呂家軒，張傳健，王志勝，何 青，王繼春，費(fèi)榮梅

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所，南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；4.常州同泰生物藥業(yè)科技有限公司，常州 213136；5. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）可感染豬、牛、羊、犬、貓、狐等多種動(dòng)物發(fā)生偽狂犬病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、瘙癢、腦脊髓炎和呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)障礙等[1]。豬是PRV的天然宿主，PRV對(duì)新生仔豬危害極大，15日齡內(nèi)仔豬感染致死率可達(dá)100%；此外，PRV可致懷孕母豬流產(chǎn)、公豬睪丸炎以及育肥豬生長(zhǎng)緩慢等[2]。2011年以來(lái)，一種新型PRV變異株在我國(guó)豬群中暴發(fā)流行，其致病力和傳播力顯著高于傳統(tǒng)毒株[3]，甚至引起青年豬和成年豬死亡[4]，傳統(tǒng)疫苗已無(wú)法提供完全的保護(hù)力[3]。

鑒于我國(guó)的集約化養(yǎng)殖現(xiàn)狀，疫苗免疫是控制動(dòng)物傳染病的最有效方式。應(yīng)用變異株同源病毒研發(fā)的基因缺失疫苗（缺失gE/gI、gE/TK、gI/TK等）雖可提供有效保護(hù)力[5]，但對(duì)新生仔豬的安全性還存在隱患[6]，說(shuō)明存在其他毒力基因介導(dǎo)PRV對(duì)豬只的致病性。PRV的UL56與UL43基因同屬于復(fù)制非必需基因，編碼產(chǎn)物均為囊膜蛋白[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，UL56基因可通過(guò)溶酶體途徑介導(dǎo)感染細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物1類分子（major histocompatibility complex-Ⅰ, MHC-Ⅰ）的降解，進(jìn)而阻滯MHC-Ⅰ對(duì)CD8+T細(xì)胞呈遞抗原，產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)[8]；UL43基因具有強(qiáng)烈的抑制膜融合效應(yīng)[9]，其在馬皰疹病毒1型（Equine herpesvirus type 1, EHV-1）中的同源產(chǎn)物可協(xié)助UL56基因下調(diào)感染細(xì)胞MHC-Ⅰ的表達(dá)量[10]。目前尚未見(jiàn)有關(guān)于PRV變異株UL43與UL56基因?qū)Σ《径玖ψ饔玫难芯俊?/p>

本研究運(yùn)用細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC）技術(shù)構(gòu)建了PRV變異株AH02LA UL43與UL56基因失活株：PRV-UL43mut和PRVUL56mut，并分析了其生物學(xué)活性。結(jié)果顯示PRVUL43mut和PRV-UL56mut可在ST細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制。UL43基因在感染細(xì)胞早期可能能夠抑制病毒增殖；UL56基因失活對(duì)病毒生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響。UL56基因可抑制PRV感染豬睪丸（swine testis, ST）細(xì)胞早期MHC-Ⅰ基因轉(zhuǎn)錄水平。UL43與UL56基因失活可降低PRV對(duì)小鼠的致病力。本研究揭示PRV變異株免疫逃逸的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為研制更加安全有效的PRV弱毒疫苗提供新的基因缺失位點(diǎn)參考。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株、細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物PRV變異株AH02LA株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所分離、鑒定并保存[11]；含BACPRV-G的E. coliGS1783由本實(shí)驗(yàn)室以PRV AH02LA為親本毒株構(gòu)建并保存[12]；ST細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存并培養(yǎng)，生長(zhǎng)條件為：DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清+1%青鏈霉素），37℃、5%CO2培養(yǎng)。85只6周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)（合格證編號(hào)：201929986）。

1.2 主要試劑LATaqDNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DL2000 DNA marker、DL10 000 DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司；Trans2K PlusⅡ DNA marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒中提試劑盒（Plasmid Midi Kit）購(gòu)自QIAGEN公司；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（Lipofectamine 3000）購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成UL43mut-KAN F/R與UL56mut-KAN F/R用于擴(kuò)增包含UL43、UL56點(diǎn)突變起始密碼子與KAN抗性基因序列；鑒定引物UL43mutF/R與UL56mutF/R用于擴(kuò)增包含起始密碼子的UL43、UL56基因序列；引物H89 F/R用于擴(kuò)增PRV AH02LA的gE/gI基因序列；引物β-actin F/R與MHC-Ⅰ F/R用于擴(kuò)增ST細(xì)胞的β-actin與MHC-Ⅰ基因片段。引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 重組菌株BACPRV-G-UL43mut和BACPRV-G-UL56mut的獲得參考文獻(xiàn)[6]，以Kan抗性基因?yàn)槟０?，?yīng)用引物UL43mut-KAN F/R與UL56mut-KAN F/R分別擴(kuò)增UL43mut-KAN與UL56mut-KAN序列，PCR回收后，電轉(zhuǎn)入含BACPRV-G的感受態(tài)細(xì)胞GS1783中進(jìn)行第一輪重組，點(diǎn)突變UL43、UL56的起始密碼子同時(shí)插入KAN抗性基因作為篩選標(biāo)記，獲得重組菌株BACPRV-G-UL43mut-Kan與BACPRV-G-UL56mut-Kan。第二輪重組中，2 mL BACPRV-G-UL43mut-Kan和BACPRV-GUL56mut-Kan感受態(tài)菌液中分別加入等量的含2%阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)環(huán)化重組酶表達(dá)，42℃振搖15 min進(jìn)行Red重組以敲除KAN抗性基因，最終通過(guò)抗生素篩選及PCR和測(cè)序驗(yàn)證后，獲得重組菌株。兩株菌株分別對(duì)UL43、UL56的起始密碼子進(jìn)行了點(diǎn)突變，命名為BACPRV-G-UL43mut和BACPRV-GUL56mut。

1.5 重組毒株P(guān)RV-UL43mut、PRV-UL56mut和親本恢復(fù)毒株P(guān)RVrec的獲得與鑒定通過(guò)堿裂解法提取BACPRV-G-UL43mut與BACPRV-G-UL56mutDNA。使用通用型柱式基因組DNA提取試劑盒提取PRV AH02LA基因組DNA，應(yīng)用引物H89 F/R擴(kuò)增同源臂的gE/gI基因序列，回收后通過(guò)Nanodrop 2000進(jìn)行定量測(cè)定，濃度達(dá)200 ng/μL以上時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將約3 μg帶有同源臂的gE/gI基因分別與2 μg BACPRV-G-UL43mut、BACPRV-G-UL56mut以及BACPRV-G的DNA通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染單層ST細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24～48 h觀察到在紫外光（488 nm）激發(fā)下未熒光的病毒蝕斑，連續(xù)挑斑篩選3代，獲得純化重組病毒，命名為PRV-UL43mut、PRV-UL56mut和PRVrec。通過(guò)PCR、測(cè)序檢測(cè)gE/gI基因片段。

1.6 PRV-UL43mut和PRV-UL56mut遺傳穩(wěn)定性鑒定將重組毒株P(guān)RV-UL43mut和PRV-UL56mut在ST細(xì)胞上連續(xù)傳至15代后提取病毒的基因組DNA，分別擴(kuò)增PRV-UL43mut的UL43與PRV-UL56mut的UL56基因序列，測(cè)序鑒定起始密碼子是否保持點(diǎn)突變狀態(tài)。

1.7 PRV-UL43mut和PRV-UL56mut體外生長(zhǎng)特性測(cè)定按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）為0.001將PRV-UL43mut、PRV-UL56mut、PRV AH02LA以及PRVrec接種于單層ST細(xì)胞，分別于感染后6、12、24、36、48、72 h收集細(xì)胞與上清液混合物，經(jīng)-70℃與37℃快速凍融3次，12 000 ×g離心10 min，對(duì)上清液進(jìn)行半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（median tissue culture infective dose, TCID50）檢測(cè)。上述試驗(yàn)重復(fù)3次，使用軟件Graphpad Prism 5繪制生長(zhǎng)曲線，應(yīng)用軟件SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 PRV-UL43mut和PRV-UL56mut感染ST細(xì)胞早期MHC-I轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)按MOI為10接種PRV AH02LA、PRV-UL43mut以及PRV-UL56mut于長(zhǎng)滿單層的ST細(xì)胞，37℃孵育1 h后，棄細(xì)胞上清液并用PBS溶液洗滌3次，然后添加2 mL細(xì)胞維持液（含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)。接種6 h后使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA并應(yīng)用Nanodrop 2000對(duì)樣品進(jìn)行定量及純度檢測(cè)，選取濃度不低于100 ng/μL且OD260/OD280為1.9～2.1的高純度RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。反應(yīng)條件為37℃水浴15 min，85℃反應(yīng)15 s。再以cDNA為模板，使用熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ qRT-PCR擴(kuò)增β-actin和MHC-Ⅰ基因片段。定量PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行溶解曲線分析，95℃預(yù)變性15 s，60℃退火60 s，95℃變性15 s。

上述試驗(yàn)共重復(fù)3次。通過(guò)2-△△Ct法分析基因表達(dá)差異，使用軟件SPSS 11.0對(duì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 PRV-UL43mut和PRV-UL56mut對(duì)小鼠致病力測(cè)定選取85只6周齡雌性BALB/c小鼠并分成五組：PRV-UL43mut組、PRV-UL56mut組、PRVrec組、PRV AH02LA組以及對(duì)照組，其中攻毒組每組20只小鼠，對(duì)照組5只小鼠。先將PRV AH02LA、PRV-UL43mut、PRV-UL56mut和PRVrec四種毒株的滴度統(tǒng)一調(diào)至106TCID50/mL，之后連續(xù)10倍倍比稀釋至10-5，并取10-2-10-54個(gè)稀釋度接種小鼠，每一稀釋度接種5只小鼠。攻毒組每只小鼠皮下注射0.2 mL病毒稀釋液，對(duì)照組按同樣方法接種等量PBS溶液。攻毒后連續(xù)觀察14 d。按Reed-Muench法計(jì)算各毒株對(duì)小鼠的LD50。

2 結(jié)果

2.1 BACPRV-G-UL43mut和BACPRV-G-UL56mut的獲得與鑒定本研究利用二步重組法構(gòu)建重組BACPRV-GUL43mut和BACPRV-G-UL56mut。第一輪重組獲得UL43與UL56基因起始密碼子點(diǎn)突變，同時(shí)插入KAN抗性基因的重組BAC：BACPRV-G-UL43mut-KAN與BACPRV-G-UL56mut-KAN。電泳結(jié)果（圖1）表明，相較于BACPRV-G的UL43與UL56基因序列，以BACPRV-G-UL43mut-KAN與BACPRV-G-UL56mut-KAN為模板擴(kuò)增的基因序列大小均增加約1000 bp。第二輪重組后獲得敲除KAN抗性基因的重組BAC：BACPRV-G-UL43mut與BACPRV-G-UL56mut。PCR（圖1）和測(cè)序結(jié)果表明BACPRV-G-UL43mut的UL43基因與BACPRV-G-UL56mut的UL56基因的起始密碼子均點(diǎn)突變成功。

圖1 KAN抗性基因的插入與敲除鑒定Fig. 1 PCR verification of kanamycin resistance gene insertion and deletion

2.2 重組毒株P(guān)RV-UL43mut、PRV-UL56mut和親本恢復(fù)毒株P(guān)RVrec的獲得與鑒定通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將BACPRV-G-UL43mut、BACPRV-G-UL56mut和BACPRV-G的基因組DNA分別與帶有上下游同源臂的gE/gI基因DNA共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，將BAC中的mini-F基因替換為PRV變異株AH02LA株的gE/gI基因。轉(zhuǎn)染后24 h觀察到在紫外光（488 nm）激發(fā)下不發(fā)出熒光的病毒蝕斑，連續(xù)3輪挑斑后獲得純化的重組病毒，分別命名為PRV-UL43mut（圖2）、PRV-UL56mut（圖3）和PRVrec（圖4），核酸電泳（圖5）和測(cè)序結(jié)果顯示重組病毒的gE/gI基因恢復(fù)成功。

圖2 PRV-UL43mut病毒蝕斑Fig.2 Images of PRV-UL43mut plaques are shown

圖3 PRV-UL56mut病毒蝕斑Fig.3 Images of PRV-UL56mut plaques are shown

圖4 重組毒株P(guān)RVrec純化Fig.4 Images of PRVrec plaques are shown

圖5 重組病毒PRV-UL43mut、PRV-UL56mut與PRVrec gE/gI基因序列PCR鑒定Fig.5 PCR verification of gE/gI gene of PRV-UL43mut,PRV-UL56mut and PRVrec

2.3 重組毒株P(guān)RV-UL43mut和PRV-UL56mut遺傳穩(wěn)定性測(cè)定PRV-UL43mut與PRV-UL56mut在ST細(xì)胞中經(jīng)連續(xù)傳代后，PCR與測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)15代PRV-UL43mut的UL43基因與PRV-UL56mut的UL56基因的起始密碼子均保持點(diǎn)突變狀態(tài)（數(shù)據(jù)未列出）。

2.4 PRV-UL43mut、PRV-UL56mut、PRV AH02LA和PRVrec體外生長(zhǎng)特性分析按指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定病毒感染ST細(xì)胞后細(xì)胞與上清液混合物的滴度。由生長(zhǎng)曲線可知在感染后12 h，PRV-UL43mut滴度（102.8TCID50/mL）相較于親本毒（102.47TCID50/mL，P= 0.094）有升高趨勢(shì)；在感染后48 h，PRV-UL43mut、PRV-UL56mut、PRV AH02LA與PRVrec均達(dá)到滴度峰值，PRV-UL43mut的滴度峰值（107.23TCID50/mL）相較于PRV AH02LA（107.63TCID50/mL，P= 0.067）有下降的趨勢(shì)，但與PRVrec（107.37TCID50/mL，P= 0.500）相比無(wú)顯著性差異；PRV-UL56mut的滴度峰值（107.36TCID50/mL）相較于PRV AH02LA（107.63TCID50/mL，P= 0.195）和PRVrec（107.37TCID50/mL，P= 1.000）無(wú)顯著差異（圖6）。體外生長(zhǎng)特性試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，PRV的UL43基因可能在感染細(xì)胞早期輕微抑制病毒增殖，UL56基因?qū)RV的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著性影響。

圖6 PRV-UL43mut、PRV-UL56mut、PRV AH02LA 和PRVrec體外生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of PRV-UL43mut, PRV-UL56mut, PRV AH02LA and PRVrec

2.5 PRV-UL43mut與PRV-UL56mut對(duì)ST細(xì)胞MHC-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平的影響通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)病毒感染ST細(xì)胞早期（感染后6 h）細(xì)胞MHC-Ⅰ的轉(zhuǎn)錄水平。PRV AH02LA組的細(xì)胞MHC-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對(duì)照組（P=0.000）（圖7），說(shuō)明PRV感染細(xì)胞后能夠抑制MHC-Ⅰ的轉(zhuǎn)錄；PRV-UL43mut組相較于PRV AH02LA組，MHC-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平略有下降，但無(wú)顯著性差異（P= 0.146）；PRV-UL56mut組相較于PRV AH02LA組，MHC-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平顯著提高（P= 0.000），說(shuō)明UL56基因?qū)RV感染早期細(xì)胞的MHC-Ⅰ的轉(zhuǎn)錄過(guò)程抑制作用。

圖7 不同毒株ST細(xì)胞感染6 h MHC-Ⅰ的mRNA表達(dá)Fig.7 MHC-Ⅰ mRNA expression on ST cells at 6 hours after different PRV strains infection

2.6 PRV-UL43mut、PRV-UL56mut、PRV AH02LA和PRVrec對(duì)小鼠致病力分析接種病毒后小鼠死亡情況經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算可知，親本毒PRV AH02LA與親本恢復(fù)毒PRVrec對(duì)小鼠的LD50分別為10-3.26/0.2 mL和10-3/0.2 mL。PRV-UL43mut、PRV-UL56mut對(duì)小鼠的LD50分別為10-2.63/0.2 mL與10-2.19/0.2 mL，較親本毒分別下降約4.27倍與11.75倍，說(shuō)明UL43與UL56基因可能參與PRV對(duì)小鼠的體內(nèi)致病作用（表2）。

表2 小鼠試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of mice test

3 討論

2011年P(guān)RV變異株在我國(guó)暴發(fā)流行，其傳播力與致病性均顯著高于傳統(tǒng)毒株，傳統(tǒng)疫苗已無(wú)法提供完全的免疫保護(hù)；應(yīng)用變異株同源病毒研制的弱毒活疫苗（缺失gE/gI、gE/TK或者TK/gE/gI基因）雖可產(chǎn)生有效保護(hù)力[5]，但對(duì)新生仔豬的安全性仍存在隱患，這提示變異株存在其他毒力基因介導(dǎo)病毒的致病力。目前尚無(wú)針對(duì)變異株UL43與UL56基因失活對(duì)病毒致病力影響的研究報(bào)道。本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)將PRV AH02LA株的UL43和UL56基因失活，探究其是否參與PRV變異株的致病作用，為提高基因缺失疫苗的安全性提供新的靶點(diǎn)。

PRV感染靶細(xì)胞的大致過(guò)程為：病毒吸附并侵入靶細(xì)胞后，合成病毒各成分并裝配成為成熟的病毒粒子，最后釋放并感染鄰近細(xì)胞[7]。當(dāng)病毒粒子在感染細(xì)胞內(nèi)組裝完成繼而在細(xì)胞間傳播時(shí)，UL43基因?qū)Σ《九c細(xì)胞的膜融合起抑制性調(diào)節(jié)作用[13]。體外生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果分析顯示PRV-UL43mut在感染細(xì)胞后的早期階段，即感染12 h，病毒滴度相較于親本毒有升高趨勢(shì)，這可能是由于UL43基因失活后，部分解除了對(duì)病毒在細(xì)胞間傳播時(shí)膜融合的抑制，病毒傳播速度提高，表現(xiàn)為滴度增加。PRV-UL56mut與親本毒的生長(zhǎng)性能相似，說(shuō)明UL56基因可能不參與PRV在ST細(xì)胞中的復(fù)制增殖。

病毒在長(zhǎng)期對(duì)抗宿主免疫系統(tǒng)的過(guò)程中出現(xiàn)免疫逃逸機(jī)制，其中，抑制感染細(xì)胞MHC-Ⅰ的表達(dá)是常見(jiàn)的免疫逃逸手段[14]，病毒可抑制MHC-Ⅰ對(duì)病毒抗原的遞呈，削弱細(xì)胞免疫的水平。PRV UL43基因在EHV-1中的同源產(chǎn)物可協(xié)助UL56基因抑制感染細(xì)胞MHC-Ⅰ的表達(dá)，而PRV UL43基因能否涉及免疫逃逸機(jī)制尚需探究；本研究通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRV的UL43基因?qū)Ω腥炯?xì)胞早期的MHC-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著影響，提示UL43基因可能在MHC-Ⅰ的成熟、運(yùn)輸和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留等階段存在抑制作用。研究表明PRV UL56基因能夠通過(guò)溶酶體途徑介導(dǎo)感染細(xì)胞內(nèi)MHC-Ⅰ的降解[15]，本研究發(fā)現(xiàn)UL56基因在感染細(xì)胞早期可明顯抑制MHC-Ⅰ的轉(zhuǎn)錄，為闡明PRV免疫逃逸機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

對(duì)小鼠致病力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRV的UL43與UL56基因能夠介導(dǎo)病毒對(duì)小鼠的體內(nèi)致病作用。PRVUL43mut攻毒組的LD50較親本毒下降了約4.27倍，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。PRV-UL56mut組的LD50較親本毒株下降了約11.75倍，有研究表明，UL56基因能夠促進(jìn)病毒在宿主神經(jīng)系統(tǒng)中的傳播[16]且對(duì)感染細(xì)胞MHC-Ⅰ表達(dá)具有抑制作用，綜合推測(cè)PRVUL56mut的安全性較PRV-UL43mut更高的原因可能是由于UL56基因在逃逸免疫和神經(jīng)傳播中均發(fā)揮作用。

本研究應(yīng)用細(xì)菌人工染色體技術(shù)構(gòu)建了PRV變異株UL43基因失活株P(guān)RV-UL43mut與UL56基因失活株P(guān)RV-UL56mut。生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UL43基因在感染細(xì)胞早期可能介導(dǎo)抑制病毒增殖；UL56基因?qū)RV增殖無(wú)影響。qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UL56基因在感染細(xì)胞早期能夠明顯抑制MHC-Ⅰ的轉(zhuǎn)錄。對(duì)小鼠致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UL43與UL56基因失活均顯著降低PRV對(duì)小鼠的致病性。為精確驗(yàn)證UL43與UL56是否確實(shí)失活，后續(xù)研究還將應(yīng)用間接免疫熒光和Western blot進(jìn)行鑒定。本研究為研制更加安全有效的PRV變異株基因缺失弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。