張家莉, 楊 陽, 潘 永, 段世宇, 令狐遠(yuǎn)鳳, 楊 琦,3

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴陽 550025；3.貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴陽 550025）

沙門菌（Salmonella），革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科，是重要的人畜共患病原菌。在全世界范圍內(nèi)引起廣泛的危害，對(duì)我國的養(yǎng)殖行業(yè)特別是禽類行業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。sRNA（Small RNAs）長度為50～500個(gè)核苷酸（nucleartide, nt），通常不包含表達(dá)的開放閱讀框。它們存在于生命活動(dòng)的各個(gè)領(lǐng)域且具有多樣性，sRNA在生命活動(dòng)中扮演著調(diào)節(jié)各種細(xì)胞通路的重要角色，并作為調(diào)節(jié)因子發(fā)揮著重要作用，包括應(yīng)激反應(yīng)和毒力網(wǎng)絡(luò)[1-3]。主要以反式編碼調(diào)控sRNA為重要研究對(duì)象，其通過有限且不完美的堿基配對(duì)與靶mRNA相互作用[4]，因此這一類sRNA多數(shù)可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶mRNA的表達(dá)[5]，可激活或抑制靶標(biāo)。sRNA SdsR是固定相sigma因子（σS）調(diào)節(jié)子的成員，腸桿菌中最保守的sRNA之一，以兩種形式存在，一種是全長100 nt sRNA，另一種是經(jīng)過加工的70 nt分子，它存在于大腸桿菌、沙門菌和其他腸桿菌中。據(jù)報(bào)道，SdsR在穩(wěn)定期、滲透休克、熱休克期間大量積累，并且它的表達(dá)與250 nt長的sRNA SraC表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[6]。SdsR可影響膜蛋白的翻譯[7]、抗生素的敏感性[8]、穩(wěn)定期的存活時(shí)間[9]、生物膜的形成[10]、抗生素誘導(dǎo)突變有關(guān)[11]，SdsR還可抑制耐藥外排泵外膜蛋白的基因tolC的表達(dá)，從而降低細(xì)菌對(duì)新生霉素和結(jié)晶紫的抗性[12]。Frohlich等[10]的研究發(fā)現(xiàn)sdsR基因幾乎存在于所有腸桿菌基因組中，并且判斷這個(gè)sRNA一定存在的額外的、保守的靶基因。由此可見，發(fā)掘sRNA SdsR調(diào)控的靶基因以及調(diào)控機(jī)制尤為重要。

由于sRNA序列短，同源性高，利用原始的基因芯片對(duì)sRNA進(jìn)行檢測(cè)十分的困難。NovaSeq系統(tǒng)擁有成熟的Illumina新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)雙端測(cè)序的PE250策略，測(cè)序通量高、深度大[13]。本研究通過IlluminaNovaSeq 6000測(cè)序技術(shù)對(duì)敲除sRNA SdsR后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序和分析，為篩選出sRNA SdsR調(diào)控的靶基因和進(jìn)一步分析其調(diào)控機(jī)制，不但豐富了sRNA SdsR的靶基因數(shù)目，還為后續(xù)沙門菌的致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料野生型鼠傷寒沙門菌株LT2由法國國家科學(xué)研究中心（Centre national de la recherche scientifique, CNRS）分子遺傳學(xué)Bossi惠贈(zèng)；SdsR敲除株（基因型為ΔSdsR::cat）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；RNA提取試劑盒購自貴州海納生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Recombinant NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge））及熒光染料AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix均購自宏達(dá)爾生物科技有限公司；試劑均為分析純。

1.2 SdsR缺失株的鑒定根據(jù)GenBank查詢的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。引物送至生工生物工程（上海）有限公司合成。按照文獻(xiàn)[14]的方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程（上海）技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.3 試驗(yàn)樣本采集將LT2株和SdsR缺失株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600為0.5～0.8），分別取1 mL菌懸液于1.5 mL無酶管中，4℃條件下10 000×g離心2 min，充分去除上清液。將菌體迅速置于液氮中冷凍15 min，冷凍完成后-80℃保存，干冰運(yùn)輸。每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。

表1 驗(yàn)證SdsR基因缺失株引物名稱及序列Table 1 Verification of primer names and sequences of SdsR gene deletion strains

1.4 總RNA提取、文庫構(gòu)建及測(cè)序由上海派森諾生物公司高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室對(duì)樣品進(jìn)行RNA提取，用RNA專用瓊脂糖電泳、Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)總RNA的濃度、純度及完整性檢測(cè)。通過rRNA去除試劑盒去除rRNA，用離子打斷的方式，將RNA打斷至200～300 bp片段并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)文庫大小，熒光定量檢測(cè)文庫總濃度后進(jìn)行Illumina平臺(tái)測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析對(duì)機(jī)下生成的FASTQ的原始數(shù)據(jù)（Raw Data）進(jìn)行篩選，進(jìn)一步過濾一些帶接頭、低質(zhì)量的Reads。數(shù)據(jù)過濾的標(biāo)準(zhǔn)主要包括：（1）采用Cutadapt去除3'端帶接頭的序列；（2）去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Q20（堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占百分比）的Reads。

1.6 差異表達(dá)基因的篩選采用DESeq對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，以表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|＞1，顯著性P-value＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。

1.7 差異表達(dá)基因GO富集分析使用topGO進(jìn)行GO富集分析，分析時(shí)利用GO term注釋的差異基因?qū)γ總€(gè)term的基因列表和基因數(shù)目進(jìn)行計(jì)算，然后通過超幾何分布方法計(jì)算P-value（顯著富集的標(biāo)準(zhǔn)為P-value＜0.05），找出與整個(gè)基因組背景相比，差異基因顯著富集的GO term，從而確定差異基因行使的主要生物學(xué)功能，按照分子功能MF、生物過程BP和細(xì)胞組分CC對(duì)差異表達(dá)的基因的GO富集分析結(jié)果進(jìn)行GO分類。

1.8 差異表達(dá)基因KEGG pathway分析將所有的差異表達(dá)基因注釋到KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫中，統(tǒng)計(jì)出富集到pathway的差異基因總數(shù)、上/下調(diào)基因數(shù)量等。KEGG pathway可以獲得記差異表達(dá)基因參與的代謝通路，可獲得物種內(nèi)分子間相互作用和反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)。

1.9 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證為了驗(yàn)證差異表達(dá)基因結(jié)果的可靠性，分別篩選差異表達(dá)上調(diào)/下調(diào)基因各5個(gè)。上調(diào)基因：STM1050、STM0908、STM0925、STM0926、STM0909；下調(diào)基因：STM3600、STM3599、STM3601、STM2771、STM3598。根據(jù)GenBank提供的基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)基因的熒光引物，以GAPDH作為內(nèi)參基因（表4）。驗(yàn)證差異表達(dá)基因熒光引物的特異性后按照文獻(xiàn)[15]的方法提取標(biāo)準(zhǔn)株LT2和SdsR缺失株的總RNA樣本，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 SdsR缺失株的鑒定對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株LT2和SdsR缺失株進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及測(cè)序分析。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，LT2株和SdsR缺失株擴(kuò)增出的特異性條帶分別為433 bp和1343 bp（圖1），長度為103 bp的SdsR基因片段已成功缺失。測(cè)序結(jié)果顯示（圖2），SdsR基因成功被cat基因替換。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplified products

圖2 測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing results

2.2 RNA樣品質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果對(duì)RNA樣品進(jìn)行濃度及OD260/280值進(jìn)行測(cè)定。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的總RNA濃度要求在40 ng/μL以上，OD260/280介于1.8～2.1說明總RNA樣本純度較高。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組3個(gè)重復(fù)的樣本濃度均在420 ng/μL以上（表3），OD260/280值均超過2.0，說明純度較高，且RNA總量為31～46 μg，滿足2次或者2次以上建庫需要，符合建庫。

表2 差異表達(dá)基因熒光引物序列Table 2 Sequences of fluorescent primers for differentially expressed genes

表3 RNA樣品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)Table 3 RNA sample quality control standards

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析測(cè)序的數(shù)據(jù)顯示，Q30（堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基總數(shù)）均高于93.48%，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的高質(zhì)量序列（Clean Reads%）占測(cè)序總序列的百分比均為91%以上（表4）。表明數(shù)據(jù)處理后的序列質(zhì)量較高，可以進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序分析。通過Bowtie2建立參考基因組索引，然后使用Bowtie2（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）將過濾后的Reads比對(duì)到參考基因組上。結(jié)果顯示，有超過81.17%的序列能夠?qū)Ρ鹊絽⒖蓟蚪M，在參考基因組上能對(duì)比到一個(gè)位置的序列數(shù)超過93.35%，約4%的有效序列能找到多個(gè)比對(duì)位置（表5）。說明Reads平均質(zhì)量分布良好。以上結(jié)果說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，無污染。參考基因組信息可以進(jìn)行后續(xù)分析。

表4 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)Table 4 Data filtering statistics

表5 RNASeq Map 統(tǒng)計(jì)Table 5 RNASeq Map statistics

2.4 差異基因的篩選采用DESeq對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組共篩選出差異表達(dá)基因127個(gè)（上調(diào)基因53個(gè)，下調(diào)基因74個(gè)）。分別篩選10個(gè)上、下調(diào)顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行排序（表6）。其中上調(diào)基因中以STM1050表達(dá)變化差異最大；下調(diào)基因中STM3600表達(dá)變化差異最大，該基因與激酶活性（kinase activity）、磷酸化（phosphorylation）有關(guān)。上調(diào)基因中說明敲除sRNA SdsR后的差異顯著基因主要影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、磷酸化的活性以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)。

表6 上/下調(diào)差異表達(dá)基因top10Table 6 Up/down-regulation of differentially expressed genes top10

2.5 顯著差異表達(dá)基因GO及KEGG富集分析將差異表達(dá)基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，按照細(xì)胞組分CC、分子功能MF和生物過程BP進(jìn)行GO分類。分別篩選各個(gè)分類中富集最顯著即P-value最小的5個(gè)生物學(xué)功能進(jìn)行排序（圖3）。差異表達(dá)基因主要富集生物過程、分子功能、蜂窩組件等684個(gè)GO Term，包括231類分子功能MF，400類生物過程BP、54類細(xì)胞組分CC。分子功能MF中丙二醇脫水酶活性的富集程度最高，細(xì)胞組分CC中富集程度最高的是胞外區(qū)。生物過程BP中二醇分解代謝過程、乙二醇分解代謝過程、丙二醇代謝過程富集程度最顯著，在所有GO分類中，前20個(gè)富集最明顯的分類中生物過程BP占了16個(gè)，說明差異表達(dá)基因主要參與醇類的代謝。將差異表達(dá)基因注釋到KEGG pathway代謝通路，以代謝、環(huán)境信息處理、人類疾病等6個(gè)類別進(jìn)行Category分類，通過Pathway的P-value即富集的顯著程度進(jìn)行排序（圖4）。顯著差異表達(dá)基因分別富集到丙酸代謝、雙組分系統(tǒng)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等27個(gè)pathway代謝通路中，其中富集程度最為顯著的是丙酸代謝Pathway信號(hào)通路。

圖3 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of differently expressed genes

圖4 差異表達(dá)基因KEGG pathway分析Fig.4 Analysis of differently expressed genes KEGG pathway

2.6 顯著差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證分別選擇5個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因，對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，可知差異表達(dá)基因的驗(yàn)證結(jié)果與DEseq的結(jié)果基本一致（圖5），證明了DESeq結(jié)果可靠。

圖5 差異表達(dá)基因qRT-PCR試驗(yàn)Fig.5 qRT-PCR test of differentially expressed genes

3 討論

sRNA SdsR屬于反式編碼調(diào)控sRNA，反式編碼調(diào)控sRNA具有正/負(fù)調(diào)節(jié)作用，其中負(fù)調(diào)節(jié)作用最為常見，靶基因的表達(dá)被抑制。而本次結(jié)果研究顯示，在SdsR敲除的前提下，有74個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)量下調(diào)，超過差異表達(dá)基因總數(shù)的50%，表明sRNA SdsR對(duì)其調(diào)控的部分基因有正調(diào)控的作用，但具體的調(diào)控機(jī)理需要進(jìn)一步的深究。sRNA SdsR最初以 RyeB 名稱報(bào)道，是σS調(diào)節(jié)子的成員，σS控制著一種全局適應(yīng)性反應(yīng)，使許多革蘭氏陰性菌能夠在饑餓和各種壓力下存活，σS有助于食源性病原體鼠傷寒沙門菌的生物被膜和毒力的形成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)該sRNA調(diào)節(jié)的靶基因具有不同功能，包括代謝調(diào)節(jié)（artI、asd和dlhH）、熱休克反應(yīng)（htpG）、質(zhì)子動(dòng)力產(chǎn)生（yhcB）和解毒（yibF）等。在本次的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果顯示，篩選出的可能靶基因主要參與丙酸代謝、雙組分系統(tǒng)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氰基氨基酸代謝等27個(gè)通路，表明受SdsR調(diào)控的基因大部分與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。GO富集分析表明SdsR的靶基可以調(diào)控眾多生物學(xué)功能，這些生物學(xué)功能有共同調(diào)節(jié)二醇分解代謝過程、乙二醇分解代謝過程、丙二醇分解代謝過程等，導(dǎo)致這些代謝功能富集程度最顯著。同時(shí)結(jié)合GO和KEGG富集分析的結(jié)果來看，sRNA SdsR的靶基因很可能通過參與醇-類的代謝活化氨基酸。

本研究在轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的基礎(chǔ)上分別選擇5個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因并對(duì)其進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果為qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。其中STM1050、STM0925、STM0926基因編碼的生物學(xué)功能尚不明確。STM0909是LT2的特異性基因，編碼功能未知的假設(shè)蛋白質(zhì)，STM0909可能是通過水平轉(zhuǎn)移事件獲得的[16]。Han等[17]還發(fā)現(xiàn)STM0909可以編碼Fels-1原噬菌體蛋白。Bryan等[18]鑒定了STM3600為毛皮調(diào)節(jié)子，受毛皮的直接控制。STM2771（fijb）是鼠傷寒沙門菌第二階段的鞭毛蛋白基因[19]，可通過TLR5和Ipaf依賴性途徑刺激NF-kB激活和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）分泌[20]，且FljB的產(chǎn)生導(dǎo)致全身感染小鼠模型中的毒力減弱[21]。Thijs等[22]在其轉(zhuǎn)錄組結(jié)果及分析中描述到STM3598基因編碼L-天冬酰胺酶，與本研究的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果一致，除此之外，STM3598還影響谷胱甘肽二硫化物還原酶活性、抗氧化活性等。sRNA SdsR敲除后細(xì)菌的生理活動(dòng)發(fā)生了極復(fù)雜的變化，說明sRNA SdsR可能通過對(duì)其靶基因的調(diào)控來調(diào)節(jié)沙門菌的各個(gè)代謝途徑從而調(diào)節(jié)細(xì)菌的生命活動(dòng)。但這些基因是否是sRNA SdsR的靶基因，sRNA SdsR是通過什么復(fù)雜的過程來調(diào)控這些靶基因，以及通過哪些位點(diǎn)與其靶基因結(jié)合，sRNA SdsR對(duì)沙門菌物質(zhì)代謝作用機(jī)制等需要更深一步的研究驗(yàn)證。

本研究對(duì)sRNA SdsR敲除后的轉(zhuǎn)錄組情況進(jìn)行了詳細(xì)的分析，同時(shí)篩選出127個(gè)差異表達(dá)基因，通過熒光定量PCR驗(yàn)證差異變化顯著的5個(gè)上、下調(diào)基因，為探究sRNA SdsR與靶基因互作及挖掘關(guān)鍵基因提供豐富的基礎(chǔ)信息，為更深入了解sRNA SdsR的作用機(jī)制及沙門菌的防控工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。