徐彥龍,徐秀梅,郭茂娟,姜希娟

(1.甘肅省中醫(yī)院,蘭州 730050;2.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193)

針刺治療腦梗死療效肯定,已普遍應(yīng)用于臨床。近年來,國內(nèi)外學(xué)者從多個角度闡述了針刺作用的機制,包括減輕患者的顱內(nèi)炎癥反應(yīng)[1];保護血腦屏障、抑制腦細胞凋亡、減輕腦水腫,改善缺血再灌注損傷,改善腦血流,改善神經(jīng)功能缺損[2-3];刺激腦皮質(zhì)運動中樞,改善損傷部位血液循環(huán),促進神經(jīng)功能恢復(fù),改善日常生活能力,降低致殘率[4];促進神經(jīng)元興奮,促進新的神經(jīng)傳導(dǎo)通路的建立[5];增加腦血流,促進微血管內(nèi)皮細胞增生,促進顱內(nèi)血管新生,減少腦缺血損傷,保護腦組織[6]等。腦梗死應(yīng)及時恢復(fù)血液循環(huán),盡量減少缺血所致神經(jīng)細胞變性程度及范圍,盡管再灌注可能產(chǎn)生損傷,但再灌注利大于弊,改善腦循環(huán)是治療腦梗死的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[7]。研究表明動脈血管平滑肌細胞胞內(nèi)Ca2﹢濃度升高是導(dǎo)致血管收縮的關(guān)鍵因素,雖然胞質(zhì)內(nèi)Ca2﹢濃度的調(diào)節(jié)機制十分復(fù)雜,但Ca2﹢濃度上升后的降低過程,主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜上的Ca2﹢-ATP酶和鈉鈣交換體兩種機制介導(dǎo)[8]。因此,本實驗以腦動脈血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶及鈉鈣交換體中存在于腦動脈血管中的NCX1、NCX3兩種亞基的表達為切入點,探討電針“水溝”穴對腦梗死大鼠改善腦循環(huán)的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級健康雄性Wistar大鼠130只,體質(zhì)量(200±20)g,許可證號為SCXK(京)2016-0006,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。于安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng),室溫21～27 ℃,相對濕度(50±5)%,自然光照,空氣流通。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,在SPSS 23.0統(tǒng)計軟件中生成隨機數(shù)字表,通過查閱隨機數(shù)字表隨機分為空白組10只,模型組、電針組和假手術(shù)組各40只,后3組按術(shù)后3 h、6 h、12 h、24 h共4個時相分為4組,每個時相10只。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》[9]。

1.2 主要試劑與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司,K1622),引物(上海生工公司),熒光定量試劑盒(美國Fermentas公司,T2210),DEPC(美國Amresco公司,E476-100 ML),抗Ca2﹢-ATP酶抗體(Abcam公司,ab2825),羊抗小鼠IgGH&L(HRP)抗體(Abcam公司,ab6789),硝酸纖維膜(美國Millpore公司,HATF00010),ECL發(fā)光試劑盒(美國Millpore公司,WBKLS0050),內(nèi)參(Santa公司,sc-81178);LH202H型韓氏電針儀(北京華運安特科技公司);激光多譜勒血流儀(北京吉安得爾科技有限公司);Micro21R臺式高速冷凍離心機(美國BECKMAN公司);DYY-11B型電泳儀(北京六一生物科技有限公司);ZDP-A2050A恒溫孵育箱(上海智城分析儀器制造有限公司);GIS-2008數(shù)碼凝膠圖像分析處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);7500FAST熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 造模方法

參照LONGA E Z等[10]造模方法,建立大鼠MCAO模型。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,術(shù)前12 h禁食,自由飲水。用10%的水合氯醛溶液(每100 g體質(zhì)量注射0.3 mL)腹腔注射,將麻醉后的大鼠四肢用皮筋牽拉固定,仰臥位放置于手術(shù)板上,用烤燈將大鼠體溫維持在(37.0±0.5)℃。在大鼠頸前均勻涂抹肥皂水后,用刀片輕輕刮剔頸前的鼠毛,碘伏消毒,沿頸部正中偏左側(cè)切口,依次分離出左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,然后結(jié)扎頸總動脈近心端、頸外動脈和分叉處放置動脈夾。在兩動脈夾之間用1 mL注射器扎一個小孔,選擇直徑為0.204 mm的尼龍線栓插入小孔,插入尼龍線栓后放開頸總動脈分叉處動脈夾,接著繼續(xù)插入線栓總計長度為18～22 mm,線栓進入頸內(nèi)動脈至稍遇阻力即停止進線,結(jié)扎線栓。用0.9%的生理鹽水沖洗手術(shù)切口,再用棉球擦拭干凈切口后,注入適量慶大霉素,然后縫合皮膚。用碘伏擦拭縫合后的傷口,重復(fù)2次。假手術(shù)組依次分離出左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈,牽拉頸總動脈和頸內(nèi)動脈后,縫合皮膚,并不插入線栓。

以大鼠顱骨冠狀縫與矢狀縫結(jié)合點為原點,冠狀縫向后4 mm、矢狀縫旁開3 mm的位置固定激光多譜勒探頭,監(jiān)測局部腦血流量。以大鼠麻醉5 min后局部腦血流量為基值,MCAO后即刻再次測定局部腦血流量,造模后局部腦血流量下降至基值血流量的25%～30%時視為造模成功[11]。若實驗過程中大鼠死亡,或在取腦時見有蛛網(wǎng)膜下腔出血或頸內(nèi)動脈分叉部出血則排除。

1.4 干預(yù)方法

電針組造模后即刻針刺大鼠“水溝”穴,定位參照華興邦等主編的《大鼠穴位圖譜的研制》[12],在大鼠鼻中隔下用0.25 mm×13 mm毫針方向向上斜刺2 mm,并在該部位下約2 mm處刺入另一毫針作為參考電極,“水溝”穴接正極,參考電極接負極,用15 Hz、2 mA的連續(xù)波刺激20 min[13]?？瞻捉M、假手術(shù)組和模型組均同樣抓取固定,但不做任何治療。電針組、模型組、假手術(shù)組動物均按時相斷頭處死,空白對照組動物在第1次抓取后6 h內(nèi)斷頭處死。

1.5 樣本制備

為了研究樣本更加準確,本次實驗采用分跟分離法[14]。大鼠斷頭后,迅速剝離大腦,用4 ℃生理鹽水沖洗,置于冰袋上,在外科顯微鏡下分別分離和剪取梗死側(cè)的大腦前動脈、中動脈和后動脈各8 mm(以各動脈從Willis環(huán)分出處為起點,沿各動脈循行8 mm處為終點)。然后將腦動脈血管迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標

1.6.1 腦梗死半球腦血流的監(jiān)測[11]

各組經(jīng)水合氯醛溶液麻醉后,仰臥位固定,手術(shù)常規(guī)操作,沿頭皮正中縱向切口約 2 cm,分離皮下組織,剝離骨膜,暴露冠狀縫及矢狀縫(此手術(shù)操作模型組、電針組、假手術(shù)組同造模一起進行,空白組不進行),多普勒激光探頭固定部位以冠狀縫與矢狀縫結(jié)合點為原點,冠狀縫向后4 mm,矢狀縫旁開3 mm,定位后用牙科鉆將顱骨磨薄,固定激光多普勒探頭,每只大鼠測定1 min,取1 min內(nèi)平均血流值作為檢測所需數(shù)值。依次記錄大鼠麻醉后線栓要阻塞側(cè)大腦局部腦血流量(將此時腦血流量定為基值100),造模后5 min線栓阻塞側(cè)大腦局部腦血流量(regional cerebral blood flow, rCBF)和術(shù)后3 h、6 h、12 h、24 h阻塞側(cè)局部腦血流量,并和基值對比,得出相應(yīng)的腦血流數(shù)值。

1.6.2 Western blot法檢測血管組織中Ca2﹢-ATP酶的相對表達量

從液氮中取出腦動脈血管,用RIPA裂解液抽提蛋白,采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定后,各樣品取20 μg,加等量樣本處理液后,100 ℃煮沸5 min,進行10% SDS-PAGE變性電泳,經(jīng)電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)置硝酸纖維素膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h,而后加入含一抗的封閉液(1:3000)4 ℃恒溫室搖床孵育過夜,洗去抗體后加入含二抗的封閉液(1:2000),室溫搖床作用2 h。洗去抗體后按ECL發(fā)光試劑盒說明依次進行化學(xué)顯影。將膠片進行掃描或拍照,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶和內(nèi)參條帶的凈吸光度值,最終計算出目標條帶與內(nèi)參條帶的比值。

1.6.3 RT-qPCR法檢測血管中NCX1及NCX3的表達量

將大鼠處死后剝離腦動脈血管,加入1 mL裂解液充分裂解組織,按照RNA提取試劑盒說明書操作,提取總RNA。測量RNA的濃度和純度。然后再進行一步法熒光定量RT-qPCR反應(yīng)。條件為預(yù)變性95 ℃持續(xù)2 min;變性95 ℃持續(xù)15 s;擴增60 ℃持續(xù)60 s;退火72 ℃持續(xù)45 s,變性和延伸設(shè)置為40個循環(huán)擴增(約50 min)。通過CFX manager 3.1軟件讀取Ct值,計算平均值。mRNA相對表達量采用2﹣△△Ct法進行計算分析。引物序列見表1。

表1 各檢測指標引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示,重復(fù)測量資料比較選用重復(fù)測量方差分析,根據(jù)球形檢驗結(jié)果采用Sphericity Assumed法分析組間差異,后選用Bonferroni法進行兩兩比較;多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法;方差不齊則采用Games-Howell法。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布,采用Cruskal Wallis秩和檢驗進行分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對MCAO模型大鼠腦血流量的影響

與假手術(shù)組比較,模型組和電針組各時項血流量均明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。電針干預(yù)后,電針組大鼠腦血流量均高于模型組,其中在3 h、6 h、12 h時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各時相大鼠相對腦血流量對比 (±s)

表2 各時相大鼠相對腦血流量對比 (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 3 h 6 h 12 h 24 h假手術(shù)組 10 105.619±7.681 105.620±7.679 105.621±7.681 105.620±7.679模型組 10 79.001±7.5601) 71.501±9.7901) 60.171±8.6601) 68.411±16.2211)電針組 10 88.549±6.9211)2) 83.531±5.3301)2) 72.001±8.6691)2) 72.910±6.9901)

2.2 電針對 MCAO模型大鼠腦動脈血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶表達的影響

與空白組和假手術(shù)組比較,模型組各時項Ca2﹢-ATP酶表達量的表達水平均有下調(diào),但僅3 h時項下調(diào)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與同時項模型組比較,電針組3 h時項Ca2﹢-ATP酶表達量的表達水平上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見圖1、表3。

表3 4組不同時項腦動脈血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶表達的比較 (±s)

表3 4組不同時項腦動脈血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶表達的比較 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05

組別 n 3 h 6 h 12 h 24 h空白組 10 1.206±0.3021) - - -假手術(shù)組 10 1.323±0.1971) 1.234±0.086 1.556±0.539 1.355±0.205模型組 10 0.827±0.279 1.056±0.154 1.205±0.296 1.094±0.189電針組 10 1.174±0.1451) 1.185±0.126 1.218±0.324 1.119±0.199

圖1 各組大鼠腦動脈血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶免疫印跡實驗結(jié)果

2.3 電針對MCAO模型大鼠腦動脈血管平滑肌中NCX1和NCX3 mRNA表達的影響

2.3.1 電針對MCAO模型大鼠腦動脈血管平滑肌中NCX1 mRNA表達的影響

與空白組和假手術(shù)組比較,模型組各時項NCX1 mRNA的表達水平均下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與同時項模型組比較,電針組3 h、6 h時項NCX1 mRNA的表達水平上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表4。

表4 4組不同時項腦動脈血管平滑肌中NCX1 mRNA表達的比較 (±s)

表4 4組不同時項腦動脈血管平滑肌中NCX1 mRNA表達的比較 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05

組別 n 3 h 6 h 12 h 24 h空白組 10 1.056±0.0731) - - -假手術(shù)組 10 1.075±0.1011) 1.003±0.0911) 1.000±0.0341) 1.001±0.0491)模型組 10 0.744±0.232 0.775±0.045 0.768±0.211 0.923±0.017電針組 10 1.014±0.0851) 0.967±0.1761) 0.883±0.068 0.939±0.043

2.3.2 電針對MCAO模型大鼠腦動脈血管平滑肌中NCX3 mRNA表達的影響

與空白組和假手術(shù)組比較,模型組各時項NCX3 mRNA的表達水平均下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與同時項模型組比較,電針組3 h時項,NCX3 mRNA含量的表達水平上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表5。

表5 4組不同時項腦動脈血管平滑肌中NCX3 mRNA表達量的比較 (±s)

表5 4組不同時項腦動脈血管平滑肌中NCX3 mRNA表達量的比較 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05

組別 n 3 h 6 h 12 h 24 h空白組 10 1.011±0.0721) - - -假手術(shù)組 10 1.007±0.1381) 1.001±0.0561) 1.013±0.1921) 1.036±0.0471)模型組 10 0.719±0.163 0.832±0.135 0.615±0.072 0.660±0.267電針組 10 0.950±0.0381) 0.973±0.088 0.999±0.369 0.792±0.108

3 討論

3.1 水溝的選穴依據(jù)及“腦表面動脈血管樞紐學(xué)說”

水溝是石學(xué)敏院士創(chuàng)立的醒腦開竅針刺法治療中風(fēng)的主穴之一,治療腦梗死的療效已經(jīng)被臨床所證實,并被國家科技部和中醫(yī)藥管理局確立為中醫(yī)藥科技成果在全國進行推廣。前期研究證實針刺MCAO大鼠“水溝”穴可緩解大腦中動脈平滑肌痙攣[15],促進缺血半暗帶的血管舒張[16],并能促進血管新生及側(cè)支循環(huán)的建立[17]。通過系列研究,導(dǎo)師杜元灝教授初步提出了腦梗死側(cè)支循環(huán)發(fā)生發(fā)展的“腦表面動脈血管樞紐學(xué)說”,即當腦梗死急性發(fā)生后,腦表面?zhèn)戎а芟到y(tǒng)猶如一個“閘門”,決定著腦缺血區(qū)能否及時有效地接受來自非缺血區(qū)的側(cè)支循環(huán)血流,并壓送這些代償血流進入微細血管,以營養(yǎng)缺血的神經(jīng)元組織,“閘門”的機能狀態(tài)決定著缺血細胞的命運。急性腦梗死發(fā)生后,造成“閘門”的阻力增大,血管自律運動出現(xiàn)高頻率低振幅,其流質(zhì)、流場的動態(tài)耦合發(fā)生障礙,表現(xiàn)為“高速低效震蕩”,成為缺血腦組織獲取正常血流的障礙[18]。研究還發(fā)現(xiàn)針刺并非如擴張血管的藥物那樣,只是簡單的擴張血管,而是有效地改善微血管的舒縮協(xié)調(diào)運動,協(xié)調(diào)流質(zhì)、流場的動態(tài)耦合運動。因此,針刺水溝改善腦血管的機能狀態(tài),促進腦表面血管側(cè)支循環(huán)是治療急性腦血管病的重要途徑,于是腦表面血管系統(tǒng)就成為研究電針水溝治療腦血管病效應(yīng)的切入點之一。

3.2 急性腦血管病選水溝穴的理論基礎(chǔ)

《素問·陰陽應(yīng)象大論》:“陰陽者,天地之道也,萬物之綱紀,變化之父母,生殺之本始,神明之府也,治病必求于本?！睋?jù)此中醫(yī)學(xué)將“調(diào)和陰陽”作為治療疾病的大法和總綱。任脈總?cè)我簧碇幗?jīng),調(diào)節(jié)陰經(jīng)氣血,為“陰脈之?！?督脈總督一身之陽經(jīng),為“陽脈之海”,從循行線路上來看[19]任脈循行“上行環(huán)繞口唇,經(jīng)面部進入目眶下,聯(lián)系與目”、督脈循行“沿前額下行鼻柱,止于上唇系帶處”。因此,水溝是任督二脈經(jīng)脈循行線有穴通路上在頭面部唯一的交會穴。因此要調(diào)和全身經(jīng)脈的陰陽,非水溝莫屬;而這也是“急救刺水溝”的真正理論依據(jù)。石學(xué)敏院士在治療腦梗死患者昏迷的時候,采用雀啄手法急刺水溝穴時,要求刺激量必須達到使患者流淚、流涕或者額頭汗出為止,其實這也是陰陽交感、陰陽調(diào)和后的具體臨床表現(xiàn)[20]。故在動物實驗中,筆者用電針刺激“水溝”,既能保證針刺效應(yīng)的一致性,也能體現(xiàn)臨床醒腦開竅針法的精髓。

3.3 血管平滑肌的舒縮與Ca2﹢濃度之間的關(guān)系

血管平滑肌細胞內(nèi)Ca2﹢濃度的穩(wěn)態(tài)對于血管平滑肌細胞的舒縮有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明血管平滑肌細胞內(nèi)Ca2﹢濃度升高是導(dǎo)致血管收縮的關(guān)鍵因素,而細胞內(nèi)Ca2﹢濃度升高主要通過細胞膜電壓依賴性鈣通道[21-22]和受體門控鈣通道[23-24]使細胞外Ca2﹢大量內(nèi)流,內(nèi)流的Ca2﹢與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物激活肌球蛋白輕鏈激酶,從而進一步引發(fā)平滑肌的收縮。而細胞內(nèi)Ca2﹢的清除,則主要通過兩種機制,Na﹢-Ca2﹢交換[25]是Na﹢從膜的一側(cè)轉(zhuǎn)運到另一側(cè)以交換Ca2﹢的反方向運動,它依賴于Na﹢-K﹢ATP酶建立的胞內(nèi)外濃度以及膜電位;Ca2﹢-ATP酶通過主動的耗能,每分解一個ATP,可轉(zhuǎn)運1～2個Ca2﹢到細胞外或肌漿網(wǎng),同時,按1:2的比例轉(zhuǎn)運H﹢到胞內(nèi),以維持膜內(nèi)外的電中性。二者相互協(xié)作,可直接降低細胞內(nèi)Ca2﹢濃度,磷酸化絲氨酸使平滑肌舒張。

3.4 實驗結(jié)果對臨床的指導(dǎo)意義

從本次實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠腦梗死后24 h內(nèi),電針干預(yù)可明顯抑制腦動脈血管平滑肌上 Ca2﹢-ATP酶和NCX mRNA表達的下調(diào),雖其干預(yù)最佳時項二者不太一致,糾其原因可能是Ca2﹢-ATP酶對Ca2﹢的親和性很高,在細胞排鈣的過程中,主要起到一種靈敏的調(diào)節(jié)作用,而NCX對Ca2﹢的親和性低,但轉(zhuǎn)運容量高,能夠清除胞內(nèi)大量的Ca2﹢的緣故[26],而NCX1和NCX3對Ca2﹢的親和性之間的差異,可能是造成電針干預(yù)時項NCX1和NCX3不完全一致的主要原因。結(jié)合筆者團隊前期研究成果[27-28],提示筆者在腦梗死急性期針刺治療或許可以以6 h左右為間隔,反復(fù)針刺,對提高臨床療效或許有積極意義。

綜上所述,電針干預(yù)可明顯抑制腦血管平滑肌上NCX1和NCX3及Ca2﹢-ATP酶表達量的下調(diào),從而減輕腦動脈血管平滑肌內(nèi)Ca2﹢超載,維持細胞內(nèi)外Ca2﹢穩(wěn)態(tài),進而對于抑制缺血后血管平滑肌痙攣,保持血管功能和狀態(tài)的正常,增加腦梗死區(qū)周圍血流灌注具有重要作用,但針刺效應(yīng)具有一定時效性。