劉宏偉，楊名平，江鋒，蘇國成，周常義

(1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.廈門中集信檢測技術(shù)有限公司，福建 廈門 361100)

0 引言

目前，全球抗生素年使用量超過10萬t，這日益增加了人們對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)污染問題的擔(dān)憂[1-2]。中國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國和消費國，隨著抗生素在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，含有抗生素的禽畜糞便通常被作為肥料施用于土壤中[3]，大量抗生素通過排泄的方式進入到環(huán)境基質(zhì)中，繼而也可能從土壤轉(zhuǎn)移到作物，對人類的身體健康構(gòu)成潛在危害[4-5]。最終，抗生素通過動物糞便被引入土壤[6-7]，導(dǎo)致土壤中抗生素殘留日益增加。因此，畜牧業(yè)抗生素的廣泛使用是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)環(huán)境污染的主要因素之一[8]。

Pan等[9]在我國黃淮海平原4個省(市)收集了105個土壤樣品，包括13組土壤剖面樣品和23對溫室及露地表層土壤樣品，檢出的抗生素有四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類，抗生素總質(zhì)量比為1.62～575 mg/kg。Zhang等[10]為研究長期施用有機肥導(dǎo)致的抗生素污染，對我國東部、西部地區(qū)125個表層土壤進行了多種抗生素的采樣分析，結(jié)果表明，農(nóng)用地抗生素濃度的累積量顯著高于常規(guī)露地。Zhang等[11]采集中國8個省份的50份糞便和堆肥樣品，檢測發(fā)現(xiàn)，在雞糞樣本中四環(huán)素質(zhì)量比高達(dá)417 mg/kg。有人報道了動物糞便中普遍存在的氟喹諾酮類殘留[12-15]。潘霞等[16]剖析了在種植水果蔬菜的土壤中使用畜禽糞便制成的有機肥料后，發(fā)現(xiàn)不同作物的表層土壤中蓄積的氯霉素類含量占比不同，最高可達(dá)30.3%。

抗生素通過畜禽糞便施肥及廢水灌溉農(nóng)田進入土壤后，會在土壤與植物之間發(fā)生遷移轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，使用含有畜禽糞便廢水灌溉的農(nóng)田土壤中生長的植物，其組織內(nèi)可以檢測到一定量的抗生素。Dolliver等[17]在糞肥改良土壤生長的玉米、生菜和馬鈴薯中檢測到了μg/kg～mg/kg(干重)水平的磺胺二甲嘧啶。Kang等[18]檢測了糞肥改良的土壤中生長的11種蔬菜中的5種抗生素，其中磺胺二甲嘧啶、金霉素、泰樂菌素等抗生素在植物組織中的濃度都在μg/kg水平。Hu等[19]研究了使用畜禽糞便施肥過的田地，發(fā)現(xiàn)油菜、香菜、胡蘿卜、芹菜等對11種抗生素有吸收積累的情況，在蔬菜中檢出濃度較高的抗生素是土霉素和四環(huán)素，分別為76.8和79.3 μg/kg。

我國已經(jīng)制定了肉類食品中抗生素最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)及其檢測方法[20]，但對于蔬菜中抗生素含量尚未出臺相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究選取9種常用的抗生素，研究多種抗生素在上海青中殘留同時測定的檢測方法，為抗生素多殘留的定量分析和安全風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

乙腈，色譜純/分析純，德國默克試劑公司；氯化鈉、無水硫酸鈉，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸，分析純，德國默克試劑公司；甲酸，色譜純，德國默克試劑公司；氧氟沙星(>99%)、達(dá)氟沙星(>99%)、洛美沙星(>99%)、培氟沙星(>99%)、環(huán)丙沙星(>99%)、恩諾沙星(>99%)、氯霉素(>97%)、甲砜霉素(>97%)、氟苯尼考(>97%)均購自賽飛爾公司；氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/L，1 mL)，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心。

1.1.2 主要儀器

UItiMate 3000型超高效液相色譜儀，TSQ Endura型三重四極桿質(zhì)譜儀，均為賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 樣品來源

上海青購自廈門市同安區(qū)蔬菜市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量上海青2 g(精確至0.1 g)，置于干凈的50 mL具蓋離心管中，加10 ml乙腈溶液、5.0 g無水Na2SO4、3 g NaCl進行鹽析，渦旋1 min，超聲提取10 min后，8 000 r/min離心3 min，充分分離。取上清液置于另一干凈的50 mL具蓋離心管中。離心后的殘渣再加入10 mL乙腈提取溶液。重復(fù)上述步驟，合并提取液，加入0.1 g C18、0.1 g PSA粉末，渦旋1 min，5 000 r/min離心3 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL空白具蓋離心管中，40 ℃加熱氮吹至近干，用1.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸-乙腈溶液復(fù)溶，過0.22 μm有機濾膜，供UPLC-MS/MS檢測。

1.2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.2.2.1 液相色譜條件

正離子模式。流動相：C為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的超純水，D為乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%；1～11 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～84%；11～11.5 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84%～95%；11.5～12.5 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%；12.5～13 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%～5%；13～16 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。

負(fù)離子模式。流動相：A為超純水，D為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%；0.5～3.5 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～95%；3.5～4.3 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%；4.3～4.5 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%～20%；4.5～7.0 min，D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離ESI+和電噴霧電離ESI-；噴霧電壓為3.5 kV(ESI+)和3.2 kV(ESI-)；鞘氣壓為35 Arb(ESI+)和30 Arb(ESI-)；輔助氣壓為15 Arb(ESI+)和10 Arb(ESI-)；離子傳輸管溫度為320 ℃(ESI+)和300 ℃(ESI-)；噴霧溫度為300 ℃(ESI+)和250 ℃(ESI-)。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

色譜儀的優(yōu)勢在于能夠較為準(zhǔn)確地從混合物中分離出目標(biāo)化合物，但是物質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)信息卻很難得到，所以質(zhì)譜儀主要依靠樣品與標(biāo)準(zhǔn)物的對比來對未知物質(zhì)進行分析。因此，在進行質(zhì)譜分析之前，質(zhì)譜儀要先建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫，才能高效、高選擇性、高靈敏度地進行分析。常見的質(zhì)譜儀主要有磁偏轉(zhuǎn)式質(zhì)譜、四極桿質(zhì)譜(Q-MS)、離子阱質(zhì)譜(IT-MS)、飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS)5種類型。本文使用賽默飛世爾公司 UltiMate 3000 超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀進行分析。

為獲得最佳靈敏度和分離效果，對12種單標(biāo)溶液依次采取蠕動泵注射的方式進行一級質(zhì)譜掃描，掃描結(jié)果如圖 1～圖2 所示。

由圖1～圖2可見，在正離子模式下，喹諾酮類抗生素形成穩(wěn)定的峰，氯霉素類抗生素在負(fù)離子模式下形成響應(yīng)強且穩(wěn)定的峰。依次優(yōu)化碰撞電壓和射頻透鏡電壓，選取豐度較高的母離子、子離子，最終確定定性定量離子和碰撞電壓的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(見表1)。

表1 9種抗生素及抗生素內(nèi)標(biāo)的 UPLC-MS/MS 分析優(yōu)化參數(shù)

2.2 提取條件優(yōu)化

參照文獻[21]喹諾酮的提取方法和文獻[22]多種抗生素的提取方法，由于9種目標(biāo)抗生素的理化性質(zhì)差異較大，本研究在優(yōu)化提取溶液時，使用加標(biāo)樣品比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、冰乙酸4種不同的提取溶劑，結(jié)果表明，乙腈溶液在同時提取氯霉素類和氟喹諾酮類抗生素時的回收率最高，結(jié)果如圖3～圖4所示。

2.3 凈化方法優(yōu)化

樣品經(jīng)過萃提過程,實際上已經(jīng)初步去除部分干擾物質(zhì)，但仍需凈化處理。蔬菜中的農(nóng)藥獸藥殘留檢測常用的凈化方法包括固相萃取法和QuEChERS法，本文QuEChERS法使用PSA和C18 2種材料作為吸附劑，固相萃取法選擇固相萃取柱HLB(60 mg，3 mL)。C18材料具有疏水性特點，其有效組分為十八烷基的硅膠鍵合物，對去除提取液中脂肪和非極性成分具有良好的效果[23]。PSA材料有效組分為極性官能團的硅膠鍵合物，能與弱陰離子交換,也可吸附極性物質(zhì)，對色素、有機酸和金屬離子含量較高的樣品有很好的凈化效果[24]。Oasis HLB是一種反相固相萃取柱，它能很好地保留酸性、堿性和兩性化合物；填料是一種多孔共聚物，其成分是親水性N-乙烯基吡咯烷酮和親脂性二乙烯苯，因此對目標(biāo)化合物的富集效果要優(yōu)于其他固相萃取柱[25]。

本文以上海青為基質(zhì)，比較了固相萃取法和QuEChERS法對9種化合物的凈化情況，結(jié)果見圖5～圖6。結(jié)果表明，相比于QuEChERS法固相萃取法，培氟沙星、甲砜霉素的回收率略低。原因是加入樣液后，與水或乙腈這些極性較大的溶劑同時存在，柱壓升高，柱體堵塞，回收率降低。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析中產(chǎn)生誤差的重要來源，任何一種物質(zhì)的檢測都無法避免基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象[26]。按照優(yōu)化的實驗方法，以空白基質(zhì)樣液與純?nèi)軇┲锌股胤迕娣e的比值評價基質(zhì)效應(yīng)[27-31]，計算公式為：基質(zhì)效應(yīng)/%=Am/As×100。其中：Am為基質(zhì)樣液中抗生素峰面積；As為純?nèi)軇┲锌股胤迕娣e。比值越接近100%，基質(zhì)對檢測分析影響越小；比值大于100%，基質(zhì)對檢測分析有增強效應(yīng)；比值小于100%，基質(zhì)對檢測分析有抑制效應(yīng)[32]。

按照節(jié)1.2的方法對空白樣品進行前處理，然后配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，測定基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，對上海青中抗生素檢測分析發(fā)現(xiàn)，除培氟沙星表現(xiàn)為較強的基質(zhì)增強效應(yīng)外，其他抗生素則均表現(xiàn)出基質(zhì)弱抑制效應(yīng)(見圖7)。

2.4.2 檢出限、定量限、線性范圍

如表2所示，在優(yōu)化實驗條件下，用空白樣品提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋，配制成0.1～100 μg/L系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。各目標(biāo)物在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，獨立測定樣品7次，測定其標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照文獻[33-34]計算出目標(biāo)物的檢出限(limit of detdction,LOD)為0.02～2.49 μg/kg，定量限(limit of quabtitation,LOQ)為0.06～9.95 μg/kg。

表2 空白基質(zhì)中9種抗生素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4.3 回收率和精密度實驗

按照節(jié)1.2的實驗方法進行樣品前處理，用上海青的空白基質(zhì)為樣品，添加10，50，100 μg/kg 3種添加水平，每個添加水平平行測定7次，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。9種抗生素在10，50，100 μg/kg 3個添加水平下的回收率為76.6%～123.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)(n=7)為0.3%～11.0%，方法精密度高(見表3)。

表3 9種抗生素在樣品中的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 7)

2.5 實際樣品測定

從廈門市農(nóng)貿(mào)市場隨機購買10份上海青樣品，采用本方法對9種抗生素進行分析測定。結(jié)果表明，7份檢出達(dá)氟沙星1.05～5.28 μg/kg，2份檢出環(huán)丙沙星1.29，1.75 μg/kg，1份檢出恩諾沙星2.25 μg/kg,其余抗生素均未檢出。陳乾等[35]對4種市售蔬菜進行檢測，抗生素殘留范圍為1.59～32.01 μg/kg，本研究測得數(shù)值低于該文獻的結(jié)果。

表 4 實際樣品中各樣品的9種抗生素殘留量平均值及其標(biāo)準(zhǔn)差

3 結(jié) 論

本文以上海青為實驗對象，通過優(yōu)化樣品前處理和質(zhì)譜條件，建立同時測定上海青中 3 種氯霉素類和 6 種喹諾酮類抗生素殘留UPLC-MS/MS檢測方法。該方法操作簡單、凈化效果好，適用于上海青中氯霉素類和喹諾酮類抗生素的檢測。