劉艷紅，李雪兵，張 慧，潘 晨，王楚楚，陳 蕊，吳海龍

(1.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005)

0 引言

決明子(CatsiatoraLinn)，又名草決明，豆科決明屬，其水提物富含萘并吡喃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、萘酚類(lèi)化合物。決明子具有清肝明目、降血壓、降血脂、潤(rùn)腸通便、抗氧化等作用，在食用和藥用方面都有較高的價(jià)值[1-5]。目前，野生決明子資源已不能滿(mǎn)足人們的生產(chǎn)生活需求，而人工種植又存在化肥農(nóng)藥濫用的問(wèn)題，已有研究發(fā)現(xiàn)決明子中檢測(cè)出18種重金屬及有害元素[6]。因此，建立一種環(huán)?？沙掷m(xù)的綠色生態(tài)決明子種植方式顯得尤為必要。

大型海藻是海洋植物區(qū)系的主要組成部分，其提取物中富含微量元素及大量營(yíng)養(yǎng)元素、多糖、蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、多酚、植物激素和滲透劑，海藻種類(lèi)及其生長(zhǎng)的季節(jié)、地點(diǎn)等環(huán)境因素不同，各成分含量也不同[7-8]。目前，海藻已被認(rèn)定為生物刺激劑來(lái)源之一。生物刺激劑是指生物來(lái)源的、能夠提高植物生產(chǎn)力的配方產(chǎn)品。按原材料來(lái)源不同，生物刺激劑來(lái)源可分為細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)、高等植物、動(dòng)物原材料及含腐殖質(zhì)原料。已經(jīng)被證實(shí)可用作生物刺激劑來(lái)源的藻類(lèi)有小球藻、江蘺、海帶和馬尾藻等[9]。生物刺激劑能夠?qū)χ参锷L(zhǎng)產(chǎn)生多種有益作用，如促進(jìn)白花丹種子萌發(fā)和生根，研究表明，添加2.5%海藻提取物處理的白花丹(PlumbagozeylanicaL.)每芽根數(shù)、平均根長(zhǎng)分別增加1.34倍、1.49倍[10]。海藻提取物也能提高植物整體生長(zhǎng)和生產(chǎn)力，在番茄種植中施用海藻提取物的研究表明，番茄花數(shù)、花序數(shù)、花果比顯著增加，果實(shí)數(shù)和大小明顯增加[11-12]。有研究表明，海藻提取物能夠有效提高作物抵抗生物和非生物環(huán)境因子脅迫的能力，如威氏馬尾藻提取物對(duì)嚴(yán)重危害棉花作物的害蟲(chóng)紅棉球絳蟲(chóng)(Dysdercuscingulatus)具有顯著的殺蟲(chóng)活性；在鹽分和干旱脅迫下，對(duì)不同小麥品種進(jìn)行褐藻提取物處理，能夠促進(jìn)小麥根系長(zhǎng)度、葉綠素含量、類(lèi)胡蘿卜素含量和組織含水量增加[13-14]?？梢钥闯觯瑢⒋笮秃Ｔ逄崛∥飸?yīng)用于種植業(yè)能有效提升作物抗逆性,提高產(chǎn)量并改善品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)生態(tài)種植。

大型海藻提取物在中藥種植上的研究和應(yīng)用目前還較少，其使用效果和作用機(jī)制尚不完全清楚。本文以4種經(jīng)濟(jì)海藻干品為材料，研究其提取物對(duì)決明子種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，旨在建立一種環(huán)境友好型決明子種植方式，為大型海藻資源化利用及決明子生態(tài)化種植提供數(shù)據(jù)資料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

決明子種子購(gòu)自河北保定安國(guó)市萬(wàn)草同源苗木花卉有限公司基地，選擇飽滿(mǎn)、大小基本一致的決明子種子作為研究對(duì)象。以大型海藻干品為海藻提取液材料來(lái)源，包括龍須菜、海帶、紫菜和裙帶菜，分別產(chǎn)自福建莆田、福建霞浦、江蘇連云港和遼寧大連。實(shí)驗(yàn)所用海藻肥為康樸凱普克有機(jī)水溶肥料。

將決明子種子置于直徑9 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。于口徑6.5 cm、深6.5 cm的21孔育苗盤(pán)中進(jìn)行決明子幼苗培育，栽培基質(zhì)為草炭、蛭石、椰糠屑、有機(jī)質(zhì)、腐殖酸、珍珠巖組成的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)土。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海藻提取液的制備及物理屬性測(cè)定 將采集的海藻樣品用清水沖洗干凈，再用純水清洗3次，置于70 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量不變，將干燥后的海藻于破壁機(jī)中打碎成粉末狀海藻粉。將100 g海藻粉加入1 000 mL 體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇中，使用超聲波清洗機(jī)超聲提取2 h, 4 ℃條件下放置24 h；于高速離心機(jī)4 250 r/min離心15 min，取上清液用Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾。下層粉末殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄌ崛∫淮?，合并兩次提取濾液。將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至100 mL，得到1 g/mL的海藻提取液，即質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%海藻提取液。再依次梯度稀釋得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.40%，0.20%，0.10%，0.05%的海藻提取液，于4 ℃冷藏，備用。使用EutechTMCyberScan PCD 650多參數(shù)測(cè)量?jī)x測(cè)定各濃度海藻提取液的pH及電導(dǎo)率。

1.2.2 萌發(fā)指數(shù)測(cè)定 將挑選的決明子種子用有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min，再用純水清洗3～4次。將處理好的決明子種子置于墊兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿提前清洗，并經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌、烘箱烘干。每個(gè)培養(yǎng)皿放置種子100粒，分別加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.40%,0.20%,0.10%,0.05%的海藻提取液及純水和海藻肥，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)期間，每天視蒸發(fā)量對(duì)各處理組補(bǔ)充相同體積的培養(yǎng)液，確保每粒種子表面濕潤(rùn)，每3天換一次濾紙。培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)箱中晝夜溫度25 ℃/20 ℃，光周期14 h/10 h，光強(qiáng)100 μmol/(m2·s)。

每天固定時(shí)間記錄種子發(fā)芽情況，以連續(xù)48 h種子發(fā)芽粒數(shù)不再增加視為種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束。測(cè)定發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率，相關(guān)計(jì)算公式如下：

發(fā)芽勢(shì)(%)=

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，

其中,Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×單株質(zhì)量(g)；

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽個(gè)數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.2.3 生長(zhǎng)指數(shù)測(cè)定 決明子種子于海藻提取液中浸泡24 h后種于育苗盤(pán)，每天用對(duì)應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的處理液澆灌2次，每株10 mL，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為3個(gè)穴盤(pán)，隨機(jī)排列。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始兩周后，每個(gè)處理選取5株長(zhǎng)勢(shì)一致的決明子幼苗進(jìn)行以下指標(biāo)的測(cè)定。鮮質(zhì)量(g)：將決明子幼苗從栽培基質(zhì)拔出，用毛刷輕輕清除根部表面泥土，用電子天平秤質(zhì)量；株高(cm)：直尺測(cè)量從露地幼苗直立時(shí)幼苗頂部到根部的距離；主根長(zhǎng)(cm)：游標(biāo)卡尺測(cè)量根莖到主根根尖的距離。

取質(zhì)量為0.1 g的鮮決明子幼苗葉片置于5 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中，4 ℃避光保存48 h提取光合色素[15]。葉綠素a(Chl a)含量和類(lèi)胡蘿卜素(Car.)含量通過(guò)測(cè)定葉片在470，665，652 nm處吸光度(A470，A665，A652)來(lái)計(jì)算，公式如下：

葉綠素a含量=13.95×A665-6.88×A652，

類(lèi)胡蘿卜素含量=

稱(chēng)取新鮮決明子幼苗葉片0.1 g,加入5 mL磷酸緩沖液(pH=6.8)，研磨至勻漿，5 000g離心15 min。以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定決明子幼苗葉片蛋白質(zhì)含量[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行整理和初步分析，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析和沃勒-鄧肯檢驗(yàn)，顯著性水平P<0.05。對(duì)海藻提取液處理的決明子種子萌發(fā)及生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并使用Origin軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻提取液物理屬性

4種海藻提取液的部分物理屬性見(jiàn)表1。龍須菜提取液、海帶提取液、紫菜提取液和裙帶菜提取液顏色分別為淡黃、灰綠、深紫和翠綠。隨著海藻提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，其pH整體呈上升趨勢(shì)；電導(dǎo)率呈倍數(shù)增加趨勢(shì)，相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻提取液中裙帶菜提取液電導(dǎo)率最高，龍須菜提取液電導(dǎo)率最低。

表1 各質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻提取液的顏色、pH和電導(dǎo)率對(duì)比

2.2 海藻提取液對(duì)決明子種子萌發(fā)指數(shù)的影響

由表2可知，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的龍須菜提取液、海帶提取液、紫菜提取液和裙帶菜提取液均提高了決明子種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。隨著海藻提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，決明子種子的發(fā)芽勢(shì)整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。各質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻提取液處理組較對(duì)照組而言，均對(duì)決明子發(fā)芽勢(shì)有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。0.20%龍須菜提取液、0.10%海帶提取液、0.20%紫菜提取液和0.20%裙帶菜提取液處理的決明子發(fā)芽勢(shì)最高，分別達(dá)30.33%，23.67%，30.30%和31.70%。海藻肥處理的決明子種子發(fā)芽勢(shì)顯著高于空白對(duì)照組，但顯著低于0.20%龍須菜提取液、0.20%紫菜提取液和0.05%～0.20%裙帶菜提取液處理組(P<0.05)。

表2 4種海藻提取液對(duì)決明子種子萌發(fā)的影響

2.3 海藻提取液對(duì)決明子種子生長(zhǎng)指數(shù)的影響

4種海藻提取液對(duì)決明子種子生長(zhǎng)指數(shù)的影響見(jiàn)圖1，各提取液對(duì)決明子幼苗鮮質(zhì)量的影響不同。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=5)，小寫(xiě)字母表示同一列數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05)。下圖同。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海帶提取液處理的決明子幼苗鮮質(zhì)量顯著高于對(duì)照組及海藻肥處理組(P<0.05)，其中0.40%海帶提取液處理的幼苗鮮質(zhì)量最高。龍須菜提取液處理組中，0.05%和0.10%處理組的幼苗質(zhì)量顯著高于其他組，0.40%處理組最低。裙帶菜提取液處理組中，0.20%處理組顯著高于其他組(P<0.05)。紫菜提取液處理組中，0.10%，0.20%，0.40%處理能顯著提高幼苗鮮質(zhì)量(P<0.05)。

海藻提取液處理后，決明子幼苗株高、根長(zhǎng)情況如圖2所示。海帶提取液處理組幼苗株高較空白組和海藻肥處理組顯著提高，但各質(zhì)量分?jǐn)?shù)間無(wú)顯著差異。龍須菜、裙帶菜和紫菜提取液處理組的幼苗株高較空白組無(wú)顯著差異。0.05%和0.40%海帶提取液處理的幼苗根長(zhǎng)顯著高于空白對(duì)照組和海藻肥處理組(P<0.05)，其余處理組幼苗根長(zhǎng)較對(duì)照組和海藻肥處理組無(wú)顯著差異。

a 株高

隨著提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，決明子幼苗葉片的類(lèi)胡蘿卜素含量呈先上升后下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖3)。0.10%海帶提取液處理組幼苗葉片的類(lèi)胡蘿卜素含量顯著高于空白對(duì)照組和海藻肥處理組，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海帶提取液處理間無(wú)顯著差異。0.05%和0.10%裙帶菜提取液處理組的類(lèi)胡蘿卜素含量最高，海藻肥處理組類(lèi)胡蘿卜素含量顯著低于其他組。

圖3 4種海藻提取液對(duì)決明子幼苗葉片類(lèi)胡蘿卜素含量的影響

紫菜提取液處理組的決明子幼苗葉片葉綠素a含量隨著提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(見(jiàn)圖4)。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)裙帶菜提取液處理組的葉綠素a含量無(wú)顯著差異。0.20%和0.40%龍須菜提取液處理組的葉綠素a含量顯著高于0.05%和0.10%龍須菜海藻提取液處理組(P<0.05)。0.40%海帶提取液處理組葉綠素a含量高于其他海帶提取液處理組，但與空白對(duì)照組和海藻肥處理組無(wú)顯著差異。

圖4 4種海藻提取液對(duì)決明子幼苗葉片葉綠素a含量的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻提取液對(duì)決明子幼苗葉片蛋白含量的影響結(jié)果(見(jiàn)圖5)與葉綠素a的影響規(guī)律相似。紫菜提取液處理組的蛋白含量隨提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)。0.10%裙帶菜提取液處理組的蛋白含量最高。0.20%和0.40%龍須菜海藻提取液處理組的蛋白含量顯著高于0.05%和0.10%龍須菜海藻提取液處理組(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

大型海藻含有豐富的碳水化合物、含氮化合物、色素、脂類(lèi)化合物、酚類(lèi)化合物、維生素和海藻藥類(lèi)以及無(wú)機(jī)成分等，化學(xué)組成復(fù)雜[17]。有研究表明，紅藻提取液中包含了69種化合物，包括植物生長(zhǎng)激素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖等[18]。海藻及其提取物中存在有益植物生長(zhǎng)的無(wú)機(jī)養(yǎng)分、胺類(lèi)和吲哚類(lèi)化合物等。在植物有效成分提取過(guò)程中，利用提取液顯示電信號(hào)的特點(diǎn)，通過(guò)電導(dǎo)率測(cè)定能夠反映提取液中有效成分的含量，電導(dǎo)率越高，有效成分含量越高[19]。作物生長(zhǎng)的提高是海藻提取液中多種成分交互作用的結(jié)果，分餾出的單一組分并不能有效促進(jìn)生長(zhǎng)[12]?；诖耍狙芯繉?duì)4種海藻提取液的pH和電導(dǎo)率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明不同海藻提取液的電導(dǎo)率差異明顯，從高到低依次為裙帶菜提取液、海帶提取液、龍須菜提取液和紫菜提取液，電導(dǎo)率最高的裙帶菜提取液在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下較其他海藻提取液對(duì)決明子種子發(fā)芽勢(shì)的提升作用最為明顯，表明裙帶菜提取液可能存在較高的提高決明子種子發(fā)芽勢(shì)的有效成分。而在電導(dǎo)率較高的海帶提取液的處理下，決明子幼苗的株高和根長(zhǎng)提高最為顯著，表明海帶提取液中可能存在較多促?zèng)Q明子幼苗生長(zhǎng)的組分。

海藻提取液中有效成分促進(jìn)作物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的過(guò)程較為復(fù)雜，并與海藻提取液的濃度密切相關(guān)。種子萌發(fā)過(guò)程中，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下，一系列蛋白質(zhì)、酶的代謝受到調(diào)控，如可刺激植物生長(zhǎng)和發(fā)育的赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素等，這些植物激素與種子的萌發(fā)過(guò)程息息相關(guān)[20]。海藻提取液對(duì)決明子種子的引發(fā)目的在于促進(jìn)發(fā)芽前代謝活性，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)活性，并加速膜修復(fù)，表現(xiàn)為發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)指數(shù)和發(fā)芽率的提高[21]。本研究結(jié)果表明，所用海藻提取液均能提高決明子的發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)指數(shù)，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)率的提高。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)低濃度海藻提取液能夠提高決明子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，而隨著海藻提取液濃度的提高，其作用效果先增加進(jìn)而降低。本研究結(jié)果與前人關(guān)于海藻提取液對(duì)番茄生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)的研究結(jié)果一致。在對(duì)番茄的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%)的海藻提取物處理的種子發(fā)芽率較高，平均發(fā)芽時(shí)間較短，發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢(shì)較高，因此幼苗活力較高，胚芽和胚根長(zhǎng)度較長(zhǎng)[22]。綜上，不同海藻種類(lèi)和不同濃度對(duì)作物種子萌發(fā)的作用效應(yīng)不同。

本研究發(fā)現(xiàn)海藻提取液能夠有效提高決明子幼苗的鮮質(zhì)量、株高和根長(zhǎng)，這與前人關(guān)于大豆、谷物和野芝麻菜研究的作用效果一致。對(duì)大豆的研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，0.2%，0.3%和0.4%的海藻提取物處理均提高了大豆的株高、葉片數(shù)、分枝數(shù)和鮮質(zhì)量等指標(biāo)[23]；對(duì)谷物的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度江蘺提取物可顯著提高其種子發(fā)芽率，促進(jìn)植株生長(zhǎng)[24]。本研究結(jié)果表明，不同海藻對(duì)決明子幼苗的鮮質(zhì)量、株高和根長(zhǎng)的影響不同，其中海帶提取液效果較好，這可能是由于褐藻海帶比紅藻和綠藻含有更多的多酚。有研究表明褐藻門(mén)墨角藻(FucusvesiculosusL.)總酚含量最高，綠藻門(mén)石莼(UlvalactucaL.)總酚含量約為墨角藻的1/24，而紅藻門(mén)角叉菜(Chondruscrispus)總酚含量?jī)H為墨角藻的1/60[7]。對(duì)野芝麻菜的研究發(fā)現(xiàn)，在中等濃度的海藻提取物處理下野芝麻菜產(chǎn)量最高(1.99 kg/m2)，且含大量的葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、酚類(lèi)化合物、類(lèi)黃酮和總營(yíng)養(yǎng)素[25]。

綜上所述，海藻提取液能夠有效促進(jìn)決明子種子的萌發(fā)和決明子幼苗的生長(zhǎng)，且能提高類(lèi)胡蘿卜素等色素含量，但不同種海藻提取液對(duì)決明子種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響不同。紫菜提取液提高決明子種子萌發(fā)效果最好，而海帶提取液能夠顯著提高決明子幼苗的株高和根長(zhǎng)。同一種海藻提取液中，不同濃度海藻提取液產(chǎn)生的效果也不相同，低濃度海藻提取液能有效促進(jìn)決明子種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～0.20%的海藻提取液促進(jìn)種子萌發(fā)效果較好，隨著海藻提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高，決明子種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)整體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。