魏 翔 顏克濤 戴宇峰 華雪銘* 李 向 杭 瑩
(1.上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心,上海 201306;2.上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201306;3.上海海洋大學(xué),水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306;4.王屋水庫管理所,龍口 265721;5.常州市天寧區(qū)鄭陸畜牧獸醫(yī)站,常州 213111)
維生素K是一種脂溶性維生素,是谷氨酰羧化酶(GGCX)羧化反應(yīng)的輔助因子,GGCX可以將維生素K依賴蛋白的谷氨酸殘基(Glu)羧化為γ-羧基谷氨酸(Gla)[1]。維生素K促進(jìn)凝血酶原(凝血因子Ⅱ)的合成,并調(diào)節(jié)其他3種凝血因子(凝血因子Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ)的合成,從而促進(jìn)凝血,因此又被稱為凝血維生素。骨鈣素(BGP)、基質(zhì)Gla蛋白(MGP)和蛋白S是存在于骨骼內(nèi)的維生素K依賴蛋白,所以維生素K對(duì)于骨骼的生長發(fā)育有積極的作用[2-3]。
維生素K從結(jié)構(gòu)上來看有3種形式,它們共有甲萘醌基團(tuán)。維生素K1和維生素K2是脂溶性維生素,在自然中本來就存在,維生素K3是人工合成的水溶性維生素。維生素K1主要由綠色植物合成[4-5],維生素K2主要由微生物合成[6]。維生素K2具有一系列的形式,分子的側(cè)鏈上有多個(gè)重復(fù)的異戊烯基單位,因此維生素K2又被稱為MK-n,其中n表示異戊烯基單位數(shù)。目前在水產(chǎn)飼料中最常用的是維生素K3的復(fù)合物,以亞硫酸氫鈉甲萘醌(MSB)和亞硫酸煙酰胺甲萘醌(MNB)最為常見。已有研究證實(shí),飼料中的維生素K3需在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為一種活性物質(zhì)(MK-4)后發(fā)揮作用,主要儲(chǔ)存在肝臟中[7-8]。
目前關(guān)于維生素K在水產(chǎn)動(dòng)物上的研究主要集中在生理功能和需求量方面。由于水體環(huán)境復(fù)雜、物種不同、生長階段等因素不同,不同水生動(dòng)物對(duì)維生素K的需求量差異很大。魚體攝入維生素K不足會(huì)導(dǎo)致組織出血和凝血時(shí)間延長等[9-11]。對(duì)底鳉(Fundulusheteroclitus)的研究表明,飼料中MSB缺乏或過量容易導(dǎo)致脊椎異常[12]。草魚(Ctenopharyngodonidellus)[13]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[14]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)[15]、湖紅點(diǎn)鮭(Salvelinusnamaycush)[10]、石斑魚(Epinephelusmalabaricus)[15]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[16]、中國對(duì)蝦(Penaeuschinensis)[17]和斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[18]對(duì)維生素K的需求量已被確定分別為1.9 mg/kg、3.73~6.72 mg/kg、5.2 mg/kg、0.5~1.0 mg/kg、10.6 mg/kg、10.42 mg/kg、185 mg/kg和30 mg/kg。而斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunetaus)[19]、五條(Seriolaquinqueradiata)[20]和大西洋鮭(SalmosalarL.)[21],不需要在飼料中添加維生素K就可以滿足生長和生理需求。
消化和代謝是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)2個(gè)非常重要的過程。消化是指將食物溶解并降解為小分子化合物或元素,使其能夠順利通過腸壁并參與生理功能。代謝是生物體不斷進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的過程。已有研究表明在飼料中添加適量的維生素K3可以增強(qiáng)建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)[22]消化酶活性和提高五龍鵝[23]的養(yǎng)分表觀消化率,但是飼料中維生素K3含量過高會(huì)引起松浦鏡鯉(CyprinuscarpioL.)[24]血清尿素氮含量升高。消化及代謝的改變或影響營養(yǎng)物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的沉積,水產(chǎn)動(dòng)物的肌肉氨基酸和脂肪酸作為肉質(zhì)檢測(cè)的重要指標(biāo),其組成不僅影響著水產(chǎn)動(dòng)物本身的生命活動(dòng),還對(duì)人體必需氨基酸和必需脂肪酸的攝入有著很大的影響。維生素K是否對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體中氨基酸和脂肪酸的含量和組成產(chǎn)生影響,尚未見相關(guān)報(bào)道。
大口黑鱸(Micropterussalmoides)是一種淡水肉食性魚類,近年來,因其生長快、耐低溫、抗病性強(qiáng)、口感鮮美等優(yōu)點(diǎn)在我國廣受歡迎,2019年大口黑鱸的養(yǎng)殖總產(chǎn)量已達(dá)47.8萬t[25]。目前雖圍繞大口黑鱸營養(yǎng)素的需求量開展了大量的研究[26-34],但未見有關(guān)維生素K的研究報(bào)道。已知維生素K的主要作用有促進(jìn)凝血和骨骼發(fā)育,筆者前期也發(fā)現(xiàn)飼料中添加適量的維生素K3可以提高大口黑鱸的生長性能、血液凝血能力、鈣含量和抗氧化能力[35],但是是否會(huì)對(duì)其他生命過程造成影響還不明確。為此,本研究探究維生素K3對(duì)大口黑鱸幼魚消化能力、血清代謝指標(biāo)、肌肉氨基酸和脂肪酸組成的影響,為大口黑鱸飼料配方的優(yōu)化提供參考。
配制以魚粉、豆粕、玉米蛋白粉和血粉為主要蛋白質(zhì)源、魚油和菜籽油為主要脂肪源的基礎(chǔ)飼料(表1)。為了控制維生素K3含量,在基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的亞硫酸煙酰胺甲萘醌(MNB,純度96.33%,由浙江某飼料開發(fā)有限公司提供),同時(shí)減少沸石粉的用量,配制5種試驗(yàn)飼料,使得飼料中維生素K3的含量分別為0.78(K0組)、5.80(K5組)、10.82(K10組)、15.84(K15組)和20.85 mg/kg(K20組)。根據(jù)GB 5009.158—2016和GB/T 18872—2017,通過高效液相色譜法測(cè)定K0組飼料中維生素K1和維生素K3的含量分別為53.2 μg/kg和0.78 mg/kg。通過反相高效液相色譜法沒有檢測(cè)出K0組飼料中的維生素K2含量[36]。以上各種維生素K的含量均委托河南海瑞正檢測(cè)技術(shù)有限公司檢測(cè)。
表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)
根據(jù)配方將各種原料稱重后粉碎,過60目篩網(wǎng),然后與魚油、菜籽油和烏賊膏充分混勻,再加入水用制粒機(jī)制成顆粒料,在烘箱中40 ℃干燥12 h。干燥之后,將顆粒料儲(chǔ)存在陰涼、干燥、通風(fēng)良好的地方備用。
本試驗(yàn)在上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地進(jìn)行,試驗(yàn)開始之前將水泥池和網(wǎng)箱進(jìn)行消毒處理,每個(gè)水泥池內(nèi)放置4個(gè)網(wǎng)箱(長×寬×高=1.8 m×0.7 m×0.8 m)。試驗(yàn)魚購自浙江省湖州市,經(jīng)過2周暫養(yǎng)適應(yīng)試驗(yàn)條件,暫養(yǎng)期間使用購買的商品料進(jìn)行投喂。在正式試驗(yàn)開始前將暫養(yǎng)魚饑餓處理24 h,隨機(jī)挑選600尾體質(zhì)健康、規(guī)格均勻的大口黑鱸幼魚[初均重(12.96±0.07)g]隨機(jī)分成5組,每組4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30尾,以重復(fù)為單位養(yǎng)殖于網(wǎng)箱。每天進(jìn)行2次(08:00和16:00)表觀飽食投喂,持續(xù)8周,記錄每天的攝食量。當(dāng)有大口黑鱸死亡,及時(shí)將魚取出,計(jì)數(shù)并稱重。在飼養(yǎng)期間,養(yǎng)殖水體24 h充氣,不定期吸污、更換經(jīng)過曝氣的自來水,控制溶解氧濃度大于5 mg/L、氨氮含量小于0.5 mg/L、水溫28~31 ℃、pH 7.5~8.5。
養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,試驗(yàn)魚饑餓24 h,每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取7尾魚,用1 mL注射器從尾靜脈處取血,儲(chǔ)存在離心管中,在4 ℃下靜置24 h后在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min獲得的血清保存在-20 ℃條件下,用于血清代謝指標(biāo)的分析。取出內(nèi)臟團(tuán)后,剝離胃和腸道,并將腸道外圍的脂肪和腸道內(nèi)的殘余糞便清理干凈,用于消化酶活性的測(cè)定。取側(cè)線以上的肌肉冷凍干燥至恒重,粉碎并密封用于肌肉氨基酸和脂肪酸組成分析。之后,對(duì)剩余的大口黑鱸投喂含有三氧化二釔(Y2O3,0.1 mg/g)的飼料(相應(yīng)減少沸石粉的用量),每天投喂1 h后采集糞便,持續(xù)2周,用于表觀消化率的測(cè)定。所有樣品均在-20 ℃條件下保存。
取胃和腸道稱重,置于0.85 %生理鹽水中冷凍勻漿(m/v=1∶4),然后在4 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min,取上清液在12 h內(nèi)用于測(cè)定指標(biāo)。血清解凍之后同樣也在12 h內(nèi)測(cè)定指標(biāo)。采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定胃和腸道的淀粉酶、脂肪酶活性和血清代謝指標(biāo),用福林法(GB/T 23527—2009)測(cè)定胃和腸道蛋白酶活性。以上指標(biāo)均通過UV-3200紫外分光光度計(jì)測(cè)定。
采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(GB 5009.268—2016)測(cè)定糞便中Y2O3的含量:將糞便經(jīng)冷凍干燥后使用微波消解法消解后,使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP,美國)測(cè)定糞便中Y2O3的含量。用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測(cè)定糞便粗蛋白質(zhì)含量,用于表觀消化率和蛋白質(zhì)表觀消化率的計(jì)算。
采用酸水解法測(cè)定肌肉氨基酸組成:稱量肌肉干物質(zhì),加6 mol/L鹽酸溶液在110 ℃條件下水解24 h。水解完后,取1 mL水解液于進(jìn)樣瓶中在氨基酸自動(dòng)分析儀(S-433D,德國)上分析。
采用氯仿-甲醇法提取肌肉總脂,甲酯化后,使用氣相色譜儀(7890A,美國)聯(lián)合質(zhì)譜儀(5975A,美國)分析脂肪酸組,根據(jù)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的分析圖譜、保留時(shí)間以及質(zhì)譜分析對(duì)脂肪酸進(jìn)行定性和定量分析。
表觀消化率(%)=(1-飼料中Y2O3含量/糞便中Y2O3含量)×100;粗蛋白質(zhì)表觀消化率(%)=[1-(糞便中粗蛋白質(zhì)含量×飼料中Y2O3含量)/(飼料中粗蛋白質(zhì)含量×糞便中Y2O3含量)]×100;必需氨基酸指數(shù)(EAAI)=(A/AE×B/BE×……×I/IE)(1/n)。
式中:n為必需氨基酸數(shù)量;A,B,…,I為大口黑鱸肌肉中必需氨基酸含量;AE,BE,…,IE為全雞蛋蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量[37]。
所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進(jìn)行分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。當(dāng)方差分析確定組間差異顯著時(shí),則用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,顯著性水平為P<0.05。
由表2可以看出,添加維生素K3的各組胃和腸道的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均顯著低于未添加維生素K3的K0組(P<0.05)。K10組、K15組和K20組的表觀消化率和蛋白質(zhì)表觀消化率顯著低于K0組(P<0.05)。
表2 飼料中維生素K3含量對(duì)大口黑鱸消化能力的影響Table 2 Effects of dietary vitamin K3 content on digestive ability of largemouth bass
由表3可以看出,K20組血清尿素氮含量顯著高于其他4組(P<0.05),5組間血清總蛋白、白蛋白、總膽固醇和甘油三酯含量無顯著差異(P>0.05)。
表3 飼料中維生素K3含量對(duì)大口黑鱸血清代謝指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary vitamin K3 content on serum metabolism indexes of largemouth bass
在大口黑鱸肌肉中共檢測(cè)出17種氨基酸,其中必需氨基酸9種,非必需氨基酸8種,色氨酸未檢測(cè)。由表4可知,必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸含量及必需氨基酸指數(shù)在各組之間無顯著差異(P>0.05),但是隨著飼料中維生素K3含量的增加,必需氨基酸和總氨基酸含量呈增加的趨勢(shì)。K0組蘇氨酸、異亮氨酸和亮氨酸含量顯著低于其他4組(P<0.05)。
表4 飼料中維生素K3含量對(duì)大口黑鱸肌肉氨基酸組成的影響(濕重基礎(chǔ))Table 4 Effects of dietary vitamin K3 content on amino acid composition of largemouth bass (wet weight basis) g/kg
在大口黑鱸肌肉中共檢測(cè)出15種脂肪酸,其中飽和脂肪酸5種,單不飽和脂肪4種酸,多不飽和脂肪酸6種。由表5可以看出,K15組的單不飽和脂肪酸含量顯著高于其他4組(P<0.05),其中C16∶1n7和C18∶1n5的含量均顯著高于其他4組(P<0.05)。飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量在各組之間無顯著差異(P>0.05)。
表5 飼料中維生素K3含量對(duì)大口黑鱸肌肉脂肪酸組成的影響(濕重基礎(chǔ)) Table 5 Effects of dietary vitamin K3 content on fatty acid composition of largemouth bass (wet weight basis) mg/g
續(xù)表5項(xiàng)目 Items組別 GroupsK0K5K10K15K20C18∶1n51.86±0.10a1.80±0.22a1.82±0.12a2.19±0.11b1.97±0.11aC18∶1n90.03±0.000.03±0.000.02±0.000.03±0.010.03±0.00C20∶1n70.05±0.000.05±0.010.05±0.000.06±0.000.06±0.00ΣMUFA 2.28±0.13a2.23±0.27a2.23±0.15a2.72±0.14b2.46±0.13aC18∶2n61.02±0.090.97±0.120.97±0.041.00±0.031.01±0.06C18∶3n30.10±0.010.09±0.020.09±0.010.09±0.010.10±0.00C20∶4n60.03±0.000.03±0.000.02±0.000.03±0.000.02±0.01C20∶5n30.04±0.000.04±0.010.04±0.000.04±0.000.04±0.01C22∶5n60.06±0.000.05±0.000.05±0.000.05±0.000.05±0.01C22∶6n30.77±0.080.75±0.160.72±0.010.81±0.130.71±0.04ΣPUFA 2.01±0.181.93±0.291.90±0.072.02±0.121.94±0.11
飼料利用效率取決于魚的消化和吸收能力[38],消化能力與消化酶的活性密切相關(guān),包括蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶[39]。已有研究表明,維生素K3能夠促進(jìn)畜禽腸道蠕動(dòng)和分泌,進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收[40],但是在水產(chǎn)動(dòng)物中鮮有此方面的報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼料中添加維生素K3后,大口黑鱸的消化酶活性均顯著降低,表觀消化率和蛋白質(zhì)表觀消化率也有同樣的結(jié)果。但是Yuan等[22]研究發(fā)現(xiàn),適量的維生素K能夠顯著增強(qiáng)建鯉肝胰臟和腸道的消化酶活性,提高前腸的膽囊收縮素含量,并且認(rèn)為消化酶活性的提高可能與膽囊收縮素有關(guān)。在大西洋鮭的研究中也發(fā)現(xiàn)膽囊收縮素能夠促進(jìn)大西洋鮭胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌[41]。呂梅等[23]研究發(fā)現(xiàn)適量的維生素K3可以顯著提高五龍鵝的表觀消化率。Yuan等[22]還發(fā)現(xiàn)維生素K可能促進(jìn)腸道的生長發(fā)育,提高腸道刷狀緣酶活性,提高建鯉的吸收能力。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)添加維生素K3的試驗(yàn)組腸體比顯著高于對(duì)照組[35],推測(cè)維生素K3可以通過延長消化時(shí)間的方法幫助大口黑鱸吸收足夠的營養(yǎng);相反,對(duì)照組的腸體比顯著低于試驗(yàn)組,可能會(huì)導(dǎo)致魚體消化能力不足,需要通過其他途徑,如提高消化酶的活性,使機(jī)體的營養(yǎng)水平滿足生長發(fā)育的需求。但無論是改變腸長還是消化酶活性,添加維生素K3均降低了機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率,這是否與機(jī)體的整體代謝率下降有關(guān),還有待驗(yàn)證。
肝臟是維生素K代謝的主要部位,維生素K的羧化作用是在肝臟中完成的。飼料中維生素K的含量可能會(huì)影響肝臟的消化、合成、儲(chǔ)存和解毒功能[24]。血清總蛋白、白蛋白和尿素氮含量是反映蛋白質(zhì)代謝的重要指標(biāo),血清中總蛋白和白蛋白含量低表明水生生物營養(yǎng)不良,蛋白質(zhì)代謝狀態(tài)不佳[42-43]。動(dòng)物血清中90%~95%的蛋白質(zhì)在肝臟中合成,血清總蛋白含量可以作反映為動(dòng)物肝臟合成蛋白質(zhì)能力的一個(gè)指標(biāo),當(dāng)肝功能嚴(yán)重受損時(shí),蛋白質(zhì)的合成效率會(huì)降低,尤其是白蛋白。僅當(dāng)肝臟病變到一定程度之后,血清中的白蛋白含量才會(huì)出現(xiàn)顯著差異[44]。在本研究中,血清總蛋白和白蛋白含量在各組間無顯著差異,這一結(jié)果與王洋等[24]對(duì)松浦鏡鯉的研究結(jié)果一致。氨和尿素是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物,大多數(shù)魚類是排氨動(dòng)物,而形成尿素不僅有助于解除氨的毒性,還可以降低體內(nèi)由三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的二氧化碳溶于血液所產(chǎn)生的酸性。本試驗(yàn)中,K20組血清尿素氮含量顯著高于其他4組,可能是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制,也可能是由尿素氮排泄不暢導(dǎo)致的。Chiou等[45]給小鼠注射高劑量的維生素K,當(dāng)注射量≥25 mg/kg時(shí),小鼠腎臟出現(xiàn)顆粒變性的現(xiàn)象。當(dāng)飼料中維生素K3含量高達(dá)1 000~2 500 mg/kg,會(huì)對(duì)馬的腎臟造成損傷[46]。由此推測(cè),飼料中維生素K3含量過高可能會(huì)引起大口黑鱸腎臟受損,從而導(dǎo)致血清尿素氮含量增加。王洋等[24]對(duì)松浦鏡鯉的研究也發(fā)現(xiàn),當(dāng)飼料中維生素K3含量過高時(shí),血清尿素氮含量顯著增加,是其他組含量的2~3倍。血清總膽固醇和甘油三酯是血清脂質(zhì)的重要成分,兩者都可以作為體內(nèi)脂質(zhì)代謝的指標(biāo)。在本研究中,血清總膽固醇和甘油三酯含量各組間均無顯著差異,說明維生素K3對(duì)血脂代謝的影響較小,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
人體必須從食物中獲取賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸等8種必需氨基酸,來滿足人體新陳代謝的需求[47]。在本研究中,大口黑鱸攝食添加不同水平維生素K3的飼料,肌肉蘇氨酸、亮氨酸和異亮氨酸含量均顯著增加,更能滿足人體對(duì)這3種必需氨基酸的需求;與此同時(shí),隨著飼料中維生素K3含量的增加,肌肉組氨酸、精氨酸和酪氨酸含量有降低的趨勢(shì),但必需氨基酸和總氨基酸含量均有增長的趨勢(shì),說明維生素K3對(duì)肌肉氨基酸組成有一定程度的改善效果;5組之間必需氨基酸指數(shù)沒有顯著差異,且均大于0.95[48],說明大口黑鱸屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)食物。水產(chǎn)動(dòng)物的肌肉富含脂肪酸,是人類獲取脂肪酸的重要來源。脂肪酸中的不飽和脂肪酸對(duì)人體的身體健康以及生理功能有著極為重要的作用[49]。在本研究中,投喂含有15.84 mg/kg維生素K3的飼料,可以有效促進(jìn)大口黑鱸肌肉中C16∶1n7和C18∶1n5含量的提升。C16∶1n7可以幫助人體控制體重,改善皮膚狀況,預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等[50],但是C18∶1n5可能會(huì)使心血管疾病的發(fā)病率增加[51]。C22∶6n3(DHA)具有輔助人體腦細(xì)胞發(fā)育、改善血液循環(huán)等功能,雖然其含量在各組間無顯著差異,但是K15組的肌肉DHA含量高于其他組。綜上所述,飼料中添加適量的維生素K3對(duì)于大口黑鱸的肌肉氨基酸組成具有積極的改善作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),添加維生素K3的各試驗(yàn)組大口黑鱸的終末體重(44.01~47.46 g)均大于對(duì)照組(43.37 g)[35];對(duì)草魚的研究也得出了類似的結(jié)果[52-54]。上述結(jié)果表明肌肉氨基酸組成與體重有關(guān),也間接證明氨基酸在促進(jìn)魚體生長方面發(fā)揮著重要作用。不過,關(guān)于維生素K3對(duì)大口黑鱸氨基酸和脂肪酸組成影響的具體機(jī)制還不明確。
飼料中添加維生素K3對(duì)大口黑鱸的肌肉氨基酸組成具有積極的改善效果,當(dāng)飼料中維生素K3含量≥5.80 mg/kg時(shí)使大口黑鱸的消化能力下降,并且高劑量的維生素K3會(huì)使蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相關(guān)代謝發(fā)生改變。
動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)2022年1期