菌體反轉(zhuǎn)錄，而吡嗪酸卻不能。基于這些實(shí)驗(yàn)，Dillon等[16]認(rèn)為吡嗪酰胺在MTB中的作用機(jī)制與RpsA和MTB自身的轉(zhuǎn)錄翻譯無(wú)關(guān)。Vallejos-Sanchez等[17]也認(rèn)為RpsA可能不參與MTB中吡嗪酰胺的作用機(jī)制，他們?cè)u(píng)估了吡嗪酸與tmRNA競(jìng)爭(zhēng)RpsA的能力，結(jié)果顯示吡嗪酸和RpsA無(wú)論是在MTB野生型還是rpsA突變株中都沒(méi)有觀測(cè)到相關(guān)結(jié)合，表明RpsA可能不參與MTB中吡嗪酰胺的作用機(jī)制。

(三)panD

panD基因全長(zhǎng)420 bp，轉(zhuǎn)錄翻譯成吡嗪酸的靶標(biāo)——139個(gè)氨基酸組成的天冬氨酸脫羧酶PanD[18]。泛酸和輔酶A(CoA)是MTB正常生理代謝所不可或缺的，panD參與泛酸和CoA生物合成前體β-丙氨酸的合成[19]，由此推測(cè)panD突變可能會(huì)影響泛酸和CoA的生物合成，進(jìn)而影響MTB對(duì)吡嗪酰胺的敏感性。Shi等[20]對(duì)一些在pncA和rpsA中沒(méi)有突變的吡嗪酸抗性突變體進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)吡嗪酸抗性突變體均具有影響panD蛋白C末端的突變，其中PanD M117I是最常見(jiàn)的突變。過(guò)表達(dá)PanD M117I會(huì)賦予MTB對(duì)吡嗪酸和吡嗪酰胺的抗性。此外，在治療濃度下，吡嗪酸的濃度與MTB中PanD酶的活性呈負(fù)相關(guān)，但前藥吡嗪酰胺或吡嗪酰胺類(lèi)似物煙酰胺并未抑制其活性。這些發(fā)現(xiàn)也同樣表明PanD可能是吡嗪酰胺/吡嗪酸的新靶標(biāo)[20]。

近期也有報(bào)道指出吡嗪酸可能只是一種微弱的PanD酶抑制劑。Gopal等[21]通過(guò)圓二色譜分析發(fā)現(xiàn)吡嗪酸可以改變PanD的二級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，他們進(jìn)一步指出PanD是酪蛋白水解酶ClpC1-ClpP的底物，吡嗪酸通過(guò)促進(jìn)ClpC1-ClpP降解其靶標(biāo)PanD來(lái)阻止MTB正常CoA的生物合成，從而表現(xiàn)為吡嗪酰胺通過(guò)降解目標(biāo)蛋白質(zhì)發(fā)揮抗菌活性。最近的分子動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PanD酶在其活性位點(diǎn)上以一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式結(jié)合吡嗪酸，但PanD酶活性位點(diǎn)不能直接結(jié)合抑制劑，而panD突變導(dǎo)致PanD酶蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)PanD酶活性位點(diǎn)與吡嗪酸結(jié)合進(jìn)而使菌株產(chǎn)生耐藥，這些耐藥突變多聚集在PanD酶活性部位上方的環(huán)附近，這些抗性突變體通常會(huì)表現(xiàn)出較低耐藥性[22]。Pandey等[23]研究發(fā)現(xiàn)，panD基因非活性位點(diǎn)H21R、I49V的突變會(huì)造成MTB對(duì)吡嗪酰胺耐藥，該研究通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬，證實(shí)了H21R-I49V的雙突變影響了PanD與吡嗪酰胺復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，與天然蛋白相比，雙突變體對(duì)吡嗪酰胺的結(jié)合親和力更低、在配體結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)構(gòu)變化更多，表明panD基因非活性位點(diǎn)突變可能也與MTB的耐藥機(jī)制相關(guān)。

(四) 其他基因

fadD2基因長(zhǎng)1683 bp，編碼長(zhǎng)鏈脂肪酸酰輔酶A連接酶(FadD2)。研究報(bào)道，fadD2功能的正常發(fā)揮可能有助于MTB對(duì)吡嗪酰胺和吡嗪酸表現(xiàn)出耐藥性，F(xiàn)adD2功能喪失可將MTB對(duì)吡嗪酰胺和吡嗪酸的敏感性增強(qiáng)16倍，表明fadD2基因可能是MTB天然攜帶的而非后天突變獲得的耐藥基因[24]。值得注意的是，該報(bào)道還發(fā)現(xiàn)FadD2功能缺失的突變體在中性pH條件(pH=6.8)下對(duì)吡嗪酰胺敏感，而在相同條件下觀察到野生型MTB卻對(duì)吡嗪酰胺的高度耐受[24]。從機(jī)制上講，fadD2表達(dá)中斷引起的脂質(zhì)代謝紊亂可能使MTB在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行某種程度的代謝重編程，這一發(fā)現(xiàn)同時(shí)也提示，吡嗪酰胺的作用機(jī)制可能不是完全依賴酸性環(huán)境的[24]。雖然目前大多認(rèn)為fadD2基因與MTB中CoA和脂質(zhì)代謝聯(lián)系密切，但仍缺乏大量研究以確定fadD2具體如何調(diào)控MTB的吡嗪酰胺耐藥機(jī)制。

FAS-I基因編碼脂肪酸合成酶I(FAS-I)，后者是α6亞型的蛋白質(zhì)復(fù)合物，由6條長(zhǎng)多肽鏈組成，總相對(duì)分子質(zhì)量約為2 000 000。每個(gè)FAS-I的α鏈有7個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，由3069個(gè)氨基酸組成。FAS-I不僅調(diào)控MTB的脂肪酸合成代謝，也是MTB毒性的關(guān)鍵酶復(fù)合體[25]。Elad等[25]利用分子建模和單粒子冷凍電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，盡管FAS-I總體結(jié)構(gòu)相似，但MTB的FAS-I具有與其他細(xì)菌FAS-I系統(tǒng)靜電勢(shì)不同且結(jié)構(gòu)域之間的間隙更大。FAS-I產(chǎn)生的C26脂肪酸是構(gòu)成MTB自身重要耐藥細(xì)胞膜屏障——分枝菌酸的前體物質(zhì)，考慮到靶向抑制分枝菌酸的合成是一種有效殺滅MTB的方法，因此，F(xiàn)AS-I基因是抗結(jié)核藥物的研究主要靶點(diǎn)之一。當(dāng)吡嗪酸在MTB內(nèi)聚集時(shí)會(huì)抑制FAS-I的活性進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的正常點(diǎn)位、影響菌體的能量代謝，從而發(fā)揮對(duì)MTB一定程度上的抑制性[26]。有研究發(fā)現(xiàn)吡嗪酸的類(lèi)似物5-氯吡嗪酰胺是NADPH與FAS-I結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能夠抑制FAS-I的活性[27]。

二、總結(jié)與展望

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)于MTB的吡嗪酰胺耐藥性相關(guān)分子機(jī)制的研究也突飛猛進(jìn)。結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)分析MTB相關(guān)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)的變化也大大提升了相關(guān)基因耐藥機(jī)制的研究水平。近期研究發(fā)現(xiàn)，在吡嗪酰胺耐藥株中大多數(shù)為pncA突變，突變率約為90%，其次為rpsA，突變率約為7%～10%，最后為panD突變，突變率約為1%～3%[28]。雖然相關(guān)耐藥分子機(jī)制的探索一直在不斷進(jìn)行當(dāng)中，但無(wú)論是pncA、rpsA、panD、fadD2還是FAS-I，目前尚無(wú)任何一個(gè)相關(guān)耐藥基因的分子機(jī)制能夠被完全闡述清楚，且rpsA和panD是否與MTB的吡嗪酰胺耐藥性有明顯相關(guān)性目前仍存在一些爭(zhēng)議。關(guān)于FAS-I基因突變、fadD2基因突變的研究較少，因此上述相關(guān)基因都還需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐以繼續(xù)探究。另外，有些菌株基因測(cè)序結(jié)果顯示無(wú)相關(guān)耐藥基因突變，但仍可表現(xiàn)出一定的抗性[29]，部分耐藥基因不同位點(diǎn)的突變所導(dǎo)致的MTB的耐藥性也不相同[8]，這些現(xiàn)象從一定程度上提示MTB對(duì)吡嗪酰胺的耐藥還存在一些其他機(jī)制或未知的基因突變有待深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突