蔡琪琪 王 堽 董寅壯 於麗華 王宇光 耿 貴,

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱；2黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱）

鹽漬化是影響全球生態(tài)環(huán)境的重要限制因素之一[1]。全球大約有 1×109hm2的鹽堿地，其中含NaCl和Na2SO4等中性鹽的鹽土約占23%[2]。NaCl和 Na2SO4等中性鹽脅迫對植物生長發(fā)育有影響，且 NaCl和 Na2SO4對不同植物的影響有差異。研究[3]發(fā)現(xiàn)，NaCl和 Na2SO42種中性鹽脅迫對苦豆子種子萌發(fā)均有抑制作用，且 Na2SO4脅迫的影響比 NaCl弱。對四翅濱藜的研究[4]也發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫抑制效果比Na2SO4脅迫強(qiáng)。而對韃靼濱藜的研究[5]表明，Na2SO4脅迫的毒害程度高于NaCl脅迫。

甜菜（Beta vulgaris L.）是世界及中國北方主要糖料作物之一，具有良好的耐鹽性，在我國新疆、內(nèi)蒙古和黑龍江等鹽堿地區(qū)種植較多[6]。目前，國內(nèi)外對甜菜的耐鹽性均有研究，但至今仍未完全了解其耐鹽機(jī)制。為進(jìn)一步揭示甜菜耐鹽機(jī)制，本試驗(yàn)選用中性鹽NaCl和Na2SO4對甜菜進(jìn)行脅迫，以期通過對比2種鹽對甜菜影響的差異，了解其耐鹽機(jī)制。植物受到鹽脅迫后，光合作用往往受到抑制，同時抗氧化酶系統(tǒng)被激活來抵抗逆境，因此，本研究通過分析不同中性鹽脅迫對甜菜苗期光合作用及抗氧化酶系統(tǒng)影響的差異，為甜菜在不同鹽堿地的篩選種植及生產(chǎn)布局提供依據(jù)，并為后期進(jìn)一步研究甜菜對NaCl和Na2SO4的耐受機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)方法

以實(shí)驗(yàn)室保留的甜菜品種‘KWS1176’的丸粒化種子為材料。采用蛭石培養(yǎng)進(jìn)行催苗，在25℃條件下催苗 5d，挑選長勢均勻的幼苗進(jìn)行移栽，用1/2 Hoagland營養(yǎng)液在光照培養(yǎng)室進(jìn)行水培，光照有效輻射 460±15[μmol/(m3·s)]，光照時間 6:00-20:00，晝夜溫度分別為(25±2)℃和(20±2)℃，相對濕度65%～70%。

如表1，水培8d后對甜菜分別進(jìn)行NaCl、Na2SO4及其混合鹽脅迫處理，每種中性鹽處理設(shè)置 2個Na+水平脅迫（中度脅迫LS：140mmol/L Na+；重度脅迫 HS：280mmol/L Na+），另外設(shè)置不加鹽對照（CK）。其中，混合鹽為NaCl與Na2SO4按相同Na+占比混合而成，其陰離子所帶電荷量也相同，即NaCl與Na2SO4的摩爾比為2:1。所用化學(xué)試劑均為分析純。培養(yǎng)過程中不間斷向營養(yǎng)液中通入空氣。每5d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至18d時收獲并測定相關(guān)指標(biāo)。

表1 不同處理NaCl和Na2SO4添加量Table 1 The amount of NaCl and Na2SO4 added in different treatments mmol/L

1.2 測定項(xiàng)目及方法

1.2.1 甜菜幼苗生長相關(guān)指標(biāo) 將收獲的甜菜幼苗整株放入烘箱內(nèi)，105℃殺青 35min，然后調(diào)至75℃烘干至恒重，使用分析天平稱重，即為甜菜干重。將甜菜葉片完整剪下，并平鋪在掃描儀上掃描，用 WINRHIZO Reg 2003b分析軟件對掃描后的圖片進(jìn)行分析，計(jì)算甜菜的葉面積[7]。

1.2.2 甜菜光合作用相關(guān)指標(biāo) 利用 95%乙醇研磨提取法測定甜菜葉片的葉綠素a（Chl a）、葉綠素 b（Chl b）、總?cè)~綠素（Chl）及類胡蘿卜素（Caro）含量[8]。用CI-340手持式光合儀（CID公司，美國）測定甜菜第2對真葉凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和細(xì)胞間CO2濃度（Ci）。

1.2.3 甜菜葉片中抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo) 采用抽濾法測定葉片相對電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)法測定丙二醛（MDA）含量；采用氮藍(lán)四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用乙二胺四乙酸法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；采用聚乙烯吡咯烷酮法測定過氧化氫酶（CAT）活性；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[9-10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Office Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及繪圖；用SPSS分析軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對甜菜幼苗生長的影響

鹽脅迫影響植物生長發(fā)育，首先表現(xiàn)在對其生物量的累積上。如圖1a所示，甜菜幼苗在不同中性鹽處理下，其單株干重均有所下降。在 140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的甜菜單株干重與 CK相比分別下降了 12.14%、38.53%和17.93%；280mmol/L Na+濃度下，3個處理分別下降了52.57%、68.94%和57.34%。說明Na2SO4處理對甜菜生物量累積的影響最大，NaCl處理最小。葉面積是重要的形態(tài)指標(biāo)。如圖1b所示，在各組中性鹽處理下，甜菜的葉面積均有所下降。在相同Na+濃度下，NaCl處理的甜菜葉面積較CK下降較少，混合鹽處理次之，Na2SO4處理下降最多，140mmol/L Na+濃度下分別下降了 13.88%、39.31%和 35.07%，280mmol/L Na+濃度下分別下降了54.39%、72.11%和65.01%。

圖1 不同中性鹽處理對甜菜幼苗單株干重和葉面積的影響Fig.1 The effects of different neutral salt treatments on the dry weight per plant and leaf area of sugar beet seedlings

2.2 鹽脅迫對甜菜幼苗葉片光合生理的影響

2.2.1 不同鹽脅迫對甜菜光合色素含量的影響

植物在鹽脅迫下，其體內(nèi)光合色素會趨向分解。如圖2所示，在不同中性鹽脅迫下，甜菜葉片的光合色素含量較CK均有所下降。首先，Chl含量可以直觀地反映NaCl、Na2SO4和混合鹽3種處理對甜菜葉綠素影響的差異。在相同Na+濃度下，NaCl處理的甜菜葉片Chl含量下降最少，混合鹽處理次之，Na2SO4處理下降最多：在140mmol/L Na+濃度下，3個處理分別下降了16.28%、24.15%和35.46%；在 280mmol/L Na+濃度下，分別下降了 39.82%、44.09%和 62.08%。在相同 Na+濃度下，混合鹽和NaCl處理對甜菜Chl a含量的影響差異不顯著，說明二者對甜菜葉片Chl a含量的影響沒有差異。而Na2SO4與混合鹽和 NaCl處理的差異顯著，說明Na2SO4對甜菜的影響較大。同時發(fā)現(xiàn)，在中性鹽處理下，Chl b下降幅度大于Chl a，在140mmol/L Na+濃度下，NaCl處理的Chl a含量下降了4.38%，而Chl b含量下降了31.68%，說明Chl b對中度鹽脅迫更敏感。類胡蘿卜素作為光合色素，不僅參與光合反應(yīng)，還能有效清除葉綠體內(nèi)過剩的激發(fā)能，減少活性氧[11]。結(jié)果（圖2d）顯示，不同中性鹽處理的甜菜葉片Caro含量的變化趨勢與Chl a相似，且Na2SO4處理對甜菜Caro含量的影響更大。

圖2 不同中性鹽處理對甜菜幼苗葉片Chl、Chl a、Chl b及Caro含量的影響Fig.2 Effects of different neutral salt treatments on the contents of Chl, Chl a, Chl b and Caro of leaves of sugar beet seedlings

2.2.2 不同鹽脅迫對甜菜幼苗光合參數(shù)的影響如圖3所示，不同中性鹽處理后，Pn、Tr及Gs均有所下降，而Ci有所上升，且Na2SO4脅迫影響大于NaCl。

圖3 不同中性鹽處理對甜菜幼苗Pn、Tr、Gs和Ci的影響Fig.3 Effects of different neutral salt treatments on Pn, Tr, Gs and Ci of sugar beet seedlings

其中，不同中性鹽對甜菜Pn和Tr的影響差異一致，在140mmol/L Na+濃度下，Na2SO4和混合鹽處理的甜菜Pn無顯著差異（P＜0.05），且Na2SO4和混合鹽處理的甜菜Pn下降幅度大于NaCl處理，甜菜Tr的顯著性差異與Pn表現(xiàn)一致。NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的Pn分別下降了11.90%、46.68%和48.00%，Tr分別下降了18.66%、37.79%和31.73%。與Pn和Tr的變化不同，140mmol/L Na+濃度下，混合鹽和NaCl處理的Gs無明顯差異，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理分別下降了 26.40%、53.29%和18.36%，可見Na2SO4處理的甜菜Gs下降幅度大于混合鹽和NaCl處理，表明Na2SO4對甜菜Gs的影響更大。同時發(fā)現(xiàn)鹽脅迫使甜菜幼苗的Ci顯著升高（P＜0.05），且 Na2SO4處理的變化幅度最大，在140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理依次升高了159.25%、396.93%和276.68%。

2.3 鹽脅迫對甜菜幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

2.3.1 鹽脅迫對甜菜幼苗葉片相對電導(dǎo)率和 MDA含量的影響 結(jié)果（圖4）顯示，隨著鹽脅迫濃度的上升，甜菜葉片相對電導(dǎo)率及MDA含量顯著提高（P＜0.05）；在相同Na+濃度的鹽脅迫下，與CK相比，Na2SO4處理的甜菜積累的MDA更多，相對電導(dǎo)率也更大，混合鹽處理次之，NaCl處理最小。

圖4 不同濃度鹽脅迫下葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量變化Fig.4 Changes of relative conductivity and MDA content in leaves under salt stress of different concentrations

從圖 4a看出，在 140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的甜菜相對電導(dǎo)率較CK分別提高了209.52%、303.91%和236.68%；在280mmol/L Na+濃度下，3個處理的相對電導(dǎo)率較CK分別提高了316.19%、384.04%和348.43%。可以看出，在不同中性鹽處理下，甜菜幼苗葉片相對電導(dǎo)率均顯著提升（P＜0.05），且Na2SO4處理的相對電導(dǎo)率提高幅度最大，即 Na2SO4處理的甜菜膜系統(tǒng)受害程度最嚴(yán)重。

從圖4b看出，甜菜葉片中MDA含量均隨鹽處理濃度的提高而顯著上升（P＜0.05），且Na2SO4處理積累的 MDA明顯較其他 2個處理多。在140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的MDA含量分別較CK提高了20.02%、29.17%和27.53%；在280mmol/L Na+濃度下，3個處理的MDA含量分別較 CK提高了 34.16%、44.22%和37.09%，即隨著鹽濃度的提高，甜菜葉片細(xì)胞脂膜過氧化程度加重，且Na2SO4處理的細(xì)胞脂膜過氧化程度最嚴(yán)重。

2.3.2 鹽脅迫對甜菜葉片抗氧化酶活性的影響

植物受到鹽脅迫時，細(xì)胞內(nèi)會積累大量活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各組分受損。結(jié)果（圖5）表明，甜菜抗氧化酶活性隨著鹽濃度的升高而升高，且 Na2SO4脅迫的甜菜抗氧化酶活性最高，混合鹽處理次之，NaCl處理最低。

SOD是生物體清除活性氧自由基的首要物質(zhì)。如圖 5a所示，在 140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的SOD活性分別比CK提高了2.16%、6.53%和4.10%；280mmol/L Na+濃度下分別提高7.10%、14.36%和10.18%。APX主要負(fù)責(zé)清除植物體內(nèi)的 H2O2，且其反應(yīng)生成物在清除活性氧方面也起到重要作用[11]。由圖5b所示，在140mmol/L Na+濃度下，甜菜葉片APX活性較CK顯著提高（P＜0.05），NaCl、Na2SO4和混合鹽處理分別提高了 61.11%、100.42%和 84.19%。在280mmol/L Na+濃度下，APX活性進(jìn)一步提升，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理葉片APX活性分別提高了120.95%、139.87%和129.22%。由圖5c可見，CAT活性的變化在低鹽和高鹽處理下差異較大：NaCl處理在低鹽和高鹽處理下葉片 CAT活性較CK分別提高了16.78%和41.10%，Na2SO4處理的葉片CAT活性較CK分別提高了30.94%和60.93%，混合鹽處理則分別提高了27.67%和46.41%。

圖5 不同中性鹽處理甜菜SOD、APX、CAT和POD活性的變化Fig.5 The changes in SOD, APX, CAT and POD activities of sugar beet treated with different neutral salts

POD被譽(yù)為植物氧化脅迫的標(biāo)志酶，可以清除線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞液中產(chǎn)生的 H2O2[12]。如圖5d所示，在中度和重度鹽脅迫下，甜菜POD活性均表現(xiàn)為Na2SO4＞混合鹽＞NaCl。

3 討論

3.1 不同鹽脅迫對甜菜幼苗生長及光合生理的影響

植物幼苗干重是衡量植物生長狀況的綜合指標(biāo)之一。研究[7]表明，干物質(zhì)累積量會隨著鹽害程度的增加而減少。本研究發(fā)現(xiàn)，Na2SO4處理的甜菜單株干重下降幅度最大，說明Na2SO4對甜菜的毒害作用最強(qiáng)。甜菜作為草本植物，地上部分主要為葉片，且葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官，因此葉面積既可以表現(xiàn)甜菜的生長情況，又可以反映其光合作用的效率。本研究中，鹽處理的甜菜葉面積較CK均呈下降趨勢，進(jìn)一步證實(shí)甜菜的生長在鹽脅迫下受到抑制，且Na2SO4對甜菜生長發(fā)育的影響大于NaCl和混合鹽。

光合作用能將光能轉(zhuǎn)化為有機(jī)物并放出能量，維持植物生長，對植物的生長發(fā)育具有重要意義。分析光合作用各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下甜菜光合作用受到抑制，且 Na2SO4處理受抑制程度最大，光合色素含量表現(xiàn)為 Na2SO4＜混合鹽＜NaCl。光合色素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，其主要作用為吸收光能，并將光能轉(zhuǎn)化為電能，因此，其含量可以衡量植株對光能的利用率[13]。對甜菜的研究[14]發(fā)現(xiàn)，隨著鹽脅迫程度的加深，其葉片光合色素含量逐漸降低，即鹽脅迫對甜菜的毒害作用越強(qiáng)，光合色素含量下降幅度越大。

另外，根據(jù)Chl a、Chl b和Caro含量變化可以發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對Chl b含量的影響最大，表明Chl b對鹽脅迫更敏感，這可能與甜菜的耐鹽生理機(jī)制有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。而甜菜Chl a和Caro在鹽脅迫下的變化趨勢相近，表明Chl a和Caro對不同中性鹽的響應(yīng)變化一致。

光合作用限制酶主要受到CO2濃度的調(diào)控，因此氣孔是重要的光合限制因子之一。本試驗(yàn)中，不同中性鹽處理的甜菜葉片 Gs均表現(xiàn)為下降，表明鹽脅迫會引起氣孔關(guān)閉。鹽脅迫引起氣孔關(guān)閉的原因分為氣孔限制和非氣孔限制，前者是鹽脅迫引起葉片含水量降低，使氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致Ci下降，進(jìn)而引起光合速率的降低，即光合速率的降低是植物生理調(diào)節(jié)引起的；后者是由于鹽脅迫降低了光合速率，引起Ci升高，進(jìn)而引起氣孔的關(guān)閉，即鹽脅迫直接影響了光合作用[15]。本研究中，Pn、Tr及Gs下降的同時，Ci有所上升，表明光合速率降低的主要原因是非氣孔限制。

3.2 不同鹽脅迫對甜菜幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

植物在逆境中，由于代謝紊亂會產(chǎn)生過量活性氧，造成氧化脅迫。體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)不足以抵消生成的活性氧便會引起細(xì)胞膜氧化損傷[15]，通常用相對電導(dǎo)率和 MDA含量來衡量細(xì)胞膜受損的程度[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的升高，葡萄幼苗的相對電導(dǎo)率和MDA含量呈上升趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，不同中性鹽脅迫下甜菜的MDA含量及相對電導(dǎo)率均顯著高于 CK（P＜0.05），表明不同中性鹽處理甜菜幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性均遭到破壞。同時對比發(fā)現(xiàn)，在相同Na+濃度下，Na2SO4處理的MDA含量和相對電導(dǎo)率變化均較大，混合鹽處理次之，NaCl處理最小。說明Na2SO4處理的甜菜細(xì)胞質(zhì)膜受到鹽脅迫損傷較嚴(yán)重，細(xì)胞膜透性大大提高，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞中的MDA含量增加[18]。

為有效抵御氧化脅迫，植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套抗氧化系統(tǒng)，以防御活性氧和自由基對膜脂的傷害，并有利于維持膜結(jié)構(gòu)的完整性。其中SOD、POD、CAT和APX在抗氧化代謝中起著關(guān)鍵作用[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同中性鹽處理的甜菜幼苗的SOD、APX、CAT和POD活性均明顯高于CK，這與前人的研究[19]結(jié)果相同，說明甜菜在鹽脅迫下，能夠通過累積抗氧化酶來減輕對膜系統(tǒng)的過氧化傷害[20]。抗氧化酶活性隨著鹽濃度的增高而增加，說明隨著鹽害程度的加重，植物需要累積更多的抗氧化物酶來清除過多的活性氧，從而降低細(xì)胞受到的損害，較大程度地維持植物正常生長。而對比相同Na+濃度下3個中性鹽處理的SOD、APX、CAT及POD活性發(fā)現(xiàn)，Na2SO4脅迫的甜菜各類抗氧化酶活性均高于其他二者，說明 Na2SO4脅迫對甜菜幼苗的傷害大于其他處理。

從光合作用和抗氧化酶系統(tǒng)2個方面的分析發(fā)現(xiàn)，甜菜對相同Na+濃度條件下NaCl和Na2SO42種中性鹽的耐受程度不同，由此推測甜菜對 Cl-和SO42-2種陰離子的適應(yīng)機(jī)制可能存在差異。后續(xù)可以針對這一情況進(jìn)行分子水平的研究，探索甜菜對2種離子的適應(yīng)機(jī)制，并進(jìn)一步揭開植物耐鹽機(jī)制。此外，本研究使用水培方式進(jìn)行培養(yǎng)，而在實(shí)際生產(chǎn)中，甜菜栽培主要在土壤中進(jìn)行，土壤成分更加復(fù)雜，SO42-容易與其他物質(zhì)結(jié)合沉淀，進(jìn)而出現(xiàn)與水培不同的生長情況，因此接下來將采取土培方式對其進(jìn)行研究，以期為不同鹽堿地選擇甜菜栽培品種提供更詳盡的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

不同種類中性鹽對甜菜幼苗的影響存在差異。在水培條件下，Na2SO4脅迫對甜菜幼苗的影響大于NaCl脅迫。對光合作用和抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，Na2SO4脅迫對甜菜光合作用抑制及氧化損傷更嚴(yán)重，混合鹽次之，NaCl較輕。