邴吉帥，王得發(fā)，許依能，陳 麗

(1.江蘇海洋大學 a.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室；b.江蘇省海洋生物產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005；3.連云港市環(huán)境科技服務中心，江蘇 連云港 222005)

作為一類高吸水、高保水材料，水凝膠被廣泛應用在農業(yè)、化妝品、醫(yī)藥材料、食品等領域。傳統(tǒng)水凝膠具有強度低、韌性差、吸水速度慢、對環(huán)境(溫度或pH等)的變化不敏感等缺點。與傳統(tǒng)水凝膠相比，天然水凝膠對環(huán)境變化敏感，具有較高的生物相容性、保水性、降解性和生物穩(wěn)定性[1-2]，同時，天然水凝膠可通過負載藥物或活性物質，實現(xiàn)止血、抗菌、藥物釋放，因而在創(chuàng)傷燒傷愈合等領域已得到廣泛應用[3-7]。

作為一類重要的天然水凝膠材料，以殼聚糖為基質制備的復合水凝膠受到廣泛關注。Patel等[8]用明膠與殼聚糖復合制備了具有促進傷口愈合功能的水凝膠；Peers等[9]將載藥脂質體負載至殼聚糖制備了有利于藥物釋放的水凝膠；Hafida等[10]將殼聚糖與聚丙烯酰胺、銀納米粒子結合制備了對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用的復合納米水凝膠，殺菌率高達99.99%；Ulu等[11]將殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和MCM-41聚合得到復合水凝膠膜，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和白色念珠菌酵母具有優(yōu)異抗菌性能，可用于藥物遞送及傷口愈合材料和吸附材料的生產。但是目前為止，對以殼聚糖和海藻酸鈉為基質，以生物活性玻璃為結構調節(jié)劑，負載南極磷蝦抗菌肽制備海洋多糖復合抗菌水凝膠的研究較少。

殼聚糖和海藻酸鈉作為天然親水性高分子多糖，是食品、醫(yī)藥領域制備功能水凝膠的首選理想材料[8-9,12]，有著很好的應用前景。目前，殼聚糖和海藻酸鈉常用于天然水凝膠的制備[13-17]，但該類復合水凝膠生物活性相對較弱。本文利用活性疊加原理，將活性小分子引入到復合水凝膠制品中，試圖改善其生物活性。有研究表明，某些天然小分子活性肽具有獨特的抗菌機理[18]。南極磷蝦抗菌肽作為天然活性肽的一種，具有優(yōu)良的抑菌作用。在此基礎上，本文以海洋多糖殼聚糖、海藻酸鈉為主要基質，制備具有較好力學機械性能、生物相容性和持水力的海洋多糖復合水凝膠，并進一步負載南極磷蝦抗菌肽，制得具有較好抗菌生物活性的復合抗菌水凝膠，為其在食品、醫(yī)藥領域的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖(CS)、海藻酸鈉(SA)、冰醋酸、氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀，購自國藥集團試劑有限公司，分析純；LB肉湯，購自青島海博生物技術有限公司；瓊脂粉，購自上海橋星貿易有限公司；生物活性玻璃(BG)，購自渾源駿宏新材料有限公司。南極磷蝦抗菌肽為實驗室自制；金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌由江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室提供。

1.2 設備

真空冷凍干燥機，美國LABCONCO公司；全波長酶標儀，Thermo Fisher Scientific公司；Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀，Thermo Fisher Scientific公司；JSM-6390LA掃描電子顯微鏡，日本JEOL；凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海洋多糖復合水凝膠制備及條件篩選

(1)復合水凝膠制備。將質量分數(shù)為1.5%的海藻酸鈉溶液、1.2%的殼聚糖溶液和生物活性玻璃混合均勻，50 ℃水浴下滴加一定量0.3 mol/L氯化鈣溶液，攪拌均勻。

(2)海藻酸鈉與殼聚糖體積比的篩選。將質量分數(shù)為1.5%的海藻酸鈉溶液和1.2%的殼聚糖溶液分別按體積比19∶1，18∶2，17∶3，16∶4，15∶5混合，在50 ℃水浴下，向不同混合液分別加入0.5 g/mL的生物活性玻璃，再滴加0.2 mL 0.3 mol/L的的氯化鈣溶液，攪拌均勻后注入模具。

(3)生物活性玻璃添加量的篩選。將質量分數(shù)1.5%的海藻酸鈉溶液和1.2%的殼聚糖溶液按照體積比17∶3混合均勻，50 ℃水浴下，分別加入0，0.25，0.50，0.75，1.00 g/mL的生物活性玻璃，再分別滴加0.2 mL 0.3 mol/L的氯化鈣溶液，混勻注入模具。

1.3.2 海洋多糖復合水凝膠成膠時間 復合水凝膠成膠時間的測定采用倒置觀察法。將水凝膠混合物放置在室溫中，每隔5～10 s傾斜或倒轉模具，將水凝膠無法流出模具的時間記為t1，水凝膠完全固化時間記為t2，水凝膠成膠時間為t2-t1[19]。

1.3.3 海洋多糖復合水凝膠掃描電鏡分析 海洋多糖復合水凝膠微觀形貌分析采用掃描電鏡觀察。

1.3.4 海洋多糖復合水凝膠性能研究

(1)含水量測定。將不同條件下制備的水凝膠吸干表面水分，稱取樣品質量為mw，將樣品凍干后再稱質量，記為md。

含水量(%)=(mw-md)/mw×100%。

(2)溶脹率測定。將不同條件下制備的水凝膠真空干燥后，再在PBS緩沖液中浸泡24 h，至質量不增加(稱量3次不變即可)，記為msl[20]。

溶脹率(%)=(msl-md)/md×100%。

(3)力學性能測定。采用質構儀法測定力學性能。將水凝膠用模具做成直徑為10 mm、高為5 mm的圓柱體，將水凝膠擠壓破裂至最大壓力，測量水凝膠的靜態(tài)壓縮模量[19]。

1.3.5 海洋多糖/抗菌肽復合抗菌水凝膠抑菌活性測定 在50 ℃水浴下，分別將質量分數(shù)1.5%的海藻酸鈉溶液和1.2%的殼聚糖溶液按17∶3體積比混合后，加入0.5 g/mL生物活性玻璃粉體，制備混合膠體6份，再分別加入0，10，20，30，40，50 mg/mL南極磷蝦抗菌肽，混勻。最后滴加0.2 mL 0.3 mol/L的氯化鈣溶液，制備得到一系列含南極磷蝦抗菌肽的海洋多糖/抗菌肽復合抗菌水凝膠，分別記為G0，G1，G2，G3，G4，G5。采用濾紙片法，以抑菌圈直徑為指標，分別測定復合抗菌水凝膠對金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌的抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 海洋多糖復合水凝膠成膠時間

海藻酸鈉與殼聚糖的體積比對復合水凝膠成膠時間的影響如表1所示。

表1 SA與CS體積比對復合水凝膠成膠時間的影響

在生物活性玻璃添加量為0.5 g/mL、室溫條件下，海藻酸鈉與殼聚糖體積比不同時，復合水凝膠均可成膠，且隨著海藻酸鈉體積比例的減小、殼聚糖體積比例的增大，成膠時間呈現(xiàn)先下降后上升狀態(tài)，當兩者體積比為17∶3時成膠時間最短，為60 s左右。因此選擇海藻酸鈉與殼聚糖最佳成膠的體積比為17∶3。

生物活性玻璃添加量對復合水凝膠成膠時間的影響如表2所示。在海藻酸鈉與殼聚糖體積比為17∶3的條件下，生物活性玻璃添加量對復合水凝膠成膠時間不產生明顯影響，且在室溫下均可成膠，成膠時間約為60 s。

表2 BG添加量對復合水凝膠成膠時間的影響

2.2 海洋多糖復合水凝膠掃描電鏡分析

在海藻酸鈉與殼聚糖體積比為17∶3的條件下，分別測試了含有0，0.25，0.50 g/mL生物活性玻璃的復合水凝膠的微觀表面形態(tài)。已知真空冷凍干燥可有效保持水凝膠的網狀結構。將所有待測樣品真空凍干后進行掃描電鏡表面結構表征，結果如圖1所示。在放大3 000倍條件下，與不含生物活性玻璃的復合水凝膠(見圖1a)相比，含有生物活性玻璃的復合水凝膠(見圖1d和圖1g)表面網狀結構更加緊密，水凝膠分散更加均勻，且隨著生物活性玻璃添加量的增大，復合水凝膠分散均勻性、網狀結構緊密性進一步增強，團聚現(xiàn)象減少，說明生物活性玻璃的添加可以有效改善復合水凝膠表面網狀形態(tài)。

a BG添加量0 g/mL，×3 000

2.3 海洋多糖復合水凝膠性能

2.3.1 含水量和溶脹率 海藻酸鈉與殼聚糖體積比對復合水凝膠含水量和溶脹率的影響如圖2、圖3所示。由圖2可知，不同海藻酸鈉與殼聚糖體積比得到的復合水凝膠含水量均大于90%，整體上含水量狀況良好。當海藻酸鈉與殼聚糖體積比為19∶1時，所得復合水凝膠的含水量最高，達94.11%；隨著海藻酸鈉體積比例的升高、殼聚糖體積比例的降低，復合水凝膠含水量逐漸降低；當兩者體積比為15∶5時，含水量下降至90.34%，這可能是海藻酸鈉量的減少影響了凝膠的親水性，導致復合水凝膠含水量降低。

圖2 SA與CS體積比對復合水凝膠含水量的影響

如圖3所示，海藻酸鈉與殼聚糖不同體積比所形成的復合水凝膠均具有一定的溶脹能力。當兩者體積比為19∶1時，所得復合水凝膠溶脹率最大，為65.51%；隨著海藻酸鈉體積比例的增大、殼聚糖體積比例的減小，復合水凝膠溶脹率逐漸下降，當體積比減小到15∶5時，溶脹率下降至33.32%。原因可能是隨著殼聚糖含量的增加，分子間氫鍵等作用力增強，交聯(lián)更緊密，溶脹能力減弱，分子鏈間的距離較近，在鈣離子加入量相同的條件下，更易形成較為致密的網格結構而降低凝膠的溶脹度[21]。

圖3 SA與CS體積比對復合水凝膠溶脹率的影響

生物活性玻璃不同添加量對復合水凝膠含水量、溶脹率的影響如圖4、圖5所示。由圖4可知，不同生物活性玻璃添加量所得復合水凝膠產物的含水量均大于93%，均具有較高含水量，但隨著生物活性玻璃含量的增加，復合水凝膠的含水量逐漸降低。不含生物活性玻璃的復合水凝膠的含水量為96.69%；當添加量為0.50 g/mL時，含水量下降為94.11%，添加量增加到1.00 g/mL時，含水量下降為92.94%，降低趨勢并不明顯。

圖4 BG添加量對復合水凝膠含水量的影響

由圖5可知，隨著生物活性玻璃添加量的增加，所得復合水凝膠的溶脹能力逐漸降低。相關研究證明，水凝膠的含水量、溶脹率跟交聯(lián)程度有關，復合水凝膠的交聯(lián)度越高，其含水量、溶脹率越低；生物活性玻璃的加入，增強了復合水凝膠的交聯(lián)程度，使復合水凝膠的含水量、溶脹率下降[20]。

圖5 BG添加量對復合水凝膠溶脹率的影響

2.3.2 力學性能 如圖6所示，海藻酸鈉與殼聚糖體積比不同，對復合水凝膠的力學性能影響不同。首先，隨著海藻酸鈉含量的升高、殼聚糖含量的降低，復合水凝膠壓縮模量先增加后減少，在兩者體積比從19∶1變?yōu)?7∶3的過程中，復合水凝膠流動性逐漸變弱，強度降低，形狀不夠固定。隨著兩者體積比進一步下降，殼聚糖含量增加，分子鏈間作用力增強，導致復合水凝膠網絡結構更加緊密[22]，壓縮模量上升。但是，隨著殼聚糖含量進一步增加，復合水凝膠交聯(lián)度過大，脆性進一步增強，壓縮模量降低，力學性能下降。研究表明，在本實驗條件下，當海藻酸鈉與殼聚糖體積比為17∶3時，所得復合水凝膠的壓縮模量最大，達到108.05 kPa。

圖6 SA與CS體積比對復合水凝膠壓縮模量的影響

由圖7可知，海藻酸鈉和殼聚糖體積比17∶3條件下，當生物活性玻璃添加量為0時，復合水凝膠的壓縮模量為18.72 kPa；添加量為0.25 g/mL時，壓縮模量為97.34 kPa，是未添加生物活性玻璃的5倍多；當添加量增加到1.00 g/mL時，壓縮模量增加到127.24 kPa，是未添加生物活性玻璃的6倍多。隨著生物活性玻璃添加量的增加，復合水凝膠的壓縮模量明顯增加。相關研究表明，生物活性玻璃顆粒耐壓程度較高[20]，可提高水凝膠強度，導致壓縮模量提升。

圖7 BG添加量對復合水凝膠壓縮模量的影響

2.4 海洋多糖/抗菌肽抗菌水凝膠抑菌活性

以海洋多糖復合水凝膠負載不同量的南極磷蝦抗菌肽，得到一系列海洋多糖/抗菌肽抗菌水凝膠。研究了抗菌水凝膠其對金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌的抑菌活性，結果如圖8、圖9、圖10所示。

a—無菌水，b—CS，c—G0，d—G1，e—G2，f—G3，g—G4，h—G5

a—無菌水，b—CS，c—G0，d—G1，e—G2，f—G3，g—G4，h—G5

圖10 樣品對金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌的抑菌活性

首先，殼聚糖本身對金黃色葡萄球菌具有一定抑菌性，這與殼聚糖分子結構上的自由氨基、羥基的存在有關。其次，與殼聚糖本身相比，未添加南極磷蝦抗菌肽的海洋多糖復合水凝膠對金黃色葡萄球菌的抑制作用稍有降低，但是隨著南極磷蝦抗菌肽含量的增加，產物抑菌活性逐漸增強。當南極磷蝦抗菌肽的含量為50 mg/mL時，抗菌水凝膠對金黃色葡萄球菌最大抑菌圈直徑達25.12 mm；當南極磷蝦抗菌肽的含量為40 mg/mL時，抗菌水凝膠對變異鏈球菌最大抑菌圈直徑達22.02 mm。因此，與復合水凝膠相比，添加南極磷蝦抗菌肽的抗菌水凝膠的抑菌活性顯著提高，且抑菌活性與南極磷蝦抗菌肽的添加量正相關。

3 結論

通過改變海藻酸鈉、殼聚糖、生物活性玻璃的含量可得到性能不同的海洋多糖復合水凝膠。本研究表明,海藻酸鈉與殼聚糖體積比的變化對復合水凝膠成膠時間影響較大，生物活性玻璃的添加對成膠時間幾乎無影響。條件篩選發(fā)現(xiàn)，當海藻酸鈉與殼聚糖體積比為17∶3、生物活性玻璃添加量為0.50 g/mL時，所得海洋多糖復合水凝膠的成膠時間最快，約為60 s，含水量為94.11%，溶脹率為44.82%，壓縮模量值為108.05 kPa，成膠性較好。同時，研究發(fā)現(xiàn)生物活性玻璃有助于復合水凝膠良好網狀結構的形成，隨著生物活性玻璃含量的增加，所得復合水凝膠的表面網狀結構更緊密，分散更均勻，壓縮模量增強。但隨著生物活性玻璃含量的增加，所得復合水凝膠的含水量、溶脹率呈下降趨勢，這與生物活性玻璃可增強復合水凝膠的交聯(lián)程度有關。另外，通過在海藻酸鈉、殼聚糖復合水凝膠的基礎上負載具有抑制細菌活性的南極磷蝦抗菌肽，得到含有南極磷蝦抗菌肽的海洋多糖/抗菌肽復合抗菌水凝膠，并對其抑制金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌的活性進行研究。結果表明，南極磷蝦抗菌肽的添加可有效改善復合水凝膠對金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌抑制作用，且抑菌活性與南極磷蝦抗菌肽含量正相關。本研究為新型海洋功能性凝膠類抗菌生物材料的開發(fā)及其在食品和醫(yī)藥領域中的應用提供了理論依據(jù)。