田 良，孫 瑞，陳 雪，李婷婷，許建峰，3，4，李仕豪，孫博文，馬蘭潔，楊忠明

(1. 寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；2. 平羅縣中醫(yī)院，寧夏 平羅 753400；3. 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004；4. 寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004；5. 銀川市中醫(yī)院，寧夏 銀川 750001)

腰椎間盤突出癥慢性疼痛是一種難治性疼痛，患者會出現(xiàn)多部位疼痛、肌肉僵直、焦慮、抑郁等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。當機體發(fā)生疼痛時，軀體感覺通路被激活，除外周炎性損傷外，中樞系統(tǒng)也會發(fā)生一系列的復雜變化。其中中樞敏化是疼痛超敏的主要原因，也是痛覺過敏的主要病理基礎(chǔ)[1]。國際疼痛研究協(xié)會將中樞敏化定義為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中傷害感受神經(jīng)元對其正?；蜷撓聜魅胼斎氲姆磻栽黾覽2]。烙灸療法是將艾絨放置于特制器具中點燃并直接烙于病痛部位，使局部發(fā)紅或發(fā)泡，促使機體康復的一種治療方法[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，烙灸可以介導Fas/FasL信號通路促進腰椎間盤突出后髓核重吸收[4]，且臨床應用可有效改善腰椎間盤突出癥所引起的痛覺過敏，但機制不明確。因此，本研究采用腰椎間盤突出癥慢性疼痛中樞敏化模型，通過觀察烙灸對L4～6脊髓節(jié)段脊髓中小膠質(zhì)細胞和星膠質(zhì)細胞的表達及相關(guān)炎癥因子含量的影響，探討烙灸干預腰椎間盤突出癥慢性疼痛脊髓中樞敏化的機制，以期為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 選擇健康Sprague-Dawley(SD)標準體重雄性大鼠45只，由寧夏醫(yī)科大學動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(寧)2020-0001。每日喂食標準克數(shù)純凈水和飼料。適應性飼養(yǎng)5 d后進行實驗。實驗過程符合寧夏醫(yī)科大學倫理委員會標準(IACUC-NYLAC-2021-004)。

1.2主要試劑及儀器 蘇木素染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，BA-4041)，分化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，C0163M)，伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，BA-4024)，二甲苯(天津市永大化學試劑有限公司)，中性樹膠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9555)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9018)，二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PV-6001)，Iba1一抗(Affinity，DF6443)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)一抗(博奧森，bs-0199R)，白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(聯(lián)科生物/大鼠脊髓，貨號分別為EK301B/3和EK382/3)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS，BX43)，石蠟切片機(德國萊卡RM2135)，成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS，UC90)，電子Von Frey測痛儀(上海玉研科學儀器有限公司)。

1.3實驗方法 將45只大鼠編號并隨機分為空白對照組、模型對照組和烙灸組，每組15只。術(shù)前1 d觀察大鼠一般行為，檢測左側(cè)足底觸覺痛閾值。模型對照組和烙灸組大鼠禁食禁水6 h后，采用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠固定于手術(shù)臺上，腰骶部備皮(5 cm×4 cm)。用碘伏在術(shù)區(qū)消毒3遍并鋪設(shè)消毒巾。根據(jù)體表標志定位法定位大鼠髂前上棘(髂前上棘平對L4椎體)來確定L4～6位置，以其為中心，沿背部中線做2.5 cm左右縱向切口，依次分離大鼠的皮膚、皮下組織及腰背筋膜，順著棘突左側(cè)剝離骶棘肌，暴露左側(cè)L5、L6椎板、橫突及乳狀突，用彎頭止血鉗侵蝕法咬除，顯露神經(jīng)根及背根神經(jīng)節(jié)。接著在大鼠尾根部約1 cm處切斷尾巴，用眼科鑷取2～3個髓核(約10 mg)，小心移植到L5、L6神經(jīng)根處，在髓核表面移植可吸收明膠海綿貼，逐層縫合切口并消毒。斷尾處進行碘酒消毒縫合并用無菌紗布進行包扎，防止傷口感染。術(shù)畢將大鼠平鋪在保溫箱內(nèi)，待大鼠麻醉蘇醒后放回籠中，連續(xù)3 d肌注慶大霉素2 mL防止感染。術(shù)后30 d，評估大鼠一般行為、術(shù)側(cè)足底觸覺痛閾值，達到中樞敏化標準(觸覺痛閾值低于大鼠基礎(chǔ)痛閾值的50%)的大鼠進行后續(xù)實驗，不符合標準的剔除，最終2組各有10只大鼠造模成功。術(shù)后30 d開始，烙灸組大鼠進行烙灸干預：將烙灸器沿腰椎縱軸方向放置，覆蓋L1～6椎體表面，點燃灸槽內(nèi)艾絨，烙致局部皮膚出現(xiàn)潮紅，1次/d，每次10 min，干預60d。模型對照組大鼠在固定器上固定10min，1次/d，不予其他干預；空白對照組大鼠不予造模，不予干預。

1.4取材方法 實驗結(jié)束后，10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，用手術(shù)剪迅速剪開胸腔并暴露心臟及升主動脈。使用無菌靜脈輸液器，注射器針頭從心尖處進針，穿過左心室，插入升主動脈根部后固定針頭，剪開右心耳，以做灌注液流出口。隨后迅速灌入4 ℃生理鹽水，觀察灌注液血色變淡、大鼠的肺臟及肝臟顏色減退且腸系膜血管中的血液消失后改用多聚甲醛(pH 7.4)進行快速固定，大鼠四肢伸展后減慢灌注速度。當大鼠全身僵硬視為灌注成功。最后鉗斷大鼠腰部脊椎骨，小心剝離脊髓，放入包埋盒。

1.5檢測指標及方法

1.5.1大鼠行為學及左側(cè)足底觸覺痛閾值 術(shù)后30 d后，每間隔10 d，在大鼠清醒狀態(tài)下，采用爪觸痛儀測定左側(cè)足底觸覺痛閾值。將大鼠放入30 cm×45 cm×30 cm的測試箱內(nèi)，適應環(huán)境后通過觸痛儀顯示屏，將觸針對準大鼠左側(cè)后足掌面，單擊鼠標，觸針將從篩網(wǎng)下部持續(xù)垂直刺激大鼠足底掌面，當大鼠出現(xiàn)縮足反應時視為陽性，刺激強度以數(shù)值方式顯示在屏幕中，此數(shù)值為大鼠左側(cè)足底觸覺痛閾值，共檢測3次，每次間隔5 min，取平均值。

1.5.2脊髓組織病理形態(tài) 將組織樣本常規(guī)石蠟包埋切片，加入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗；切片依次入85%、95%的梯度乙醇脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min；切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ5min、無水乙醇Ⅲ5min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ 5min透明，中性樹膠封片；光學顯微鏡觀察脊髓組織一般形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5.3脊髓組織中IL-1β、TNF-α含量 酶聯(lián)免疫吸附實驗 (ELISA) 測定大鼠脊髓組織中IL-1β、TNF-α含量：將脊髓組織做勻漿處理，4 ℃保存?zhèn)溆?。在酶標包被板上的樣品孔中依次加入樣品稀釋?0 μL、待測樣品10 μL，將待測樣品稀釋5倍；封板膜封板后置于37 ℃溫育30 min，洗滌，在各反應孔中加新鮮稀釋的酶標抗體50μL繼續(xù)溫育30min，洗滌，加底物液50μL 顯色，避光反應15 min，加入終止液25 μL，在450 nm波長下讀取光密度(OD)值。

1.5.4脊髓中小膠質(zhì)細胞標記物Iba1和星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP表達情況 采用免疫組化法檢測：制作石蠟片、水化脫蠟、PBS清洗脫水、滴加一抗，PBS清洗、滴加二抗，PBS清洗后DAB染色，PBS清洗，蘇木精復染5 min、自來水清洗5 min、脫水、透明、封固、顯微鏡觀察，采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠行為學表現(xiàn) 造模前，大鼠精神飽滿，情緒穩(wěn)定，毛發(fā)有光澤，運動自如，二便、飲食均正常。造模后，由于術(shù)后反應，大鼠精神欠佳，飲食較少，活動較遲緩；術(shù)后30 d后，大鼠出現(xiàn)煩躁、焦慮、易激惹現(xiàn)象，自噬情況嚴重，反復舔足，頻繁擺動短尾，后肢仍無力，中度跛行，已出現(xiàn)中樞敏化表現(xiàn)。烙灸組大鼠干預30 d后，精神狀態(tài)逐漸穩(wěn)定，自噬傷口逐漸愈合，后肢仍無力，中度跛行；干預60 d后，精神狀態(tài)基本恢復正常，自噬傷口已愈合，后肢僅有輕度跛行。

2.2各組大鼠左側(cè)足底觸覺痛閾值 術(shù)前3組大鼠左側(cè)足底觸覺痛閾值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；術(shù)后30～90 d，模型對照組與烙灸組大鼠左側(cè)足底觸覺痛閾值均明顯低于同期空白對照組(P均<0.05)，且造模2組大鼠左側(cè)足底觸覺痛閾值術(shù)后50 d內(nèi)逐漸降低，術(shù)后50 d后逐漸升高，術(shù)后70 d后趨于穩(wěn)定，但烙灸組術(shù)后40～90 d左側(cè)足底觸覺痛閾值均明顯高于同期模型對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白對照組和腰椎間盤突出癥各組大鼠左側(cè)足底觸覺痛閾值比較

2.3各組大鼠脊髓組織病理形態(tài) 空白對照組大鼠脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，灰質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞體形態(tài)飽滿，突起完整；尼氏小體數(shù)量較多；纖維間有膠質(zhì)細胞存在。模型對照組脊髓有明顯損傷，灰質(zhì)區(qū)神經(jīng)元固縮，少量神經(jīng)元壞死、消失；尼氏小體減少甚至消失，神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量較空白組增多，毛細血管增多。烙灸組脊髓損傷較模型組有所減輕；灰質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞體形態(tài)較飽滿，突起較完整；灰質(zhì)區(qū)神經(jīng)元少量固縮，尼氏小體數(shù)量較模型組增加。見圖1。

箭頭1示膠質(zhì)細胞；箭頭2示尼氏小體；箭頭3示固縮神經(jīng)元圖1 空白對照組和腰椎間盤突出癥各組大鼠脊髓組織HE染色病理形態(tài)(×200)

2.4各組大鼠脊髓組織中IL-1β和TNF-α含量模型對照組大鼠脊髓組織中IL-1β與TNF-α含量均明顯高于空白對照組(P均<0.05)，烙灸組均明顯低于模型對照組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 空白對照組和腰椎間盤突出癥各組大鼠脊髓組織中IL-1β與TNF-α含量

2.5各組大鼠脊髓組織中Iba1和GFAP表達情況空白對照組中星膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞未見明顯活化，細胞中也未明顯表達GFAP與Iba1；模型對照組中兩個膠質(zhì)細胞明顯被激活表達，其標記物GFAP與Iba1大量存在于膠質(zhì)細胞中，平均光密度值明顯高于空白對照組(P均<0.05)；烙灸組中兩個膠質(zhì)細胞活化表達相對于模型對照組降低，細胞中GFAP與Iba1的平均光密度值明顯低于模型對照組(P均<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 空白對照組和腰椎間盤突出癥各組大鼠脊髓組織中Iba1和GFAP表達情況(免疫組化)

圖4 空白對照組和腰椎間盤突出癥各組大鼠脊髓組織中Iba1和GFAP表達平均光密度值

3 討 論

腰椎間盤突出癥病變部位涉及督脈。督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風府，入屬與腦，為陽脈之海[5]?！端貑枴す强照摗罚骸岸矫}為病，脊強反折?！盵6]《難經(jīng)·二十九難》：“督之為病，脊強而厥?！崩泳氖菍幭纳贁?shù)民族醫(yī)學的特色療法，烙灸的理論基礎(chǔ)在吸收“體液學說”及“四津?qū)W說”的基礎(chǔ)上融合了傳統(tǒng)中醫(yī)的氣血津液理論，不斷發(fā)展形成獨具特色的“四性四液學說”[7]。“四體液”指黑液、紅液、黃液、白液，均為人身血肉精氣之本；“四性”即冷、熱、干、潤，在正常生理情況下，稱為“四稟性”，“四性”與“四液”協(xié)同，調(diào)控人體正常活動，抵御內(nèi)外界的各種干擾，從而維護正常生理功能[8]。烙灸療法是中醫(yī)化膿灸的發(fā)展與深化，通過烙鐵強大的穿透力，使背部皮膚在感受到熱刺激后鼓動陽氣，使經(jīng)氣上下相通，緩解肌張力過高狀態(tài)，達到補火助陽、通絡益髓之效。因此烙灸督脈不僅可以治療腰椎間盤突出癥所帶來的疼痛癥狀，還可以激發(fā)人體陽氣。岳倩文[7]研究證實烙灸可以促進脊髓損傷大鼠肢體運動及感覺功能恢復，可激活體內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖，減少星形膠質(zhì)細胞過度分化，誘導其向神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細胞分化。

中樞敏化是指脊髓背角對周圍神經(jīng)刺激反應性增強而導致的痛覺過敏[9]，這種增強會使痛閾降低，疼痛反應放大，疼痛敏感性擴散到非損傷區(qū)域。外周傷害性信息在向大腦高級中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導的過程中痛覺信息可能會被阻抑，也可以保持不變或者放大，即痛覺過敏，而調(diào)節(jié)和整合這種信息的第一級中樞就是脊髓背角[10]。近些年研究表明，脊髓背角中膠質(zhì)細胞的激活與痛覺過敏的產(chǎn)生和疼痛的維持關(guān)系密切[11]。目前認為，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與疼痛密切相關(guān)的兩大膠質(zhì)細胞。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細胞，對外周傷害性刺激十分敏感，是神經(jīng)系統(tǒng)中反應最快的細胞，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到外周傷害性刺激后小膠質(zhì)細胞迅速激活，活化的小膠質(zhì)細胞會合成和釋放多種細胞因子及趨化因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些釋放的細胞因子將活化痛覺傳導的神經(jīng)元，導致中樞敏化[11]。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細胞類型，在疼痛敏化中扮演重要的角色，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到持續(xù)傷害性刺激時星形膠質(zhì)細胞被活化，而后釋放大量的炎癥介質(zhì)以及促炎細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6等，這些炎癥介質(zhì)能夠進一步激活膠質(zhì)細胞本身和神經(jīng)元，增加了神經(jīng)元的興奮性，促進了中樞敏化[12]。本實驗結(jié)果顯示，模型對照組脊髓組織中Iba1與GFAP表達增高，結(jié)合大鼠行為學，說明模型復制成功；與模型對照組相比，烙灸組大鼠脊髓組織中Iba1與GFAP表達減少，說明烙灸療法可以改善腰椎間盤突出癥引起的慢性疼痛中樞敏化現(xiàn)象。

炎癥因子已經(jīng)被證實可直接結(jié)合神經(jīng)元上相應受體，提高神經(jīng)元興奮性介導疼痛[13]。Kawasaki等[14]利用膜片鉗技術(shù)記錄了脊髓切片內(nèi)Ⅱ?qū)由窠?jīng)元電位，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β和 IL-6可快速調(diào)節(jié)α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體 (AMPAR)、N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)和γ-氨基丁酸受體 (GABAR) 等神經(jīng)遞質(zhì)受體的功能，導致脊髓疼痛回路興奮性突觸傳遞增強和抑制性突觸傳遞抑制，從而直接誘導中樞敏化,而這一發(fā)現(xiàn)與體外實驗研究結(jié)果是一致的，提示TNF-α、IL-1β和IL-6可直接促進中樞敏化介導疼痛。本實驗結(jié)果顯示，模型對照組大鼠脊髓組織中TNF-α和IL-1β含量明顯高于空白對照組，烙灸組明顯低于模型對照組。這提示炎癥因子確實參與腰椎間盤突出癥慢性疼痛中樞敏化的發(fā)生，同時烙灸療法可以減少炎癥因子的表達，抑制中樞敏化的發(fā)生。

綜上所述，烙灸可以明顯緩解腰椎間盤突出癥疼痛，其機制可能與抑制脊髓膠質(zhì)細胞的活化，減少炎癥因子分泌，減輕中樞敏化有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。