徐千瑞，周星怡，李賀鵬，岳春雷

（1.浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 318020；2.南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，江蘇 南京 210095；3.浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

鹽脅迫指植物的生長環(huán)境中存在過量鈉離子和氯離子[1]，影響植物的生長及分布[2]。全世界受鹽脅迫影響的土壤非常多，已有超過20%的農(nóng)林耕地受到鹽分的危害，并且數(shù)量仍在不斷增加[3]，預計到21世紀中葉，將有半數(shù)耕地出現(xiàn)土壤鹽漬化現(xiàn)象[4]，這會對土地利用、植株生存及作物生產(chǎn)造成嚴重威脅[5]。土壤鹽漬化以及鹽漬化土地資源該如何利用，成為了一個世界性難題[6]。首先，土壤鹽脅迫會通過滲透脅迫提高植物細胞的滲透勢，使植物體無法正常吸收水分，這種危害會長期存在；其次，由離子脅迫造成的離子失調(diào)使植物缺少生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素；最后，產(chǎn)生氧化脅迫，即加深膜脂過氧化程度，破壞細胞結(jié)構(gòu)以及紊亂代謝[7-10]。為了抵抗土壤鹽脅迫造成的傷害，植物自身會表現(xiàn)出一系列的生理及生態(tài)適應性變化，以調(diào)節(jié)葉片內(nèi)離子和水分的平衡，維持正常的生理活動[2]。因此，研究植物在鹽脅迫環(huán)境中生理生化指標的變化，對于了解植物的耐鹽機理，評價植物的耐鹽性以及篩選耐鹽植物進行鹽漬化土地造林具有重要意義。

日本莢蒾Viburnum japonicum為常綠喬灌木，主要分布在環(huán)太平洋西部海島，在我國僅生長于臺灣省的北部海岸、浙江省臺州市以及舟山市的部分海島，分布范圍狹窄，數(shù)量稀少，需要重點保護[11-14]。日本莢蒾葉片革質(zhì)深綠，白花簇狀，熟果鮮紅，觀賞性好，園林價值高[15]。近年來，對日本莢蒾的研究主要集中在抗旱性[16]、耐蔭性[17]、扦插繁殖[18]、遺傳多樣性[19]等方面。李瑞姣等[20]發(fā)現(xiàn)日本莢蒾幼苗對輕中度干旱脅迫具有一定的抵抗能力，并且在遮陰條件下能正常生長，具有耐蔭性；王寶黨等[18]認為混合基質(zhì)更適宜日本莢蒾插穗生根。與其它植物相比，對日本莢蒾的研究進展較為緩慢[21]，且目前并沒有關于此瀕危海島植物耐鹽性的相關研究。本試驗選用3年生日本莢蒾實生苗，研究日本莢蒾生理生化指標對土壤鹽脅迫的響應，分析該植物的耐鹽機理，探討其對土壤鹽脅迫的抵抗能力，有利于更加充分地了解日本莢蒾的瀕危原因，同時為該植物的種群恢復、遷地引種以及推廣應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用浙江省臨海市林業(yè)技術推廣總站提供的日本莢蒾3年生實生苗，苗高約為50 cm，冠幅約為40 cm。植株生長旺盛、長勢基本一致。試驗所用苗木的栽培方法為盆栽法，選擇下口直徑為16 cm、上口直徑為21.3 cm、高為20 cm的塑料盆缽，每盆內(nèi)裝入挖取于苗圃的混勻熟土（有機質(zhì)含量為27.43 g·kg-1，有效氮含量為0.175 g·kg-1，有效磷含量為70.50 g·kg-1，速效鉀含量為20.57 g·kg-1）5 kg，每盆栽入1株日本莢蒾幼苗。

1.2 試驗設計

2020年6月，將日本莢蒾容器苗移入浙江省林業(yè)科學研究院大棚內(nèi)緩苗，期間進行正常養(yǎng)護。日本莢蒾適應生長1個月后，挑選長勢基本一致的植株進行土壤鹽脅迫處理。為防止鹽分滲漏，每盆植物的下方墊有托盤。試驗共設置6個土壤鹽分梯度，于2020年7月13日一次性澆入不同濃度的NaCl溶液，使土壤含鹽量分別為0（CK）、0.15%、0.30%、0.45%、0.60%、0.75%。每個處理重復4株容器苗。植株經(jīng)過土壤鹽脅迫處理之后，于2020年7月23日、8月2日、8月12日及8月22日分別進行一次采樣及各項指標的測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生理生化指標的測定 每個處理隨機選擇3株日本莢蒾容器苗，每株選取正常枝條的中上部成熟葉片2～3片，將采得的葉片立即編號并用液氮進行冷凍處理，帶回實驗室后保存于－80℃的冰箱中備用。

丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，運用LSD法進行顯著性分析和多重比較，使用Origin 2018繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤鹽脅迫對日本莢蒾葉片MDA含量的影響

由圖1可知，在土壤鹽脅迫下，日本莢蒾葉片的MDA含量均高于CK的，且在脅迫的同一階段，葉片的MDA含量隨著土壤含鹽量的升高持續(xù)上升。鹽脅迫初期（10 d），在0.60%和0.75%土壤含鹽量環(huán)境中的植株葉片的MDA含量顯著高于前4組處理的（P<0.05）；鹽脅迫20 d時，0.30%和0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的MDA含量顯著增加（P<0.05），與同濃度鹽脅迫10 d時相比分別增加了54.8%和41.2%，0.60%和0.75%土壤含鹽量處理組的植株死亡；鹽脅迫30 d后，0.30%和0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的MDA含量繼續(xù)增大，較同濃度鹽脅迫20 d時分別增加了31.3%與45.4%；鹽脅迫40 d時，0.15%土壤含鹽量處理組植株葉片的MDA含量增量較大，與CK產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05），而0.30%和0.45%土壤含鹽量處理組的植株死亡。

圖1 不同濃度土壤鹽分處理下日本莢蒾葉片MDA含量的變化Figure 1 MDA content in leaves of V.japonicum under different salt treatments

2.2 土壤鹽脅迫對日本莢蒾葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖2可知，在土壤鹽脅迫處理下，各處理組日本莢蒾葉片的可溶性蛋白含量均高于CK的，且在脅迫的同一階段，植物葉片細胞內(nèi)的可溶性蛋白含量與土壤含鹽量成正比。0.15%土壤含鹽量處理組植株葉片的可溶性蛋白含量從鹽脅迫30 d開始與CK產(chǎn)生較大差異（P<0.05），而其他處理組植株葉片的可溶性蛋白含量在鹽脅迫初期（10 d）就顯著高于CK的（P<0.05）。

圖2 不同濃度土壤鹽分處理下日本莢蒾葉片可溶性蛋白含量的變化Figure 2 Soluble protein content in leaves of V.japonicum under different salt treatments

由圖3可知，日本莢蒾葉片可溶性糖含量的變化情況與可溶性蛋白含量的變化類似，隨著土壤含鹽量的升高持續(xù)上升，但在鹽脅迫10 d時，0.30%土壤含鹽量處理組植株葉片的可溶性糖含量略低于0.15%土壤含鹽量處理組的。

圖3 不同濃度土壤鹽分處理下日本莢蒾葉片可溶性糖含量的變化Figure 3 Soluble sugar content in leaves of V.japonicum under different salt treatments

2.3 土壤鹽脅迫對日本莢蒾葉片抗氧化酶活性的影響

SOD和POD是植物葉片細胞內(nèi)重要的抗氧化酶，可反映出植物對脅迫環(huán)境的響應。由圖4可以得知，在鹽脅迫的10 d和20 d時，日本莢蒾葉片的SOD活性與土壤含鹽量及脅迫持續(xù)時間成正比；在鹽脅迫30 d時，0.30%和0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的SOD活性較鹽脅迫20 d時下降，其中，0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的SOD活性降至CK之下，比CK的低7.9%；鹽脅迫40 d時，0.15%土壤含鹽量處理組植株葉片的SOD活性大幅上升，與CK差異顯著（P<0.05）。

圖4 不同濃度土壤鹽分處理下日本莢蒾葉片SOD活性的變化Figure 4 SOD activity in leaves of V.japonicum under different salt treatments

由圖5可知，鹽脅迫10 d時，除0.60%及0.75%土壤含鹽量處理組外，植株葉片的POD活性隨土壤含鹽量的升高而上升，而0.60%及0.75%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性均低于CK的，且兩組中土壤含鹽量越高的處理組植株葉片的POD活性越低；鹽脅迫持續(xù)20 d時，0.15%及0.30%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性繼續(xù)上升，0.30%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性達到了最大值，而0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性較鹽脅迫10 d時下降，0.60%及0.75%土壤含鹽量處理組植株死亡；鹽脅迫30 d時，0.15%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性達到了最大值，0.30%及0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性較鹽脅迫20 d時下降，0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性降至CK之下；當鹽脅迫持續(xù)40 d時，0.15%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性下降，但仍高于CK的，其余處理組植株死亡。

圖5 不同濃度土壤鹽分處理下日本莢蒾葉片POD活性的變化Figure 5 POD activity in leaves of V.japonicum under different salt treatments

綜上所述，隨著土壤鹽脅迫的持續(xù)進行，日本莢蒾葉片的SOD活性在輕度脅迫（0.15%土壤含鹽量）下持續(xù)上升，在中度脅迫（0.30%土壤含鹽量）下先上升后下降；0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性持續(xù)下降，CK、0.15%及0.30%土壤含鹽量處理組植株葉片的POD活性呈先上升后下降的趨勢。

2.4 土壤鹽脅迫下日本莢蒾葉片各生理指標相關性分析

由表1可以得知，日本莢蒾在土壤鹽脅迫下，葉片中的MDA含量與可溶性蛋白及可溶性糖含量具有極顯著正相關關系（P<0.01），與POD活性具有負相關關系，但相關性不顯著。可溶性蛋白含量與可溶性糖含量呈極顯著正相關（P<0.01），與POD活性呈負相關，但相關性不顯著。

表1 鹽脅迫下日本莢蒾葉片各生理生化指標的相關系數(shù)Table 1 Correlation coefficients of physiological and biochemical index in V.japonicum leaves under salt stress

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

土壤鹽脅迫會對植物造成許多不利影響，使植物的生長狀況、形態(tài)特征、生理指標等發(fā)生較大變化[22]。在本試驗中，沒有鹽脅迫的日本莢蒾植株生長旺盛，長勢較好，0.15%土壤含鹽量處理組的植株在脅迫期間幾乎沒有鹽害癥狀，而在0.30%及以上土壤含鹽量環(huán)境中，隨著脅迫時間的增加植株陸續(xù)死亡。以上結(jié)果說明日本莢蒾植株在0.15%及以下含鹽量土壤環(huán)境中能夠正常生長，而在0.30%及以上含鹽量土壤環(huán)境中無法長期存活。

植物在脅迫環(huán)境中由于膜脂過氧化作用產(chǎn)生MDA，MDA的形成代表著植物細胞膜遭到了破壞[23]。研究表明，植物葉片中MDA含量的變化規(guī)律與該植物的耐鹽能力有關：在土壤鹽脅迫過程中，植物葉片細胞內(nèi)的MDA含量越高，說明該植物抵抗鹽脅迫的能力越弱[24]。本試驗中，在不同程度的土壤鹽脅迫下，各處理組日本莢蒾葉片的MDA含量均高于CK的。鹽脅迫10 d時，0.15%～ 0.45%土壤含鹽量環(huán)境中植株葉片的MDA含量雖高于CK的但二者間的差距不顯著（P＞0.05），可以認為試驗初期該鹽脅迫濃度范圍中日本莢蒾葉片的細胞膜幾乎沒有遭到破壞，而0.60%及0.75%土壤含鹽量處理組植株葉片的MDA含量明顯高于CK的，說明這兩組處理的植株葉片在試驗初期膜脂過氧化程度就很高，細胞膜遭到了嚴重破壞；0.30%及0.45%土壤含鹽量處理組在鹽脅迫10 d以后植株葉片的MDA含量持續(xù)大幅度上升，說明這兩組植株在土壤鹽脅迫的過程中細胞膜的破壞程度不斷加深，直至死亡；0.15%土壤含鹽量處理組植株葉片的MDA含量與CK在鹽脅迫40 d之前均無顯著性差異（P＞0.05），直至鹽脅迫40 d時大幅增加，出現(xiàn)脅迫癥狀。而佘建煒等[25]在研究沼澤小葉樺Betula microphyllavar.paludosa時發(fā)現(xiàn)，該植物在土壤鹽脅迫處理下葉片的MDA含量總體上低于CK的，這與本試驗結(jié)果有差異。王斌等[26]發(fā)現(xiàn)，沼澤小葉樺的野生種主要生長于鹽堿沼澤地中，耐鹽能力較強，而日本莢蒾在0.30%及以上土壤含鹽量環(huán)境中脅迫反應明顯，這進一步體現(xiàn)出日本莢蒾的耐鹽性不強。

土壤鹽脅迫會提高植物的滲透勢，植物通過合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)使植物能夠從外界汲取水分[27]。在土壤鹽脅迫環(huán)境中，可溶性蛋白和可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)會提高植物的耐鹽能力[28]，同時，可促進植物體內(nèi)有機物的合成，增強細胞膜的穩(wěn)定性，也可對酶類產(chǎn)生保護作用[29]。在本試驗中，植株葉片的可溶性糖及可溶性蛋白含量與MDA含量均具有極顯著正相關性（P<0.01）。隨著土壤鹽濃度的升高和脅迫的持續(xù)進行，植株葉片的MDA含量攀升，細胞膜遭到嚴重破壞。為了提高植物葉片的滲透調(diào)節(jié)能力以降低脅迫對細胞膜的破壞程度，日本莢蒾細胞中的可溶性蛋白含量及可溶性糖含量隨著MDA含量的升高不斷上升，這說明日本莢蒾通過提高體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量降低細胞的滲透勢，緩解細胞膜的膜脂過氧化程度，進而減輕土壤鹽脅迫對植物造成的危害。本試驗對日本莢蒾滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的研究結(jié)果與鹽脅迫下白刺Nitraria tangutorum[30]的研究結(jié)果一致，可溶性蛋白與可溶性糖的含量都與土壤含鹽量成正比，說明植物在受到鹽脅迫時會通過合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低脅迫對自身造成的傷害。

在受到土壤鹽脅迫時，植物會通過提高細胞內(nèi)抗氧化酶活性清除多余活性氧，減少活性氧積累對植物造成的傷害[24]。SOD和POD可通過協(xié)同作用降低細胞內(nèi)的活性氧數(shù)量。SOD將活性氧轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，POD清除由SOD產(chǎn)生的H2O2[31]。在正常環(huán)境中，植物體內(nèi)的活性氧數(shù)量會保持相對平衡，而當植物處于脅迫環(huán)境中其活性氧的清除數(shù)量要低于所產(chǎn)生數(shù)量，隨著活性氧積累數(shù)量的增加會促使植物啟動自我保護機制，即通過提高抗氧化酶活性清除體內(nèi)多余的活性氧[32]。在本試驗中，隨著土壤鹽脅迫的持續(xù)進行，日本莢蒾葉片的SOD活性與POD活性總體上呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但不同濃度鹽分處理下的植株抗氧化酶活性的變化情況存在較大差異。本研究中，日本莢蒾在受到土壤鹽脅迫處理后，0.15%土壤含鹽量處理組植株葉片的SOD活性持續(xù)上升，POD活性上升至鹽脅迫40 d時開始下降，體現(xiàn)出日本莢蒾在土壤含鹽量為0.15%的脅迫環(huán)境中，會通過提高抗氧化酶活性抵抗由脅迫造成的傷害，說明日本莢蒾在輕度土壤鹽脅迫（0.15%及以下土壤含鹽量）中耐鹽性較高。彭立新等[33]發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫環(huán)境中沙棗Elaeagnus angustifolia幼苗的抗氧化酶活性先上升后下降，由此提出了植物細胞只能承受一定范圍內(nèi)的活性氧積累，一旦超出這個范圍會造成膜脂過氧化程度加深，細胞結(jié)構(gòu)被破壞，進而降低植物耐鹽能力的結(jié)論。在本試驗中，隨著脅迫的持續(xù)進行，0.30%土壤含鹽量處理組植株葉片的SOD、POD活性及0.45%土壤含鹽量處理組植株葉片的SOD活性也表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明隨著脅迫的持續(xù)進行，日本莢蒾在中度土壤鹽脅迫中受到的鹽害會不斷增強。0.60%及0.75%土壤含鹽量處理組植株葉片的SOD活性高于CK的，而POD活性顯著低于CK的，說明在重度土壤鹽脅迫下植物體內(nèi)SOD的作用高于POD的，但細胞內(nèi)部積累的活性氧數(shù)量超出了細胞可承受范圍，多余活性氧破壞了抗氧化酶系統(tǒng)，導致植物對重度土壤鹽脅迫的抵抗能力弱。

3.2 結(jié)論

綜上所述，日本莢蒾耐鹽性弱，在0.15%及以下土壤含鹽量環(huán)境中，會通過提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性降低細胞滲透勢，抵抗膜脂過氧化作用，維持植物生理活動的正常進行。但當土壤含鹽量達到0.30%及以上時，日本莢蒾的生理調(diào)節(jié)系統(tǒng)遭到破壞，活性氧不斷積累，膜脂過氧化程度持續(xù)加深，最終導致植株死亡。因此，在日本莢蒾的遷地保護和栽培過程中應選擇土壤含鹽量低的立地以保證植物正常生長。日本莢蒾喜溫和多雨的海洋性氣候，自然分布僅限于海島[21]，而海島土壤鹽漬程度相對較高[34]，因此，推測日本莢蒾耐鹽性低是致使該種群擴散困難的原因之一。