崔子杭，孫 昊，唐海峰，劉 歡，盤賽昆，楊 杰

(江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

近年來(lái)，群體性食品微生物中毒事件屢屢發(fā)生[1]，越來(lái)越多的消費(fèi)者開始注重天然、綠色環(huán)保的生物保藏食品[2]，這改變了以往食品防腐劑以化學(xué)抗菌劑為主的格局。探索天然安全的抗菌物質(zhì)作為食品防腐劑越來(lái)越為人們所重視，生物食品抗菌劑代替化學(xué)食品抗菌劑逐漸成為研究熱點(diǎn)。

作為一種生物安全菌株，乳酸菌因可以產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等具有抑菌活性的物質(zhì)[3]而在食品保藏領(lǐng)域受到極大關(guān)注，其產(chǎn)生的細(xì)菌素是由核糖體合成的、有抗菌活性的小分子多肽[4]，具有良好的熱穩(wěn)定性。將細(xì)菌素添加到食品保藏中，不僅不會(huì)對(duì)食品產(chǎn)生不良影響，還能夠延緩食品變質(zhì)或病原體生長(zhǎng)，同時(shí)改善傳統(tǒng)保存方法存在的營(yíng)養(yǎng)成分流失、致癌終產(chǎn)物形成和食品風(fēng)味改變等問(wèn)題[5]。大多數(shù)細(xì)菌素的分子量小于10 kDa，對(duì)同種或近源的其他食品致病菌具有抗菌活性[6]。研究表明，幾乎所有乳酸菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素，其中乳酸鏈球菌素Nisin已被應(yīng)用于食品生產(chǎn)。

植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)是自然界廣泛分布的一種乳酸菌，目前已應(yīng)用于食品保健等領(lǐng)域。與其他種類的乳酸菌相比，植物乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生多種細(xì)菌素，對(duì)胃腸道應(yīng)激以及其他各種應(yīng)激具有良好的耐受性。植物乳桿菌細(xì)菌素因具有廣譜的抑菌活性和安全降解性而成為新型生物防腐劑研究的重點(diǎn)[7]。然而，植物乳桿菌細(xì)菌素的分離純化難度較大，所以需要在前期篩菌時(shí)投入大量資源和精力[8]。本研究從家庭自制泡菜鹵水中分離出可拮抗致病菌的乳酸菌，以求得到一株天然拮抗菌株，擬通過(guò)醇沉法、有機(jī)溶劑萃取法、凝膠過(guò)柱和反向高效液相色譜法等對(duì)植物乳桿菌所產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)進(jìn)行分離純化，并通過(guò)研究所產(chǎn)拮抗物質(zhì)的性質(zhì)，為新型食品防腐劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 樣品取自貴州省黔東南苗族侗族自治州農(nóng)家自制泡菜鹵水，無(wú)菌環(huán)境下取樣。

1.1.2 指示菌 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 23656，腐敗希瓦氏菌(Shewanella)ATCC 49138，大腸桿菌(Escherichiacoli)CICC 10003，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)CICC 23828。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑 乳酸菌專用培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

硫酸銨，無(wú)水乙醇，pH 6.0磷酸緩沖液，乙酸乙酯，色譜級(jí)甲醇，Sephadex G50，Sephadex LH-20，1 mol/L鹽酸，1 mol/L氫氧化鈉，均為國(guó)產(chǎn)分析純。過(guò)氧化氫酶200 000 U/mg，蛋白酶K 30 U/mg，胰蛋白酶250 U/mg，胃蛋白酶3 000 U/g，購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司。乳酸菌生理生化鑒定試劑盒購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器和設(shè)備 YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌器,上海訊博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科技有限公司；DNP-9126型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3CW Microprocessor pH/mV Merer,上海理大智能電子有限公司；SBS-160數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器,上海滬西分析儀器廠有限公司；DNL-N電腦數(shù)顯定時(shí)恒流泵,上海滬西分析儀器廠有限公司；D-37520高速冷凍離心機(jī),美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；3730XL測(cè)序儀,美國(guó)ABI；SH2-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵,上海越眾儀器設(shè)備有限公司；RE52-AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 具有拮抗作用的乳酸菌的分離篩選與鑒定

(1)植物乳桿菌的分離與篩選。將鹵水樣品濾液以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃富集培養(yǎng)24 h。將樣品分別稀釋至10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取表面光滑圓潤(rùn)的單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min得到無(wú)細(xì)胞上清液[9]。根據(jù)抑菌試驗(yàn)篩選出抑菌效果較強(qiáng)的乳酸菌。

(2)具有拮抗作用的植物乳桿菌發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定。采用打孔法[10]進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。菌株接種前，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌體濃度至OD600 nm=0.5。以大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和腐敗希瓦氏菌為指示菌(指示菌在活化時(shí)，需在LB固體培養(yǎng)基上劃線，并傳代至5 mL LB液體培養(yǎng)基中)，在37 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)12 h，取1 mL接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，后取100 μL涂布到LB固體培養(yǎng)基上，待菌液晾干后，用打孔器打孔，向孔中加入發(fā)酵上清液原液，用量80 μL/孔，設(shè)3組平行試驗(yàn)[11]，37 ℃條件下培養(yǎng) 12 h。抑菌活性以抑菌圈直徑大小為參照[12]。獲得的具有抑菌活性的菌株保存于40%甘油管中，-80 ℃冰箱可長(zhǎng)期保存[13]。

(3)具有拮抗作用的植物乳桿菌的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定。通過(guò)革蘭氏染色對(duì)分離的菌株進(jìn)行初步鑒定，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，并采用生理生化試劑盒對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定[14]。

(4)具有拮抗作用的植物乳桿菌的16S rDNA鑒定。利用細(xì)菌基因組快速提取試劑盒提取菌株的基因組DNA,運(yùn)用通用引物進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增[15]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)通用引物為27F和1 492R。PCR擴(kuò)增方法采用常規(guī)法，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延長(zhǎng)90 s和35個(gè)循環(huán)；72 ℃最終擴(kuò)展5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳[16]，觀察結(jié)果并拍照。將PCR擴(kuò)增的目的基因片段送至南京斯普林食品有限公司進(jìn)行序列檢測(cè)。將序列與GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較，并用MEGA 7.0軟件對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

(5)具有拮抗作用的植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線及pH測(cè)定。菌株接種前，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌體濃度至OD600 nm=0.5。以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種在MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h，每隔2 h取樣。以空白MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定吸光度，同步測(cè)定pH。

(6)不同濃度NaCl對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響。將菌株以體積分?jǐn)?shù)1%接種量分別接種到NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，4%，8%，12%，16%的MRS液體培養(yǎng)基中[13]，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在4，8，12，24，36，48 h取樣，用紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定生長(zhǎng)情況。

1.2.2 植物乳桿菌活性成分的分離純化

(1)醇沉法。取甘油管中保藏的菌株進(jìn)行三區(qū)劃線活化，挑選單菌落轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接入到1 L的MRS液體培養(yǎng)基中。37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h，8 500 r/min離心20 min，得無(wú)細(xì)胞上清液[18]。旋蒸上清液至原體積的1/10,加入無(wú)水乙醇，使無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，充分?jǐn)嚢杈鶆?。? ℃條件下靜置過(guò)夜，8 500 r/min離心20 min，繼續(xù)濃縮上清液至1/5體積，去除大量乙醇濃縮至原發(fā)酵液體積，所得旋蒸液中的乙醇回收。選擇未處理的濃縮發(fā)酵液為對(duì)照，以醇沉后的濃縮上清液和醇沉后的沉淀為待測(cè)樣品，以蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作為指示菌，采取打孔法測(cè)其活性。每組樣品參考3個(gè)平行試驗(yàn)，經(jīng)醇沉水提得到的粗提液約100 mL，置于冰箱4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

(2)有機(jī)溶劑萃取法。加入醇沉上清液兩倍體積的乙酸乙酯，充分搖勻后轉(zhuǎn)至分液漏斗靜置4 h，將有機(jī)相旋蒸干后用pH 6.0磷酸緩沖液復(fù)溶，所得旋蒸液中的乙酸乙酯回收利用。重復(fù)以上步驟萃取6次,合并萃取所得有機(jī)相，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，獲得粗提液放置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)Sephadex G50凝膠層析柱純化。將乙酸乙酯萃取液用葡聚糖凝膠Sephadex G50層析柱(直徑2.0 cm×柱高80 cm)對(duì)有機(jī)溶劑萃取后的粗提液進(jìn)一步分離純化，洗脫液選用蒸餾水洗脫，流速0.5 mL/min。使用自動(dòng)收集器收集餾分，設(shè)置每管5 min，使用打孔法測(cè)定每組餾分的抑菌活性，將有活性的組分收集濃縮，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，獲得粗提液放置冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)Sephadex LH-20凝膠層析柱純化。經(jīng)Sephadex G50層析后的樣品再用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20層析柱(直徑2.0 cm×柱高80 cm)進(jìn)行層析純化，洗脫液選用80%色譜級(jí)甲醇進(jìn)行洗脫，流速0.5 mL/min。通過(guò)打孔法測(cè)定每個(gè)組分的抑菌活性。將顯示有抑菌活性的部分匯集并進(jìn)行濃縮，使用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，進(jìn)一步采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化。

(5)RP-HPLC純化。將20 μL樣品注入配備有分析柱的RP-HPLC來(lái)測(cè)試植物乳桿菌活性成分純度[19]。使用分析柱對(duì)樣品進(jìn)行分析后改用制備柱收集樣品。色譜柱：Agilent C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；洗脫條件：線性雙相梯度洗脫(A：超純水，B：甲醇)；洗脫梯度為A：90%—5%，B：10%—95%；洗脫時(shí)間：35 min；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)器：光電二極管分離陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：100 μL[20]。收集每個(gè)峰進(jìn)行活性檢測(cè)，確定有活性的峰。以活性物質(zhì)發(fā)酵上清液為對(duì)照，用打孔法檢測(cè)抑菌活性。

1.2.3 植物乳桿菌活性成分的理化性質(zhì)研究

(1)排除乳酸對(duì)植物乳桿菌的影響研究。取植物乳桿菌粗提液1 mL至10 mL離心管中，用1 mol/L的NaOH分別調(diào)節(jié)pH至4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0[21]，以未調(diào)節(jié)pH的粗提液作為對(duì)照，使用打孔法檢測(cè)抑菌活性。

(2)植物乳桿菌蛋白酶的穩(wěn)定性研究。取植物乳桿菌粗提液1 mL至10 mL離心管中，分別配置蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶溶液，質(zhì)量濃度為5 mg/mL[19]。將粗提液的pH調(diào)至各酶最適合生長(zhǎng)的pH范圍內(nèi)(蛋白酶K：7.5～8.0，胰蛋白酶：8.0～8.5，胃蛋白酶：1.5～2.0)。取酶溶液0.1 mL混勻至0.4 mL的粗提液中，水浴4 h后將其調(diào)回初始pH，以未進(jìn)行處理的粗提液作為對(duì)照，使用打孔法檢測(cè)抑菌活性。

(3)植物乳桿菌的熱穩(wěn)定性研究。取植物乳桿菌粗提液1 mL至10 mL離心管中，分別在60 ℃，80 ℃，121 ℃溫度下處理30 min[22]。取出冷卻至室溫，以未進(jìn)行加熱的粗提液作為對(duì)照[23]，使用打孔法檢測(cè)抑菌活性。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行顯著性分析，利用Tukey法進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，顯著性差異在P<0.05水平上。采用Origin 2021繪圖，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)家發(fā)酵食品中具有抑菌活性的乳酸菌的分離與篩選

從貴州省農(nóng)家發(fā)酵泡菜鹵水中分離純化獲得108株分離物，經(jīng)初篩復(fù)篩后得到3株抑菌活性較強(qiáng)的乳酸菌，分別編號(hào)為L(zhǎng)17，C19和MMB-08。以腐敗希瓦氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 菌株L17，C19和MMB-08對(duì)4種指示菌抑菌活性測(cè)定

MMB-08菌株對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑分別為(11.75±0.35)mm，(10.3±0.71)mm，(10.2±0.42)mm，(8.3±0.28)mm，與其他菌株相比，MMB-08對(duì)4種指示菌的抑制活性較顯著。因此，選擇MMB-08作為目的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 菌株MMB-08的形態(tài)學(xué)鑒定

如圖1所示，菌株MMB-08在MRS平板上培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)為乳白色，不透明，邊緣規(guī)則，表面光滑。經(jīng)革蘭氏染色觀察，菌株呈短桿狀或彎曲桿狀，無(wú)孢子和鞭毛，呈紫色，表明該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌[24]。

注：A為菌落形態(tài);B為革蘭氏染色結(jié)果;C為蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性對(duì)照;D為大腸桿菌陰性對(duì)照。

2.3 菌株MMB-08的生理生化鑒定

菌株MMB-08的生理生化鑒定結(jié)果見表2。明膠液化試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，可發(fā)酵棉子糖、甘露糖、海藻糖等多種糖。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，可初步鑒定該菌株為植物乳桿菌屬。

表2 菌株MMB-08的生理生化鑒定結(jié)果

2.4 菌株MMB-08的16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

如圖2所示，菌株MMB-08的16S rDNA在約1 500 bp處出現(xiàn)明亮條帶，測(cè)序結(jié)果為1 463 bp。通過(guò)BLAST程序建立發(fā)育樹對(duì)比顯示，該菌株序列與植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)序列相似性為100%，初步認(rèn)為篩選得到的MMB-08菌株為植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)，命名為L(zhǎng).plantarumMMB-08。系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，顯示菌株MMB-08與植物乳桿菌在同一分支，證明該菌株為植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)。

圖2 菌株MMB-08電泳圖

2.5 L. plantarum MMB-08生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)過(guò)程中pH的變化

植物乳桿菌L.plantarumMMB-08的生長(zhǎng)狀況以及pH變化如圖4所示，從延滯期到衰亡期,pH從6.0降至4.0，說(shuō)明其發(fā)酵過(guò)程中不斷產(chǎn)酸，到達(dá)穩(wěn)定期后產(chǎn)酸基本保持不變。4～10 h菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，10～12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，20 h以后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速度逐漸緩慢，48 h后菌株進(jìn)入衰敗期，pH逐漸趨于平穩(wěn)，發(fā)酵結(jié)束pH為4.0±0.14，表明菌株在發(fā)酵期間能夠達(dá)到快速生長(zhǎng)并產(chǎn)酸，使pH降低。

2.6 L. plantarum MMB-08耐鹽性研究

具備良好耐鹽性的菌株對(duì)食品防腐等有重要作用，在食品行業(yè)中可以應(yīng)用于高鹽食品的生產(chǎn)[25]。L.plantarumMMB-08耐鹽性如圖5所示，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，OD值隨之降低，生長(zhǎng)繁殖受到抑制，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%和8%時(shí)生長(zhǎng)較好，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%和16%下OD值有所降低，較高濃度的NaCl抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)。

2.7 L. plantarum MMB-08活性物質(zhì)的分離純化

使用醇沉法對(duì)L.plantarumMMB-08分離純化,結(jié)果見表3。醇沉得到的上清液粗提物具備明顯抑菌活性，其沉淀無(wú)活性，說(shuō)明醇沉法適用于分離純化前期的粗提。

表3 L. plantarum MMB-08醇沉粗提物質(zhì)抑菌活性

2.7.1 有機(jī)溶劑萃取分離活性物質(zhì) 用乙酸乙酯萃取法對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)一步分離提純，結(jié)果見表4。對(duì)醇沉液重復(fù)萃取6次后，水相對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性逐漸降低，直到第5次萃取后，水相中殘留活性物質(zhì)不再發(fā)生變化，即確定萃取次數(shù)為6次。

表4 乙酸乙酯萃取L. plantarum MMB-08的抑菌活性

2.7.2 凝膠層析柱純化 發(fā)酵上清液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，經(jīng)Sephadex G50凝膠層析得到的餾分采取打孔法測(cè)其活性。15到25管餾分具備明顯抑菌活性(見圖6a)，將這些活性物質(zhì)收集合并，再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠層析，檢測(cè)到65到81管餾分具備明顯抑菌活性(見圖6b)。該抑菌活性餾分在波長(zhǎng)280 nm下有明顯的紫外吸收峰，所以選用280 nm作為高效液相色譜儀的檢測(cè)波長(zhǎng)。

a Sephadex G-50

2.7.3 RP-HPLC純化 將層析柱純化后的活性物質(zhì)使用RP-HPLC進(jìn)行全波長(zhǎng)分析，結(jié)果如圖7所示。在280 nm下共檢測(cè)到7個(gè)單峰，將各峰的餾分分離收集，其中，峰3具備顯著活性，保留時(shí)間為24.824 min。L.plantarumMMB-08的發(fā)酵上清液分別經(jīng)醇沉，乙酸乙酯萃取，Sephadex G-50，Sephadex LH-20層析和RP-HPLC純化，得到有抑菌活性的細(xì)菌素MMB-08。

圖7 L. plantarum MMB-08 HPLC洗脫峰的活性檢測(cè)

2.8 細(xì)菌素MMB-08的性質(zhì)研究

2.8.1 排除乳酸對(duì)細(xì)菌素MMB-08 的影響 對(duì)細(xì)菌素MMB-08的乳酸排除結(jié)果如圖8所示，乳酸在pH=6.0時(shí)失去活性。為了排除酸性物質(zhì)的干擾，將pH調(diào)至7.0檢測(cè)抑菌活性，結(jié)果表明此時(shí)抑菌活性依然存在，說(shuō)明發(fā)酵上清液中不僅含有乳酸，還有細(xì)菌素等。

注：小寫字母表示組內(nèi)顯著性差異(P<0.05)。

2.8.2 細(xì)菌素MMB-08的蛋白酶穩(wěn)定性 細(xì)菌素MMB-08的蛋白酶穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖9所示。與對(duì)照相比，細(xì)菌素MMB-08經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K處理過(guò)后活性降低，分別降低28.5%，38.4%，36.4%，說(shuō)明抗菌物質(zhì)能夠被蛋白酶降解而不會(huì)殘留在人體內(nèi)，是一種安全可降解的抗菌物質(zhì)。

圖9 細(xì)菌素MMB-08的蛋白酶穩(wěn)定性

2.8.3 細(xì)菌素MMB-08的熱穩(wěn)定性 細(xì)菌素MMB-08的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖10和圖11所示。對(duì)其進(jìn)行60 ℃ 30 min，80 ℃ 30 min，121 ℃ 30 min的不同處理，細(xì)菌素MMB-08在60 ℃時(shí)幾乎不受影響，80 ℃處理30 min后能保留94.3%的活性，121 ℃處理30 min后仍能保留84.5%的活性，表明細(xì)菌素MMB-08具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖10 細(xì)菌素MMB-08的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

圖11 細(xì)菌素MMB-08的熱穩(wěn)定性

3 討論

目前乳酸鏈球菌素Nisin已經(jīng)應(yīng)用到食品行業(yè)中，但Nisin抗菌譜較窄，僅能針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌[26]，因此迫切需要開發(fā)出具有廣譜抑菌效果的細(xì)菌素。本研究從貴州發(fā)酵食品中篩選到一株具有良好抑菌活性的植物乳桿菌，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)常見的兩種革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌)具有明顯抑制效果，抑菌圈直徑分別達(dá)到(10.3±0.71)mm和(8.3±0.28)mm；同時(shí)，其對(duì)兩種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌)的抑制效果也同樣顯著，直徑分別達(dá)到(11.75±0.35)mm和(10.2±0.42)mm。因此可以認(rèn)為篩選得到的MMB-08菌株為植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)，命名為L(zhǎng).plantarumMMB-08。L.plantarumMMB-08在食品防腐和病原菌控制方面具有較大應(yīng)用潛力。

細(xì)菌素的分離純化一般采取硫酸銨沉淀、有機(jī)溶劑萃取、凝膠層析以及反向高效液相色譜法等。張漫敏等[27]通過(guò)硫酸銨沉淀、有機(jī)溶劑萃取、pH吸附解吸、凝膠層析和反向高效液相色譜法得到L.plantarumC010。Zhu等[28]通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜、凝膠色譜和反相高效液相色譜法從鮮牛奶中分離出產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌L.plantarumZJ008。本文在L.plantarumMMB-08產(chǎn)物的提取與純化中，使用了醇沉法、乙酸乙酯萃取法以及凝膠層析和反向高效液相色譜法。L.plantarumMMB-08發(fā)酵液中除了存在細(xì)菌素以外，還存在各種酸性物質(zhì)、過(guò)氧化氫等抑菌物質(zhì)[29]。為了排除酸性物質(zhì)的干擾，將L.plantarumMMB-08發(fā)酵液的pH調(diào)到7.0后進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明，pH=7.0的L.plantarumMMB-08發(fā)酵液仍存在一定的抑菌效果，說(shuō)明發(fā)酵上清中不僅含酸，還含有細(xì)菌素等。

相較于其他植物乳桿菌提取的抗菌物質(zhì)，細(xì)菌素MMB-08的耐熱性也較為突出。高鵬[30]研究的細(xì)菌素JL-A65雖具有廣譜抑菌效果，但在溫度達(dá)到90 ℃處理10 min后抑菌活性急劇下降，處理30 min后已無(wú)抑菌活性。而細(xì)菌素MMB-08在121 ℃30 min后仍能保留84.5%的抑菌活性，這也說(shuō)明L.plantarumMMB-08所產(chǎn)細(xì)菌素相較于其他細(xì)菌素應(yīng)用范圍更廣，在熱加工食品的防腐保鮮領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

另外，本研究對(duì)細(xì)菌素的利用率較低，在1 L發(fā)酵液中最終獲得細(xì)菌素提取物僅10 mL，占整體體積的1%。提取物在凝膠層析中以及高效液相色譜中都有一定程度的損失，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中僅選取抑菌活性最高的部分用于細(xì)菌素下一步分離純化，后續(xù)研究將注重細(xì)菌素的提取率，優(yōu)化分離純化條件，為細(xì)菌素的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從云貴高原地區(qū)的農(nóng)家發(fā)酵食品中篩選到一株具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行了生理生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，該菌株為L(zhǎng).plantarum，將其命名為L(zhǎng).plantarumMMB-08。對(duì)L.plantarumMMB-08所產(chǎn)抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化，分別經(jīng)醇沉、乙酸乙酯萃取、Sephadex G-25和Sephadex LH-20凝膠柱層析，最后經(jīng)反相高效液相色譜分析得到一個(gè)有抑菌活性物質(zhì)的單峰，名為細(xì)菌素MMB-08，保留時(shí)間在24.824 min。此外，相關(guān)的性質(zhì)研究還發(fā)現(xiàn)，L.plantarumMMB-08所產(chǎn)細(xì)菌素具有較好的熱穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于熱加工食品的防腐保鮮。