岑明珠，張輝華

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528200）

葡萄球菌在自然界中分布廣泛，在健康禽類的皮膚、眼瞼、黏膜、胃腸道都有葡萄球菌的存在，同時也存在于禽類養(yǎng)殖場、孵化場、飼料加工廠等。葡萄球菌多數(shù)為非致病菌，少數(shù)致病性葡萄球菌可以穿過皮膚或黏膜引起發(fā)病。葡萄球菌是一種共生細(xì)菌，具有致病性，是非常廣泛的化膿性細(xì)菌之一，葡萄球菌有可能引起75%～85%的化膿性疾病，會引起禽類的組織器官受感染以及化膿，嚴(yán)重時可引起膿毒敗血癥。另外，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中由于抗生素的頻繁使用，金黃色葡萄球菌的耐藥感染一直備受關(guān)注[1]，大量抗生素應(yīng)用于集約化養(yǎng)殖場，導(dǎo)致耐藥菌株逐漸出現(xiàn)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，有效的敏感藥物日漸減少，使得該病一旦發(fā)病難以控制，給養(yǎng)殖業(yè)帶來一定損失，因此選擇合適敏感的藥物顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病死雞只來源于福建省地區(qū)養(yǎng)殖場的病雞，病料具體背景信息如表1所示。

表1 病料的背景信息

1.2 試驗(yàn)試劑

LB瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、LB肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、MH瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；藥敏試紙（廣州市迪景微生物有限公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

50 × TAE緩沖液制備：稱取Tris 121 g、Na2EDTA·2H2O（372 g/mol）9.3 g、冰醋酸28.55 mL、NaOH 1.55 g，加入蒸餾水定容至500 mL，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1×TAE緩沖液制備：10 mL50×TAE緩沖液，加去離子水至500 mL。

1%瓊脂糖凝膠制備：稱取1 g瓊脂糖，加入含有100 mL 1 × TAE緩沖液，于微波爐中加熱融化至液體澄清透亮并冷卻至40～ 60 ℃后加入5 μL核酸染料，混勻后倒入放有凝膠板的凝膠盤中（膠板厚度約5 mm，根據(jù)樣品數(shù)量選擇對應(yīng)梳子），膠冷卻凝固后拔出梳子，將電泳凝膠水平放入電泳槽中，加入1×TAE緩沖液淹沒凝膠液面。

1.3 主要儀器

高速離心機(jī)（美國Thermo公司）、PCR儀（美國Thermo公司）、生物安全柜（美國Thermo公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（北京榮陽經(jīng)典科技有限公司）、高壓滅菌鍋（日本Tomy公司）、凝膠電泳裝置（北京榮陽經(jīng)典科技有限公司）。

1.4 金黃色葡萄球菌的分離純化

1.4.1 病料的采集

先將病死雞剖解，觀察以及記錄病變部位和情況，用一次性無菌接種環(huán)采集雞的關(guān)節(jié)、骨髓、肝臟等部位。

1.4.2 細(xì)菌的分離

將采集到的關(guān)節(jié)滲出液、骨髓、肝臟等用LB普通瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行三分區(qū)劃板，然后放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.4.3 細(xì)菌的增殖及收獲

細(xì)菌放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，每種細(xì)菌挑平板上的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，將分離菌進(jìn)行單菌落劃線，用普通LB肉湯放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中存放，培養(yǎng)12 h純化后進(jìn)行鑒定。最后培養(yǎng)過的分離菌暫時存放在-4 ℃冰箱中。

1.4.4 染色鏡檢

將疑似的菌株進(jìn)行染色鏡檢：取潔凈的載玻片于火焰上反復(fù)拖拉幾次，用移液槍取10 μL蒸餾水，用接種環(huán)挑取菌落邊緣少許細(xì)菌，與玻板上的蒸餾水混勻涂抹開，懸于火焰上方，火焰固定；滴加結(jié)晶紫染色液計時1 min后水洗；滴加碘液計時1 min后水洗；滴加脫色酒精，計時約30 s后水洗；滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染1 min后水洗晾干，轉(zhuǎn)到光學(xué)顯微鏡下，選擇合適放大倍數(shù)觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.5 細(xì)菌的PCR鑒定

1.5.1 引物的設(shè)計與合成

上游引物27F序列：AGTTTGATCMTGGCTCAG，下游引物1492R序列：GGTTACCTTGTTACGACTT，引物由廣州擎科生物科技有限公司合成。

1.5.2 細(xì)菌的DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書對細(xì)菌基因組進(jìn)行抽提，將抽提所得產(chǎn)物收集于2 mL離心管中，短期存于4 ℃，長期存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

按照擎科生物科技有限公司的試劑盒說明書進(jìn)行，在生物安全柜中配置25 μL的PCR體系，具體包括：上游引物PF（10P）1 μL，下游引物PR（10P）1 μL，模板gDNA 1 μL，蒸餾水H2O 22 μL。將混勻的上述液體放入PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該體系的反應(yīng)如下：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸15 s。以上進(jìn)行35個循環(huán)，然后72 ℃后延伸5 min。

1.5.3 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣：取20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入各加樣孔中，并加入對應(yīng)的陰性對照與陽性對照，同時設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)分子量Maker做分子質(zhì)量大小對照。

結(jié)果觀察和判斷：電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，把凝膠從電泳液中取出來，放入凝膠成像系統(tǒng)中，UV紫外燈下觀察核酸條帶并讀取結(jié)果。

1.5.4 藥敏試驗(yàn)

參照常規(guī)K -B藥敏試紙擴(kuò)散法對分離的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對照菌株為金黃色葡萄球菌26003。取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)肉湯，調(diào)整菌液濃度為1.0 × 106cfu/mL，蘸取菌液在MH平板上均勻涂抹，每次涂抹將平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平板周邊繞轉(zhuǎn)2圈，保證涂抹均勻；待平板水分被完全吸收后，夾取一張藥敏試紙，放于平板表面，輕輕按壓使其貼平，重復(fù)2個平行，置于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

經(jīng)剖檢可見，雞只腳關(guān)節(jié)發(fā)炎腫脹充血，爪掌出現(xiàn)潰爛呈烏黑色痂，趾關(guān)節(jié)腫脹（如圖1）。

圖1 病變情況

2.2 分離菌的形態(tài)結(jié)果

分離所得菌株通過平板劃線細(xì)菌分離、單菌落純化后，得到的分離菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基上為灰白色菌落，表面光滑、濕潤、圓形有隆起，革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，無芽孢，葡萄狀菌落形態(tài)，初步鑒定為葡萄球菌。

2.3 分離菌PCR結(jié)果

對待檢分離菌以所提菌株DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，通過與DNA Marker條帶對比（圖2），特異性DNA條帶約為1 500 bp，與預(yù)期目的基因大小相符，將純化的PCR產(chǎn)物外送測序，將序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對，確認(rèn)分離株屬于葡萄球菌屬。

圖2 PCR鑒定

2.3 藥物敏感性結(jié)果

17種藥物試驗(yàn)的敏感度結(jié)果如表2所示，分離得到的金黃色葡萄球菌株對萘啶酸、磺胺復(fù)合物、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星表現(xiàn)耐藥（R），對四環(huán)素、青霉素、氨芐西林表現(xiàn)中敏（I），對阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟均表現(xiàn)敏感（S）。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果與討論

金黃色葡萄球菌對抗生素的耐藥性不斷提高，耐藥菌株日益增多，已被公認(rèn)為家禽和人類健康面臨感染的最大威脅之一，也是一個重大的公共衛(wèi)生問題。若發(fā)現(xiàn)該耐藥菌株引起的感染，應(yīng)及時采取有力措施加以控制并加強(qiáng)耐藥性監(jiān)測[2]。本研究采用了分子生物學(xué)鑒定方法，相較于傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法簡單快速，通過基因序列同源性比較，能更準(zhǔn)確的將不同的細(xì)菌區(qū)分開來。此次在雞病料中分離所得的1株致病性菌株通過革蘭氏染色鏡檢鑒定，結(jié)果顯示為革蘭氏陽性菌，呈藍(lán)紫色球狀菌，符合金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色特征。經(jīng)細(xì)菌基因組DNA提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)得到清晰可見單一透亮的條帶，片段在1 500 bp左右，再通過測序所得序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對，確認(rèn)分離株屬于葡萄球菌屬，為致病性金黃色葡萄球菌。

在本次藥敏試驗(yàn)中，結(jié)果顯示該菌株對萘啶酸、磺胺復(fù)合物、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星表現(xiàn)耐藥（R），對四環(huán)素、青霉素、氨芐西林表現(xiàn)中敏（I），對阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟均表現(xiàn)敏感（S）。所以福建地區(qū)該養(yǎng)殖場在發(fā)病之后為達(dá)到控制效果，應(yīng)選用敏感性較高的阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟，避免使用萘啶酸、磺胺復(fù)合物、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等耐藥性藥物，以免造成抗生素泛濫使用以及增加養(yǎng)殖成本。養(yǎng)殖場在使用抗生素的過程中，注意交替用藥，不要一直使用單一抗生素，以免日后造成菌株新的耐藥性。

雞葡萄球菌的生物膜形成會在人體內(nèi)引起感染，在家禽上雖然不是常見病和多發(fā)病，但一旦發(fā)病就特別嚴(yán)重[3]，它可引起畜禽各種化膿性疾病，如雞的華農(nóng)性關(guān)節(jié)炎，?？苿游锏募毙曰蚵匀橄傺?，豬的流產(chǎn)和皮炎，馬屬動物的創(chuàng)傷感染、膿腫、蜂窩織炎等，對畜牧業(yè)危害巨大[4]。因它是體表的常在菌，在正常情況下，不會感染機(jī)體，但是當(dāng)出現(xiàn)傷口時，比如注射疫苗、網(wǎng)刺、斷喙、扭傷和刮傷等都可以成為本病發(fā)生的誘因，另外，當(dāng)由于長途運(yùn)輸、室溫或氣溫變冷、改變飼養(yǎng)方式、通風(fēng)不良、高溫高濕以及其他疾病的繼發(fā)性導(dǎo)致雞只受到應(yīng)激或造成機(jī)體免疫力下降都可引發(fā)此病，雞葡萄球菌病的發(fā)生常常與飼養(yǎng)管理水平、飼養(yǎng)密度和環(huán)境潔凈度有直接關(guān)系，有關(guān)養(yǎng)殖場管理者應(yīng)當(dāng)做好預(yù)防工作，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，盡量減少或防止誘因的出現(xiàn)，保持雞群良好的精神狀態(tài)，雞舍應(yīng)通風(fēng)良好且有適宜的光照，維持合適的溫度和濕度，注意清除有可能導(dǎo)致雞外傷的因素，防止雞只因外傷增加感染此病的概率，防患于未然。

4 結(jié)論

（1）從福建地區(qū)該養(yǎng)殖場病料中分離所得菌株經(jīng)鑒定為金黃色葡萄球菌。（2）通過藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，該菌的耐受藥物為萘啶酸、磺胺復(fù)合物、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星，敏感藥物為阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟。（3）福建地區(qū)該養(yǎng)殖場在發(fā)病之后為達(dá)到控制效果，應(yīng)選用敏感性較高的阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟，避免使用萘啶酸、磺胺復(fù)合物、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等耐藥性藥物。