王 慧，賀 彬，黃文杰，劉理靜，柯 燦，向 粵

(1. 湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南 懷化 418000；2. 長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

肺纖維化是一種慢性彌漫性肺間質(zhì)疾病，是多種慢性肺部疾病的最終結(jié)局，特發(fā)性肺纖維化是其中最常見、最嚴(yán)重的一種，確診后的生存中位數(shù)僅為2.9年，5年生存率<50%[1]。除肺移植外，該病尚缺乏有效的治療措施，然而供體來源匱乏，臨床上主要采用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑或細(xì)胞毒藥物進(jìn)行治療，但療效均不佳。目前，獲得批準(zhǔn)上市的抗肺纖維化藥物只有吡非尼酮和尼達(dá)尼布，但長(zhǎng)期服用的有效性和安全性尚不明確[2]。肺纖維化的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，其主要病理特征為肺成纖維細(xì)胞過度增殖轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積[3]。生理情況下，肺成纖維細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，修復(fù)損傷和保護(hù)肺泡正常生理活性[4]。當(dāng)肺組織受損時(shí)，肺成纖維細(xì)胞增殖并分化為肌成纖維細(xì)胞，其分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力是肺成纖維細(xì)胞的4～5倍，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，加速肺纖維化的進(jìn)展[5]，干預(yù)肺成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為可以有效防治肺纖維化[6]。因此，抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是抑制肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要途徑。天然水蛭素是從吸血水蛭的唾液腺中分離出來的多肽，是迄今為止自然界最為強(qiáng)大的天然凝血酶抑制劑[7]，具有抗凝、抗炎、抗腫瘤、抗風(fēng)濕、促進(jìn)皮瓣存活等生物學(xué)作用[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)水蛭素能抑制博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[11]，但其機(jī)制仍未闡明。基于此，本研究采用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的小鼠胚肺成纖維細(xì)胞(NIH3T3)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化作為體外研究模型，通過檢測(cè)水蛭素干預(yù)后肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的相關(guān)標(biāo)志物，探究了水蛭素抗肺纖維化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料 NIH3T3細(xì)胞由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。水蛭素購自廣西科康科技集團(tuán)有限公司(批號(hào)：20190901)、TGF-β1購自美國Peprotech公司、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自Biosharp公司；Trizol試劑購自艾科瑞生物，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛公司，qRT-PCR所需引物由上海生工生物工程公司合成，SYBR Green Real Time PCR Master Mix購自Promega公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體購自Abcam，Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Syngene Gnome XQR印跡掃描儀(英國Syngene 公司)，PCR儀(美國Thermo 公司)，熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad 公司)，Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀(美國Thermo公司)。

1.2水蛭素溶液的配置 在無菌操作臺(tái)內(nèi)，取水蛭素凍干粉1瓶，用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基溶解配成濃度為50 ATU/mL的母液，用0.22 μm的微孔過濾器過濾，使用時(shí)再用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成所需要的濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3水蛭素濃度篩選 復(fù)蘇NIH3T3，培養(yǎng)在含10% NBS和1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH3T3細(xì)胞，將細(xì)胞按3 000個(gè)/孔接種到96孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右，用PBS洗2遍，將培養(yǎng)基血清含量降至2%饑餓12 h后，分別加入濃度為0.3 ATU/mL、0.6 ATU/mL、1.2 ATU/mL、2.4 ATU/mL、4.8 ATU/mL、9.6 ATU/mL水蛭素進(jìn)行干預(yù)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱孵育。孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗1遍，移液槍吸凈PBS后每孔加入200 μL CCK-8工作液(CCK-8原液∶培養(yǎng)基=1∶9)，同時(shí)設(shè)置空白孔(只加 CCK-8，無細(xì)胞)。放入培養(yǎng)箱孵育1 h，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光值，計(jì)算各濃度下的抑制率。

1.4細(xì)胞分組及培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH3T3細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右分為6組處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，水蛭素組細(xì)胞加入4.8 ATU/mL水蛭素培養(yǎng)，TGF-β1組細(xì)胞加入10 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)，TGF-β1+水蛭素1.2 ATU/mL組、TGF-β1+水蛭素2.4 ATU/mL組、TGF-β1+水蛭素4.8 ATU/mL組分別加入相應(yīng)濃度水蛭素后30 min再加入10 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞活力檢測(cè) 按照1.3中方法檢測(cè)空白對(duì)照組、水蛭素組、TGF-β1組、TGF-β1+水蛭素1.2 ATU/mL組、TGF-β1+水蛭素2.4 ATU/mL組、TGF-β1+水蛭素4.8 ATU/mL組細(xì)胞活力。

1.6細(xì)胞中α-SMA、Collagen I mRNA表達(dá)檢測(cè)采用qRT-PCR法檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分組同1.4，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIH3T3細(xì)胞按6×104個(gè)/孔接種到6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右，將血清濃度從10%降至2%，饑餓12 h。饑餓處理后換成新的2%血清濃度的培養(yǎng)基，每組按照1.4中方法給予相應(yīng)處理后，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄掉上清，用冰PBS洗滌2遍。吸凈PBS后每孔加入1 mL Trizol，室溫放置10 min，反復(fù)吹打培養(yǎng)板，盡量少殘留細(xì)胞于壁上，將孔板中的Trizol轉(zhuǎn)移至新的無酶EP管中，加入等量的異丙醇沉淀，乙醇洗除雜質(zhì)，加入30 μL DEPC水輕柔混勻，用紫外分光光度計(jì)對(duì)每個(gè)樣本總RNA的濃度、純度進(jìn)行測(cè)定，取RNA 2 μL，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的步驟合成cDNA。取10 μL cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。α-SMA引物序列：上游為5’-TGGCTATTCAGGCTGTGCTGTC-3’，下游為5’-CAATCTCACGC TCGGCAGTAGT-3’；Collagen I 引物序列：上游為5’-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3’，下游為5’-GCTTCTTTTCCTTGGGGTTC-3’；β-actin引物序列：上游為5’-GGCTGTATTCCCCTCCAT-3’，下游為5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.7細(xì)胞中α-SMA、Collagen I蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)方法與分組同mRNA表達(dá)檢測(cè),培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞用冰PBS洗2遍，吸凈PBS,每孔加入100 μL含1%蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，裂解完畢用細(xì)胞刮將壁上的細(xì)胞刮下轉(zhuǎn)移至新的EP管中。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入等體積5%巰基乙醇的2×loading buffer，放入100 ℃金屬蛋白浴中15 min使蛋白變性。制備10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，取30 μg蛋白上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后分別加入稀釋的山羊抗兔Collagen Ⅰ、α-SMA (1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入稀釋后的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h；用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色和曝光，使用Image J軟件分析得出目的蛋白灰度值(A)，目的蛋白表達(dá)水平=A目的蛋白/內(nèi)參GAPDH。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度水蛭素對(duì)NIH3T3細(xì)胞活力的影響0.3 ATU/mL、0.6 ATU/mL、1.2 ATU/ml、2.4 ATU/mL、4.8 ATU/mL水蛭素對(duì)NIH3T3細(xì)胞活力無影響，9.6 ATU/mL水蛭素顯著降低了細(xì)胞活力(見圖1)，因此選擇濃度為1.2 ATU/mL、2.4 ATU/mL、4.8 ATU/mL水蛭素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度水蛭素對(duì)NIH3T3細(xì)胞活力的影響

2.2各組NIH3T3細(xì)胞活力比較 空白對(duì)照組與水蛭素組NIH3T3細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TGF-β1組NIH3T3細(xì)胞活力明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；TGF-β1+水蛭素2.4 ATU/mL組、TGF-β1+水蛭素4.8 ATU/mL組NIH3T3細(xì)胞活力均明顯低于TGF-β1組(P均<0.05)。見圖2。

A為空白對(duì)照組；B為水蛭素組；C為TGF-β1組；D為TGF-β1+水蛭素1.2 ATU/mL組；E為TGF-β1+水蛭素2.4 ATU/mL組；F為TGF-β1+水蛭素4.8 ATU/ mL組

2.3各組 NIH3T3 細(xì)胞中Collagen I、α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)情況 空白對(duì)照組與水蛭素組Collagen I、α-SMA mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；TGF-β1組Collagen I、α-SMA mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)；TGF-β1+水蛭素2.4 ATU/mL組、TGF-β1+水蛭素4.8 ATU/mL組Collagen I、α-SMA mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于TGF-β1組(P均<0.05)。見圖3及圖4。

A為空白對(duì)照組；B為水蛭素組；C為TGF-β1組；D為TGF-β1+水蛭素1.2 ATU/mL組；E為TGF-β1+水蛭素2.4 ATU/mL組；F為TGF-β1+水蛭素4.8 ATU/mL組圖3 各組 NIH3T3 細(xì)胞中Collagen I、α-SMA mRNA 表達(dá)情況

A為空白對(duì)照組；B為水蛭素組；C為TGF-β1組；D為TGF-β1+水蛭素1.2 ATU/mL組；E為TGF-β1+水蛭素2.4 ATU/mL組；F為TGF-β1+水蛭素4.8 ATU/mL組圖4 各組 NIH3T3 細(xì)胞中Collagen I、α-SMA蛋白表達(dá)情況

3 討 論

肺纖維化早期表現(xiàn)為彌漫性肺炎,后期表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[12]，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難并伴刺激性干咳,且隨著病情進(jìn)展,患者呼吸功能不斷惡化,最終導(dǎo)致呼吸衰竭甚至死亡[13]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床上缺乏有效的治療藥物，因此迫切需要研發(fā)新藥來預(yù)防肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。水蛭最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有破血化瘀、通絡(luò)的功效[7]，其制劑如腦血通膠囊、疏血通注射液常用于心腦血管疾病如腦梗死、冠心病的預(yù)防及輔助治療[14]，隨著中醫(yī)藥研發(fā)技術(shù)的不斷提升，水蛭的藥用價(jià)值日益凸顯。

特發(fā)性肺纖維化患者和博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物體外研究模型有一個(gè)共同點(diǎn)，即肺組織中促纖維化因子表達(dá)升高，在這些因子中，TGF-β1處于最關(guān)鍵的地位，其能有效誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向基質(zhì)遷移，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分，形成肉芽組織，同時(shí)獲得肌成纖維細(xì)胞表型,α-SMA表達(dá)升高，并通過 Smad 經(jīng)典通絡(luò)或非Smad經(jīng)典通路等信號(hào)通路調(diào)控膠原基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)膠原蛋白的合成與分泌，造成過量的瘢痕組織聚集，導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[15]。因此，本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化作為體外研究的模型，濃度與誘導(dǎo)時(shí)間參照文獻(xiàn)[16]，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選1.2 ATU/mL、2.4 ATU/mL、4.8 ATU/mL水蛭素用于后續(xù)研究，結(jié)果顯示水蛭素可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞增殖，尤其中、高濃度抑制作用更顯著，表明水蛭素可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖。

正常情況下，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分解處于動(dòng)態(tài)平衡，有助于維持肺組織的正常結(jié)構(gòu)與功能[17]。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，二者由肺成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)分化后的肌成纖維細(xì)胞合成，當(dāng)肺組織受損時(shí)，肺成纖維細(xì)胞增殖并分化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生過多的細(xì)胞外基質(zhì)，并在肺間質(zhì)內(nèi)過度蓄積，造成肺實(shí)質(zhì)廣泛損傷和重塑，觸發(fā)肺纖維化[18]。α-SMA是肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，它分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力比肺成纖維細(xì)胞高4～5倍。因此，細(xì)胞中Collagen I、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)量能準(zhǔn)確反映細(xì)胞外基質(zhì)合成與分解代謝情況，評(píng)價(jià)肺纖維化的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，2.4 ATU/mL、4.8 ATU/mL水蛭素可以明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞中Collagen I、α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)量。提示水蛭素可通過減少細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程。既往研究發(fā)現(xiàn)抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化能有效減輕肺纖維化[19-20]，本研究與上述研究結(jié)果一致，證實(shí)水蛭素能夠直接作用于肺成纖維細(xì)胞，抑制其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

綜上所述，水蛭素可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的 NIH3T3細(xì)胞增殖及TGF-β1誘導(dǎo)的Collagen I、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)增加，說明抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是水蛭素抗肺纖維化的機(jī)制之一。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在湖南醫(yī)藥學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)研究中心和中南大學(xué)湘雅護(hù)理學(xué)院慢性病基礎(chǔ)研究與健康管理實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位同事和老師的指導(dǎo)與幫助！)

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。