朱樂欣，古 云，王軍兆，方 春，蔣小武

（1.宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院，宜春 336000；2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，荊州 434025）

豬鏈球菌（Streptococcus suis, S. suis）是一種人畜共患的革蘭氏陽性球菌，可感染人畜誘發(fā)敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及嚴(yán)重的炎癥因子風(fēng)暴[1-3]。我國于1998年和2005年在江蘇和四川暴發(fā)了兩次豬鏈球菌感染公共衛(wèi)生事件，造成大量的豬群和多人患病死亡[4-5]。根據(jù)細(xì)菌莢膜多糖（capsular polysaccharides,cps）的多樣性，豬鏈球菌至少分成35個血清型（1-34，1/2），國內(nèi)外流行率與發(fā)病率較高是豬鏈球菌2型[6-7]。

豬鏈球菌疫苗是防控豬鏈球菌感染的關(guān)鍵，尤其是可提供交叉保護(hù)多種感染性血清型的通用疫苗已成為當(dāng)下豬鏈球菌疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[8]。活疫苗具有保護(hù)性穩(wěn)定、生產(chǎn)成本與副作用低等優(yōu)勢，但由于豬鏈球菌2型致病性強(qiáng)，分布廣泛，直接使用2型豬鏈球菌作為活疫苗候選株存在返強(qiáng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。課題組前期分離獲得一株非2型豬鏈球菌HN152菌株，經(jīng)血清型鑒定為31型[10]。本研究旨在分析豬鏈球菌31型HN152菌株的相關(guān)生物學(xué)特征、致病效應(yīng)及其對豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株感染的交叉保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑豬鏈球菌2型HA9801菌株由浙江大學(xué)方維煥教授饋贈；腦心浸出液（BHI）購自O(shè)XOID公司；PCR擴(kuò)增酶與克隆試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM或1640基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液、雙抗及胎牛血清FBS等購自Gibico公司；BALB/c小鼠購自上海斯萊克公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；LIVE/DEAD細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Invitrogen公司；乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；ECL發(fā)光底物試劑盒購自Thermo公司；HEp-2與bEND3.0細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 豬鏈球菌31型HN152菌株血清型特異基因與毒力基因鑒定水煮法提取HN152與HA9801細(xì)菌基因組，保存?zhèn)溆?。NCBI檢索豬鏈球菌31型莢膜多糖基因cps31L與豬鏈球菌傳統(tǒng)毒力標(biāo)志因子MRP、SLY、EF核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因片段。對cps31L基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆、測序，以DNAStar軟件進(jìn)行同源性比對。相關(guān)引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物Table 1 Primers used in this study

1.3 黏附試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法進(jìn)行豬鏈球菌細(xì)胞黏附試驗(yàn)。HEp-2細(xì)胞以2.0×105個/孔的密度接種至含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。挑取HA9801與HN152單菌落于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，并以10 mmol/L PBS洗滌2次，調(diào)節(jié)細(xì)菌懸濁度OD600至0.4，倍比稀釋法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。取出HEp-2細(xì)胞，加入預(yù)熱的10 mmol/L PBS洗滌1次。以感染比（MOI=100:1）加入細(xì)菌懸液與細(xì)胞完全培養(yǎng)液，輕輕搖勻，300 ×g離心5 min，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中作用2 h。取出培養(yǎng)板，10 mmol/L PBS洗滌4次，除去胞外游離未黏附細(xì)菌?？變?nèi)加入1 mL ddH2O，室溫放置10 min，待細(xì)胞裂解后，收集裂解液，振蕩混勻并進(jìn)行梯度稀釋，接種于BHI平板上，37℃過夜培養(yǎng)，并進(jìn)行黏附菌計(jì)數(shù)。每種處理重復(fù)3個孔，黏附試驗(yàn)重復(fù)3次，黏附率計(jì)算公式為：黏附率（%）=（胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)+胞外細(xì)菌數(shù)）/加入孔內(nèi)的細(xì)菌數(shù)×100%。黏附拮抗試驗(yàn)步驟同本法，不同之處在于SS2感染菌HA9801需要預(yù)先以10%滅活的HN152小鼠高免血清與免前血清37℃處理0.5 h，設(shè)置無血清PBS處理對照。

1.4 細(xì)胞毒性檢測小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd3.0細(xì)胞以2.5×105個/孔的密度，接種于24孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合度90%左右備用。以MOI為100∶1加入不同細(xì)菌懸液，并同時設(shè)置PBS與0.2%Triton X-100處理作為陰性與陽性對照。37℃培養(yǎng)2 h，收集不同感染細(xì)胞上清液，以乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒（LDH Cytotoxicity Assay Kit）檢測細(xì)胞毒性?？變?nèi)細(xì)胞以PBS洗滌2次，加入LIVE/DEAD細(xì)胞毒性熒光染料暗室作用5 min，熒光顯微鏡下觀察活細(xì)胞與死細(xì)胞的相對比例。

1.5 小鼠致病性分析挑取HA9801與HN152單克隆于BHI培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，PBS重懸。將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，分別以HA9801絕對致死量（約1.0×109CFU/mL）當(dāng)量的菌液腹腔接種于小鼠體內(nèi)，1 mL/只，陰性對照組注射無菌PBS。各試驗(yàn)組小鼠隔離飼養(yǎng)，每天給予充足的飲水和飼料，每隔半天觀察小鼠的發(fā)病特征，記錄死亡情況，連續(xù)觀察1周。統(tǒng)計(jì)各組小鼠存活率，并采用Graphpad軟件繪制存活曲線。

1.6 免疫保護(hù)試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行小鼠模型免疫保護(hù)試驗(yàn)。隨機(jī)選取5周齡雌性BALB/c小鼠36只，分成3組（分別為免疫組、未免疫組和空白組），每組12只。各組分別接種2次（首免與二免間隔時間為2周），其中免疫組小鼠皮下接種豬鏈球菌31型HN152活菌（約1.0×108CFU/mL），未免疫組與空白對照組分別接種等量的PBS，每只小鼠接種量為1 mL。14 d后各組小鼠加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫第10 d（即24 d）時，對各組小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒菌株為豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株HA9801，接種劑量為1×109CFU/mL。每天早晚觀察2次，持續(xù)1周，記錄小鼠發(fā)病情況和病死數(shù)，繪制小鼠存活曲線。整個試驗(yàn)過程中，各組小鼠首免前、14 d加強(qiáng)免疫前及24 d攻毒前分別進(jìn)行眼眶采血，收集血清。以HN152全菌作為包被抗原（100 μg/孔），以首免前血清作為陰性對照血清，PBS作為空白對照，ELISA方法測定不同時間點(diǎn)免疫小鼠抗體效價(jià)變化。

1.7 血清交叉反應(yīng)性分析采用參考文獻(xiàn)[13]的方法提取豬鏈球菌表面蛋白。收集對數(shù)生長期的HA9801與HN152菌體，PBS洗滌2次，加入1 mL豬鏈球菌表面蛋白提取液（配方為30 mmol/L Tris-HCl，pH7.5；2 mmol/L MgCl2；25%R: sucrose；3 mg/mL lysozyme；5 mmol/L PMSF），37℃水浴孵育1 h，4℃條件下12 000×g離心10 min，上清液即為豬鏈球菌表面蛋白提取物。BCA法定量提取物蛋白濃度。上樣10 μg的HN152和HA9801表面蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件為80 V，0.5 h，120 V，1.5 h。跑膠后進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為30 V，16 h。取出PVDF膜，以5%脫脂奶粉的TBST溶液37℃封閉2 h，TBST洗滌3次。加入一抗，抗體為不同時間點(diǎn)（0、14 d和24 d）收取的HN152小鼠抗血清，血清稀釋倍數(shù)為1∶200，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次。加入羊抗鼠HRP標(biāo)記抗體（1∶2000），37℃孵育1 h，TBST洗滌5次，再進(jìn)行ECL曝光，分析HN152活菌免疫小鼠血清與菌體表面蛋白的反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 豬鏈球菌31型HN152菌株不含毒力因子SLY、MRP與EF為確證實(shí)驗(yàn)室分離獲得的豬鏈球菌菌株HN152是否為31型，進(jìn)行血清型特異基因cps31L檢測，PCR結(jié)果顯示HN152菌株cps31L陽性，其與已公布的其他菌株對應(yīng)核苷酸序列同源性為99.4%，HN152菌不含傳統(tǒng)毒力標(biāo)志因子（即Sly-MRP-EF-）（圖1）。

圖1 HN152菌株cps31L基因與毒力因子鑒定Fig.1 cps31L and virulence gene identification in HN152 strain

2.2 HN152菌株黏附力高為分析HN152的感染特征進(jìn)行體外細(xì)胞黏附試驗(yàn)。結(jié)果顯示：HN152菌株對上皮細(xì)胞黏附力強(qiáng)，黏附力是2型豬鏈球菌HA9801的3.4倍，差異極顯著（P＜0.01）（圖2），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 黏附試驗(yàn)Fig.2 Adherence assay

2.3 HN152菌株致病性低體外細(xì)胞感染試驗(yàn)檢測不同菌株處理的細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)：豬鏈球菌31型HN152感染bEND3.0細(xì)胞病變不明顯，與PBS對照組細(xì)胞形態(tài)基本一致，細(xì)胞活性定量檢測分析發(fā)現(xiàn)死亡細(xì)胞比例極低，與對照組差異不明顯（P＞0.05），而HA9801強(qiáng)毒菌株誘導(dǎo)細(xì)胞腫脹、破裂，2 h時大部分細(xì)胞形態(tài)不完整，定量分析死亡細(xì)胞達(dá)56.8%，這說明HN152的細(xì)胞毒性極顯著低于高致病2型菌株HA9801（圖3A，3B）。小鼠感染模型結(jié)果顯示：SS2-HA9801感染組小鼠12 h左右即出現(xiàn)扎堆、被毛凌亂、行動遲緩與精神萎靡等臨床癥狀，2 d內(nèi)小鼠完全死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)有典型的敗血癥與腦膜炎癥狀；而SS31-HN152感染組小鼠癥狀輕微，臟器病變

不明顯，沒有出現(xiàn)小鼠死亡（圖3C）。上述體內(nèi)、體外致病性試驗(yàn)結(jié)果說明：豬鏈球菌HN152菌株致病性極低，具備活疫苗載體的基本特質(zhì)，可用于進(jìn)一步分析其免疫保護(hù)作用。

圖3 HN152致病性分析Fig.3 Pathogenicity assessment of HN152 strain

2.4 HN152活菌免疫介導(dǎo)交叉保護(hù)SS2感染BALB/c小鼠經(jīng)HN152活菌皮下免疫2次，血清中HN152全菌抗體效價(jià)可達(dá)1∶12 800倍以上（圖4A），免疫印跡結(jié)果說明HN152全菌有效刺激機(jī)體產(chǎn)生了相應(yīng)抗體（圖4B）。攻毒保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：未免疫對照組小鼠完全死亡，而HN152菌株免疫組小鼠僅死亡1只，存活率達(dá)91.7%，說明HN152活菌免疫可保護(hù)小鼠抵抗豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株HA9801的感染（圖4C）。為分析HN152活菌跨血清型保護(hù)2型豬鏈球菌感染的原因，進(jìn)行免疫血清交叉反應(yīng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)：HN152活菌首免血清即可與SS2菌株表面蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，加強(qiáng)免疫的血清與SS2菌株表面蛋白結(jié)合的種類與豐度均更高（圖4C），這暗示SS31-HN152與SS2-HA9801兩株菌存在許多共有表面抗原。以HN152活菌免疫產(chǎn)生的抗體預(yù)處理SS2感染菌，發(fā)現(xiàn)處理后的細(xì)菌對上皮細(xì)胞的黏附力明顯下降，這說明HN152活菌免疫可有效抵御SS2強(qiáng)毒菌的黏附效應(yīng)（圖4D）。

圖4 免疫保護(hù)作用分析Fig.4 Immuno-protection assay

3 討論

血清2型是豬鏈球菌分布最廣與毒力最強(qiáng)，是目前暴發(fā)過人獸共患嚴(yán)重公共衛(wèi)生事件的血清型[6,14]。疫苗是防控細(xì)菌性傳染病的主要手段之一，但現(xiàn)有的豬鏈球菌疫苗存在很多弊端。常用的豬鏈球菌2型滅活苗往往需要多次免疫，副作用大，免疫保護(hù)效果不穩(wěn)定，對非2型流行性血清型感染常常無效，大量的亞單位疫苗候選抗原被篩選出來，但普適性差，對不同地域或血清型間的強(qiáng)毒菌株防御效果差異很大，離商品化還有一定距離[8,15-16]。篩選高效安全、生產(chǎn)成本低且可跨血清型介導(dǎo)交叉保護(hù)作用的非2型豬鏈球菌活疫苗候選株，成為豬鏈球菌疫苗研制的方向之一。

本研究成功鑒定獲得了一株豬鏈球菌31型的HN152活疫苗候選株，該菌低毒、不含相關(guān)毒力標(biāo)記因子，可介導(dǎo)交叉保護(hù)SS2強(qiáng)毒株的感染。HN152高免血清與SS2表面蛋白有較好的交叉反應(yīng)性，兩個血清型對應(yīng)的菌株存在共有表面抗原，這些保守性表面抗原有效誘導(dǎo)機(jī)體形成的抗體可能是介導(dǎo)小鼠抵抗SS2感染的關(guān)鍵因素。另外，黏附作用是細(xì)菌與宿主互作的關(guān)鍵步驟，SS2通過黏附作用定植在宿主細(xì)胞表面，強(qiáng)毒菌株可突破屏障誘發(fā)更深層次的感染，而弱毒株則依賴該過程誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)[14,17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)HN152活菌免疫形成的高免血清可以抑制SS2感染菌的黏附作用，降低強(qiáng)毒株的致病效應(yīng)，而且HN152活菌本身致病性極低，黏附力強(qiáng)，這將有力促進(jìn)活菌持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生特定免疫反應(yīng)。關(guān)于HN152活菌對其他非2型流行性血清型的免疫保護(hù)作用，挖掘其與豬鏈球菌2型的共有免疫原蛋白及其在仔豬模型上的保護(hù)效應(yīng)是下一步研究的重點(diǎn)。