左然芹，朱慧志，劉向國，任馮春，徐晴雯

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是因慢性炎癥、氣道重塑等因素而導(dǎo)致的以氣流受限為特征的疾病[1]。在COPD的早期就存在炎癥細(xì)胞浸潤、上皮損傷、小氣道狹窄與管周纖維化導(dǎo)致的氣道重塑，控制炎癥、減緩氣道重塑以預(yù)防COPD進(jìn)行性加重，改善患者預(yù)后一直是研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)[1-2]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和血小板衍生生長因子(PDGF)是高效的促纖維化因子，肺成纖維細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞是其主要的效應(yīng)細(xì)胞，二者可通過促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積、纖黏蛋白及膠原合成增多等途徑介導(dǎo)氣道重塑過程[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過參與細(xì)胞外基質(zhì)沉積、氣道平滑肌細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)COPD氣道重塑[5-6]。本研究通過觀察補(bǔ)腎活血化痰方(陽和平喘顆粒)對(duì)COPD模型大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路及氣道重塑的影響，以期為該方治療COPD提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，體重(180±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2019-0002，在可自由飲水?dāng)z食清潔的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(AHUCM-rats-2021131)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 陽和平喘顆粒(由麻黃6 g、葶藶子10 g、白芥子10 g、桔梗10 g、旋覆花9 g、熟地15 g、巴戟天10 g、五味子6 g、當(dāng)歸10 g組成，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供配方顆粒，10 g/包，每克含生藥量2.7 g，生產(chǎn)批號(hào)：20190718)，桂龍咳喘寧膠囊(桂龍藥業(yè)，生產(chǎn)批號(hào)：20170820)，均用生理鹽水配置成相應(yīng)濃度的混懸液。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 動(dòng)物煙熏箱(自備)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Biorad公司)；離心機(jī)(ePPendorf公司)；通用電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀(北京君意公司)；PDGF、TGF-β1ELISA檢測試劑盒(科順生物公司)；兔抗β-actin、Axin抗體(ABclonal公司)，β-catenin、Cyclin D1 抗體(Proteintech公司)。

1.4分組、建模及干預(yù) 將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽和平喘顆粒低劑量組、陽和平喘顆粒中劑量組、陽和平喘顆粒高劑量組及桂龍咳喘寧組，每組8只。除正常組外，其他組大鼠按文獻(xiàn)[7]方法制備COPD模型：在第1，14，21天氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)1 mg/kg，注入當(dāng)日不煙熏；注入第2天將大鼠置于煙熏箱中，點(diǎn)燃20支大前門牌香煙，每次持續(xù)30 min，2次/d，連續(xù)12周。當(dāng)大鼠出現(xiàn)肺實(shí)質(zhì)破壞、管壁周圍明顯炎性細(xì)胞浸潤、氣道壁及氣道平滑肌增厚表示COPD模型建立成功。平喘顆粒低、中、高劑量組分別給予陽和平喘顆粒1.75 g/(kg·d)、3.5 g/(kg·d)、7 g/(kg·d)灌胃，桂龍咳喘寧組給予桂龍咳喘寧3.5 mL/100 g灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)12周。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1肺組織病理形態(tài)學(xué) 末次灌胃結(jié)束后，取大鼠右下肺組織，石蠟包埋切片，分別進(jìn)行HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.5.2血清PDGF、TGF-β1水平 取腹主動(dòng)脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min，取血清，ELISA法檢測血清中PDGF、TGF-β1水平，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書。

1.5.3肺組織中β-catenin、CyclinD1、Axin蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測：將肺組織剪成小碎片，獲取蛋白后每個(gè)加樣孔加入10 μL相應(yīng)蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜，分別加 1∶100稀釋的β-catenin抗體、CyclinD1抗體、Axin抗體，β-actin抗體4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，用Pierce-ECL試劑盒發(fā)光顯影。β-catenin、CyclinD1、Axin與內(nèi)參蛋白β-actin比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4肺組織中wnt3a 、wnt5a、β-catenin、Axin、CyclinD1 mRNA表達(dá)情況 采用 RT-PCR法檢測：取適量大鼠肺組織，稱重并研磨成粉末，抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測相應(yīng)基因變化。wnt3a 上游引物為5’-TGCGACCTGTTGTGCTG-3’，下游引物為5’-AATGAACCCTGCTCCCTCT-3’；wnt5a上游引物為5’-TTCTTACCCAAACCGGACT-3’，下游引物為5’-CGCCATCTGCTTGACTTAC-3’；β-catenin上游引物為5’-TATGAGTGGGAGCAAGGC-3’，下游引物為5’-CTGCGTGGATGGGATCT-3’；Axin上游引物為5’-CTCTGGCTCTGGGAAAGTGG-3’，下游引物為5’-AAGCCCAGGGCAAAGTATCC-3’；CyclinD1 上游引物為5’-GCGTACCCTGACACCAAT-3’，下游引物5’-CTTCGCACTTCTGCTCCT-3’；內(nèi)參β-actin上游引物為5’-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3’，下游引物5’-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3’。反應(yīng)條件: 預(yù)變性95 ℃ 3 min,95 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。用2-△△CT方法計(jì)算wnt3a 、wnt5a、β-catenin、Axin和CyclinD1 mRNA表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài) HE及Masson染色顯示，正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管腔光滑無明顯增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺泡壁斷裂，肺泡間隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤明顯，氣道壁、氣道平滑肌厚度及氣道上皮下膠原纖維沉積顯著增加；桂龍咳喘寧組及陽和平喘顆粒各組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞較模型組輕，氣道壁、氣道平滑肌厚度及氣道上皮下膠原纖維沉積情況有所緩解，其中陽和平喘顆粒高劑量組改善更明顯。見圖1及圖2。

圖1 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織Masson染色表現(xiàn)(×400)

2.2各組大鼠血清PDGF、TGF-β1水平比較 模型組血清PDGF、TGF-β1水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；陽和平喘顆粒中、高劑量組和桂龍咳喘寧組血清PDGF、TGF-β1水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；陽和平喘顆粒高劑量組和桂龍咳喘寧組血清PDGF、TGF-β1水平均明顯低于陽和平喘顆粒低劑量組(P均<0.05)，陽和平喘顆粒高劑量組和桂龍咳喘寧組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠血清PDGF、TGF-β1水平比較

2.3各組大鼠肺組織中β-catenin、CyclinD1和Axin蛋白表達(dá)情況 與正常組比較，模型組β-catenin、CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)，Axin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，陽和平喘顆粒低、中劑量組及桂龍咳喘寧組β-catenin、CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低不明顯(P均>0.05)，陽和平喘顆粒高劑量組β-catenin、CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；陽和平喘顆粒中、高劑量組和桂龍咳喘寧組Axin蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)。陽和平喘顆粒各組β-catenin、CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量與桂龍咳喘寧組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，陽和平喘顆粒高劑量組Axin蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于桂龍咳喘寧組(P<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織中β-catenin、CyclinD1和Axin蛋白表達(dá)情況

圖4 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織中β-catenin、CyclinD1和Axin蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.4各組大鼠肺組織中wnt3a 、wnt5a、β-catenin 、Axin和CyclinD1mRNA表達(dá)情況 與正常組比較，模型組wnt3a、wnt5a、β-catenin、CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)，Axin mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，陽和平喘顆粒低、中劑量組CyclinD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，wnt3a、wnt5a、β-catenin、Axinm RNA相對(duì)表達(dá)量變化不明顯(P均>0.05)；陽和平喘顆粒高劑量組wnt3a、wnt5a、β-catenin、CyclinD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，Axin mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；桂龍咳喘寧組wnt3a、β-catenin、CyclinD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，wnt5a、Axin mRNA相對(duì)表達(dá)量變化不明顯(P均>0.05)；陽和平喘顆粒各組各指標(biāo)與桂龍咳喘寧組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，陽和平喘顆粒高劑量組wnt3a、wnt5a、CyclinD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于陽和平喘顆粒低劑量組(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織中wnt3a、wnt5a、β-catenin、Axin和CyclinD1 mRNA表達(dá)情況

3 討 論

氣道重塑、肺實(shí)質(zhì)破壞是導(dǎo)致COPD氣流受限的重要原因[1]。目前認(rèn)為氣道重塑是由慢性炎癥反復(fù)刺激引起氣道損傷和組織修復(fù)所致，主要病理特征為氣道壁增厚、氣道平滑肌細(xì)胞增生、氣道上皮下膠原沉積、氣道上皮細(xì)胞增生、鱗狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞化生等[8-9]。

TGF-β1、PDGF、Wnt/β-catenin信號(hào)通路均參與了COPD氣道重塑過程。TGF-β1是一種主要作用于肺成纖維細(xì)胞的促纖維化因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，使纖黏蛋白、膠原合成增多，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積則使氣道壁增厚，以上作用共同導(dǎo)致了氣道重塑[10-11]。PDGF能夠促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖，增加Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達(dá)[4，12]。wnt3a 、wnt5a是Wnt信號(hào)通路中調(diào)節(jié)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵配體[13-14]。β-catenin是判定Wnt通路是否激活的重要標(biāo)記物，在細(xì)胞沒有Wnt信號(hào)刺激時(shí)，β-catenin與支架蛋白Axin、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶GSK3β形成毀滅復(fù)合體，磷酸化后被降解；當(dāng)細(xì)胞有信號(hào)刺激時(shí)，Wnt配體與細(xì)胞膜上受體結(jié)合產(chǎn)生一系列反應(yīng)后，抑制β-catenin、Axin等蛋白形成的毀滅復(fù)合體活性，使Axin降解，穩(wěn)定的β-catenin入核后激活下游靶基因CyclinD1等轉(zhuǎn)錄[15]。研究表明，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可明顯減少TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積[5]，而激活此通路可促進(jìn)PDGF誘導(dǎo)的氣道上皮分化及氣道平滑肌增厚[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠氣道壁、氣道平滑肌厚度及氣道上皮下膠原沉積增加，血清TGF-β1、PDGF水平及肺組織中wnt3a、wnt5a、β-catenin、CyclinD1表達(dá)量明顯升高，Axin表達(dá)量明顯降低，說明Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活可促進(jìn)TGF-β1、PDGF表達(dá)，加劇COPD氣道重塑。

中醫(yī)認(rèn)為COPD病程長且遷延難愈，乃久病“肺脾腎俱虛”引起肺的宣降、脾的運(yùn)化、腎的氣化功能失調(diào)，可致氣血津液代謝失常，痰濁瘀血阻滯肺絡(luò)。臟腑功能失調(diào)是氣道重塑、氣流受限的基礎(chǔ)，故其治法當(dāng)以調(diào)補(bǔ)肺腎、活血化痰為主[16-17]。陽和平喘顆粒具有補(bǔ)腎活血化痰作用，方中麻黃、白芥子、葶藶子、旋覆花、桔梗共同發(fā)揮宣肺平喘、祛痰化飲之效，加熟地黃、巴戟天、五味子增補(bǔ)腎溫陽之功，可溫煦臟腑、溫化痰濁，佐以當(dāng)歸增活血化瘀功效。研究證實(shí)，具有補(bǔ)腎或活血化痰功效的中藥能夠減輕氣道炎癥，降低血清TGF-β1水平，通過MAPKs途徑改善COPD氣道重塑[18-19]。本課題組前期研究表明，陽和平喘顆粒能夠減輕COPD患者臨床癥狀，降低血清IL-6、IL-8、TNF-α水平[20-21]，并可提高COPD大鼠肺通氣功能[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陽和平喘顆粒各組肺泡結(jié)構(gòu)破壞減輕，氣道壁、氣道平滑肌厚度及氣道上皮下膠原纖維沉積情況改善，陽和平喘顆粒高劑量組血清PDGF、TGF-β1水平及肺組織中β-catenin、CyclinD1、wnt3a、wnt5a表達(dá)量明顯降低，Axin表達(dá)量明顯升高。提示陽和平喘顆?？梢种芖nt/β-catenin信號(hào)通路，從而降低血清PDGF、TGF-β1水平，進(jìn)而改善COPD大鼠氣道重塑。

綜上所述，陽和平喘顆粒調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減少PDGF、TGF-β1表達(dá)可能是其改善COPD氣道重塑的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度證實(shí)補(bǔ)腎活血化痰方可改善COPD氣道重塑，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。