陸炎松，黃旭光，楊思霞，黃麗丹，趙建文，姜立甫

（1.南寧市園林科研所，廣西 南寧 530011；2.南寧市綠化工程管理中心，廣西 南寧 530011）

植物生長(zhǎng)離不開土壤，土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中十分重要的一部分，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化循環(huán)、抗干擾能力、系統(tǒng)穩(wěn)定性以及可持續(xù)利用中占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。根際作為連接土壤與植物的橋梁，其所含微生物種類眾多，按對(duì)植物的作用可分為有益微生物和有害微生物[2]。根際有益微生物通常通過產(chǎn)生激素類物質(zhì)、促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收、誘導(dǎo)植株增強(qiáng)抗性等直接作用方式和抑制病原菌生長(zhǎng)的間接作用方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)[3]。

天桃木Mangifera persiciformis為漆樹科Anacardiaceae杧果屬M(fèi)angifera常綠闊葉喬木[4]，樹形優(yōu)美，是優(yōu)良的街道綠化樹種，作為南寧市市樹，被廣泛應(yīng)用在南寧市市政綠化工程中。但由于天桃木苗木從苗木基地移植至苗圃假植時(shí)成活率較低，而且愈后不良率高，造成除市政工程以外很少有住宅區(qū)、公園等種植天桃木[5]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于天桃木的研究主要集中在移植技術(shù)及水分利用效率等方面[6-7]，而對(duì)于天桃木土壤微生物方面的研究還未見報(bào)道。本研究采用第三代高通量測(cè)序技術(shù)，比較了不同地區(qū)原生天桃木土壤細(xì)菌群落的多樣性和優(yōu)勢(shì)菌群，并通過測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì)，探究土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)天桃木土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，為挖掘有益微生物功能促進(jìn)天桃木復(fù)壯提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

廣西南寧、崇左、百色等地為種植天桃木較多且適宜天桃木生長(zhǎng)的區(qū)域，本研究在以上地區(qū)共設(shè)置4個(gè)樣地。研究區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)西南部，地理坐標(biāo)為22.522°～ 23.758° N，106.796°～ 108.663° E，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，夏季氣溫高、降雨多、日照時(shí)間長(zhǎng)，冬季日照時(shí)間短、天氣干暖。年均溫為21.7～ 22.1℃，年均降水量為1 093～ 1 295 mm。研究區(qū)概況見表1。

表1 研究區(qū)概況Table 1 Information of research areas

1.2 土壤樣品采集與處理

2020年6月，分別在每個(gè)樣地設(shè)置3個(gè)20 m×20 m典型樣方，先去除樣方內(nèi)的地表雜物，然后以天桃木的主莖為中心在50～ 80 cm半徑范圍內(nèi)取土。采用土鉆法在每個(gè)樣方內(nèi)用“S”形采集5個(gè)點(diǎn)的0～ 20 cm土壤樣品，每個(gè)樣地共采集15個(gè)土樣，挑去石塊、根系等雜物，將其混勻后用“四分法”取得1 kg的鮮土作為1個(gè)混合土樣，4個(gè)樣地共得到4個(gè)混合土樣。將混合土樣裝入無菌自封袋中，于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。每份混合土樣一部分自然風(fēng)干后過2 mm篩，供土壤理化性質(zhì)測(cè)定使用；另一部分鮮樣置于－80℃冰箱保存，供微生物測(cè)序分析使用。

1.3 測(cè)定方法

土壤理化性質(zhì)測(cè)定：土壤pH采用水土比例1∶2.5玻璃電極法測(cè)定；土壤有機(jī)碳（Soil organic carbon,SOC）含量采用重鉻酸鉀-水合加熱法測(cè)定；土壤全N（Total nitrogen,TN）含量采用凱氏定氮法測(cè)定；土壤全P（Total phosphorous，TP）含量采用鉬銻抗比色法測(cè)定；土壤堿解N（Available nitrogen,AN）含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；土壤有效P（Available phosphorous,AP）含量采用氟化銨—鹽酸浸提，鉬銻抗比色，紫外分光光度法測(cè)定；土壤速效K（Available potassium,AK）含量采用中性乙酸銨溶液浸提，火焰光度計(jì)法測(cè)定[8]。

土壤DNA提取純化：采用CTAB方法提取樣本總DNA[9]。用Qubit2.0檢測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。DNA樣品濃度＞10 ng·μL-1，樣品純度有明顯條帶；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰，無降解，符合接下來的測(cè)序條件。

PCR擴(kuò)增及測(cè)序：細(xì)菌的PCR擴(kuò)增及測(cè)序服務(wù)由北京擎科生物科技有限公司完成。擴(kuò)增引物為27F（16S-F）：AGRGTTTGATYNTGGCTCAG和1492R（16S-R）：TASGGHTACCTTGTTASGACTT。擴(kuò)增條件設(shè)置：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。提取樣品總DNA后，根據(jù)16S全長(zhǎng)引物27F和1492R，合成帶有Barcode的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測(cè)序文庫(kù)（SMRTBell），對(duì)建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，并對(duì)質(zhì)檢合格的文庫(kù)用PacBioSequel平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 物種注釋與豐度計(jì)算

使用Limav 1.7.0軟件，通過Barcode對(duì)CCS進(jìn)行識(shí)別，得到Barcode-CCS序列數(shù)據(jù)；對(duì)Barcode-CCS序列數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到有效序列；使用UCHIMEv 4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Optimization-CCS序列。使用Usearch軟件對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTU，并基于Silva（細(xì)菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。使用Mothur（Version V.1.30）軟件計(jì)算Chao 1指數(shù)和Simpson指數(shù)等Alpha多樣性指數(shù)。利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行處理，用DPS 9.01進(jìn)行單因素方差分析、多重比較分析（LSD法）。使用Canoco 4.5軟件對(duì)土壤環(huán)境因子和細(xì)菌群落進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)分析

由表2可見，4個(gè)樣地的土壤pH均呈弱酸性，A1、A2、B1的土壤pH之間差異均不顯著，但其與C1之間均差異顯著（P＜0.05）。B1、C1的土壤SOC、TN、AP含量之間均差異不顯著，其土壤SOC、TN含量均顯著高于A1和A2的（P＜0.05），但土壤AP含量卻顯著低于A1和A2的（P＜0.05）。4個(gè)樣地的土壤TP、AN含量差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表2 不同樣地土壤的化學(xué)性質(zhì)Table 2 Chemical properties of the soil at different research areas

2.2 細(xì)菌多樣性指數(shù)

通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤樣品的微生物細(xì)菌部分進(jìn)行測(cè)序，共獲得有效序列27 017條，片段長(zhǎng)度在1 454～ 1 457 bp，測(cè)序覆蓋度在97.90%～ 99.13%之間?；谄錅y(cè)序深度基本能夠反映該區(qū)域所涵蓋的細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)以及種類等特性，可以定量比較整個(gè)群落組成和多樣性的相對(duì)差異。

不同樣品的Alpha多樣性指數(shù)，如Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)代表群落物種豐富度，其數(shù)值越大，說明菌群的豐度越高；Shannon豐富度指數(shù)代表群落物種多樣性，Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)代表常見物種[10]。研究結(jié)果表明（表3），Simpson指數(shù)，A2與C1之間差異不顯著；ACE指數(shù)，A1與A2、B1之間差異不顯著，但均顯著高于C1（P＜0.05）；Chao1指數(shù)，A1、A2、B1之間差異不顯著，但均顯著高于C1（P＜0.05）；Shannon指數(shù)，A1、A2、B1之間差異不顯著，均與C1之間差異顯著（P＜0.05）。這說明在4個(gè)樣地中C1的細(xì)菌群落豐富度和多樣性均為最低。在4個(gè)樣地中，C1的土壤pH值最高，林齡最大，這可能是導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性低的主要原因。

表3 土壤微生物多樣性指數(shù)Table 3 Soil bacterial diversity index

2.3 門水平上土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度分析

在門水平上，4個(gè)樣地的土壤中共檢測(cè)出23門細(xì)菌，其中在A1樣地土壤中有21門，在A2樣地土壤中有21門，在B1樣地土壤中有20門，在C1樣地土壤中有21門。由圖1可知，相對(duì)豐度排名前10位的依次為變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteriota、疣微菌門Verrucomicrobia、浮霉菌門Planctomycetota、擬桿菌門Bacteroidota、放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、硝化螺旋菌門Nitrospirae、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、Myxococcota。

圖1 土壤細(xì)菌門水平相對(duì)豐度Figure 1 Relative abundance of soil bacteria at the phylum level

2.4 屬水平上土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度分析

在屬水平上，4個(gè)樣地的土壤中共檢測(cè)出118屬細(xì)菌。其中在A1樣地土壤中有96屬，在A2樣地土壤中有100屬，在B1樣地土壤中有89屬，在C1樣地土壤中有70屬。由圖2可知，相對(duì)豐度排名前10位的物種依次為Vicinamibacter、疣微菌屬Pedosphaera、硝化螺旋菌屬Nitrospira、芽單胞菌屬Gemmatimonas、Pseudolabrys、土生單胞菌屬Terrimonas、Candidatus Udaeobacter、Ramlibacter、Gaiella、Aeromonas。其中Vicinamibacter在各樣地中均具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

圖2 土壤細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度Figure 2 Relative abundance of soil bacteria at the genus level

2.5 種水平上土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度分析

在種水平上，4個(gè)樣地的土壤中共檢測(cè)出123種細(xì)菌。其中在A1樣地土壤中有92種，在A2樣地土壤中有94種，在B1樣地土壤中有85種，在C1樣地土壤中有67種。Vicinamibacter silvestris、疣微菌Pedosphaera parvula、芽單胞菌Gemmatimonassp.、土生單胞菌Terrimonassp.、Candidatus Udaeobacter copiosus、Gaiella occulta、硝化螺旋菌Nitrospira japonica、Pseudolabrys taiwanensis是不同樣地天桃木根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群。

圖3 土壤細(xì)菌種水平相對(duì)豐度Figure 3 Relative abundance of soil bacteria at the species level

2.6 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門、屬、種相對(duì)豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)之間的相關(guān)性

對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門、優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種的相對(duì)豐度和土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行冗余分析（圖4）。結(jié)果顯示，軸Ⅰ和軸Ⅱ門、屬、種的累計(jì)解釋變異量分別達(dá)78.62%、82.42%和79.85%。在門和屬水平上，土壤AP含量、AK含量、pH對(duì)細(xì)菌群落組成影響較大。在種水平上，土壤pH、AP含量、TP含量對(duì)細(xì)菌群落種水平組成影響較大。

圖4 土壤化學(xué)因子和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門、屬、種相對(duì)豐度冗余度分析Figure 4 Redundancy analysis on soil chemical properties and relative abundance of dominant bacterial phylum,genera and species

對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群和土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析（表4）。結(jié)果表明，在門水平上，酸桿菌門的相對(duì)豐度與土壤pH呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；疣微菌門的相對(duì)豐度與土壤AP含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；擬桿菌門的相對(duì)豐度與土壤SOC、TN含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與土壤AP含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；放線菌門的相對(duì)豐度與土壤pH、土壤TP含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與土壤AN含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；硝化螺旋菌門的相對(duì)豐度與土壤AP含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；芽單胞菌門的相對(duì)豐度與土壤SOC、TN含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；Myxococcota與土壤TP含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。在屬水平上，Vicinamibacter的相對(duì)豐度與土壤AK含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；硝化螺旋菌屬的相對(duì)豐度與土壤AP含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；芽單胞菌屬的相對(duì)豐度與土壤SOC含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；Pseudolabrys的相對(duì)豐度與土壤pH呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與土壤TP含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。在種水平上，Vicinamibactersilvestris的相對(duì)豐度與土壤AK含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；芽單胞菌的相對(duì)豐度與土壤SOC含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；硝化螺旋菌的相對(duì)豐度與土壤TP、AN含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；Pseudolabrys taiwanensis的相對(duì)豐度與土壤pH、土壤TP含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。

表4 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群與土壤化學(xué)因子相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between dominant bacteria groups and soil chemical properties

3 討論

3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)天桃木土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

不同土壤細(xì)菌類群的生存和繁衍需要不同的環(huán)境條件。冗余分析結(jié)果表明，土壤pH、AP含量和AK含量對(duì)細(xì)菌群落門水平及屬水平影響較大，土壤pH、AP含量和TP含量對(duì)細(xì)菌群落種水平組成影響較大。土壤pH 在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)過程中起著重要作用，對(duì)土壤中理化反應(yīng)都具有重要的調(diào)節(jié)作用，是影響細(xì)菌分布的重要因子[11]。土壤中的P也是土壤細(xì)菌的重要營(yíng)養(yǎng)來源，P的多少影響土壤細(xì)菌在土壤中的生存和繁殖。安然等研究發(fā)現(xiàn)土壤AP含量變化會(huì)引起土壤細(xì)菌群落的變化[12]。本研究中，土壤pH、AP含量對(duì)細(xì)菌群落門、屬、種水平均影響較大，印證了這一說法。微生物分泌有機(jī)酸產(chǎn)生的溶磷作用，一方面與分泌的有機(jī)酸的種類和數(shù)量有關(guān)，另一方面與磷酸根結(jié)合的陽(yáng)離子有關(guān)。如果微生物分泌的有機(jī)酸多，土壤中的Ca-P化合物也多，溶解釋放的磷也相對(duì)較多[13]。本試驗(yàn)中A1、A2樣地土壤中的TP含量顯著高于B1、C1樣地，AP含量卻顯著低于B1、C1樣地，可能是由于A1、A2樣地土壤中溶磷微生物分泌的有機(jī)酸較多，且A1、A2樣地屬同一地區(qū)，其土壤中可能含有較多的Ca-P化合物。

3.2 天桃木土壤樣本高豐度微生物潛在功能探討

在門水平上，變形菌門是4個(gè)樣地土壤中的第一大優(yōu)勢(shì)菌群。變形菌門成員在生態(tài)環(huán)境中分布廣泛。有研究表明，好氧甲烷氧化菌可分為14個(gè)屬，包括研究較為深入的隸屬于變形菌門Alpha和Gamma綱的細(xì)菌，以及屬于疣微菌門的極端嗜熱嗜酸甲烷氧化菌[14]。甲烷氧化菌是自然界中唯一的甲烷生物匯，其氧化作用可消耗大氣中至少10%的甲烷[15]。本研究土樣中鑒定的優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)seudolabrys taiwanensis隸屬于Alphaproteobacteria綱，菌株Aeromonassp.隸屬于Gammaproteobacteria綱，其可能具備氧化甲烷的功能。酸桿菌門為4個(gè)樣地的第二大優(yōu)勢(shì)菌群。酸桿菌門菌株最早由Kishimoto等[16]在1991年分離自酸性礦山環(huán)境，并于1995年將酸桿菌劃分為新的細(xì)菌類群[17]。目前，基于16SrRNA基因序列將酸桿菌門細(xì)菌劃分為26個(gè)亞群，即Gp1～ 26[18]。酸桿菌廣泛分布在自然界中，在土壤中的數(shù)量約占細(xì)菌總量的20%～ 50%，與變形桿菌不相上下[19]。酸桿菌門可培養(yǎng)菌株經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，可以降解植物纖維素[20]、參與鐵循環(huán)[21]及單碳化合物的代謝過程[22]。但相對(duì)于自然環(huán)境中酸桿菌的多樣性而言，可培養(yǎng)菌株依然很少且大部分屬于Gp1亞群[19]。本研究中的優(yōu)勢(shì)菌株Vicinamibacter silvestris屬于Gp6亞群[23]，其是否具備其它可培養(yǎng)菌株的功能還有待研究。優(yōu)勢(shì)菌株硝化螺旋菌隸屬于硝化螺旋菌屬。硝化螺旋菌屬細(xì)菌可以將土壤中的亞硝酸氧化成硝酸鹽，而硝酸鹽是土壤中作物易吸收的氮源形式，因此，土壤中硝化螺旋菌的增加可以間接地增加土壤氮肥力[24]。放線菌作為一類具備生物防治潛力的微生物資源，其可以產(chǎn)生種類豐富的抗生素和其他生物活性代謝產(chǎn)物[25]。目前應(yīng)用較多的放線菌隸屬于鏈霉菌屬[26]，本研究中的優(yōu)勢(shì)菌株Gaiella occulta隸屬于Gaiella屬，最顯著的特征是存在其他細(xì)菌中沒有的iso內(nèi)部支化脂肪酸[27]。根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是一類能高密度定殖在植物根際的微生物，兼有抑制植物病原菌、根際有害微生物，以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)并增加作物產(chǎn)量的作用。相關(guān)研究表明，Terrimonas屬的T.aquatica、T.arctica、T.lutea等菌株具有促進(jìn)根系發(fā)育、增加葉面積等改善植物農(nóng)藝性狀的功能[28]。本研究中的優(yōu)勢(shì)菌株土生單胞菌Terrimonassp.隸屬Terrimonas屬，其可能也具備促生功能。

馬尾松Pinus massoniana[29]、香榧Torreya grandis‘Merrillii’[30]、鹽穗木Halostachys caspica[31]根際土壤細(xì)菌群落組成主要是由變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、疣微菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門等組成，與本研究結(jié)果相似，但在屬水平上的細(xì)菌群落組成差異較大。以上樹種根際土壤細(xì)菌微生物多樣性分析均未在種水平上進(jìn)行分析。本研究利用第三代高通量測(cè)序技術(shù)，可在種水平上對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析，為天桃木根際土壤有益微生物的開發(fā)利用創(chuàng)造了條件。

廣西不同地區(qū)天桃木土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門類群主要包括變形菌門、酸桿菌門，優(yōu)勢(shì)屬類群主要包括Vicinamibacter、疣微菌屬，優(yōu)勢(shì)種類群主要包括酸桿菌、疣微菌。土壤pH、有效P含量對(duì)不同水平的細(xì)菌群落組成均具有影響。