李志芳， 張 裕， 王 穎,2,3， 佐兆杭， 孫 維， 張乃丹， 周欣雨

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319) (黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，大慶 163319)

蕓豆，又名四季豆，在我國(guó)種植廣泛，已成為栽培面積僅次于黃豆的食用豆類(lèi)農(nóng)作物[1]，富含蛋白質(zhì)、B族維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)含有多種人體必需氨基酸，且氨基酸比例較為均衡，是一種比較難得的高鉀、高鎂、低鈉食品[2]。蕓豆含有多種活性物質(zhì)，研究表明，蕓豆α-淀粉酶抑制劑可有效改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠高脂血癥、胰島素抵抗及抗氧化防御系統(tǒng)，降低機(jī)體氧化應(yīng)激及血糖靈敏度[3，4]；蕓豆蛋白酶解成多肽后，不僅能夠提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且方便吸收，還具有抗氧化、降血壓、抗菌等多種功能活性[5]。

大豆，通稱(chēng)黃豆，含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸、鈣及B族維生素，其高含量的蛋白質(zhì)能夠提供潛在活性肽，可抑制與機(jī)體氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等[6]。大豆中的酚類(lèi)化合物具有優(yōu)異的還原性能，能夠通過(guò)清除ROS來(lái)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化而有效清除自由基，可作為抗氧化劑保護(hù)細(xì)胞[7，8]。發(fā)酵豆制品經(jīng)過(guò)微生物及其分泌的酶系作用后，把不溶性高分子物質(zhì)分解成可溶性低分子物質(zhì)，保留了大豆異黃酮和低聚糖等原有功能性物質(zhì)[9，10]，對(duì)于維持人類(lèi)身體健康具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

蕓豆和大豆本身含有許多活性物質(zhì)，它們存在于各自的植物細(xì)胞中，其外層是由纖維素組成的細(xì)胞壁，機(jī)械方法能夠幫助破壞植物細(xì)胞，但是對(duì)于溶出或釋放活性物質(zhì)的效率不高，通過(guò)微生物的生化作用能有效解決這個(gè)問(wèn)題。微生物通過(guò)發(fā)酵，能夠分泌多種酶并對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行分解，從而有效地促進(jìn)活性物質(zhì)的釋放[11]。同時(shí)，發(fā)酵原料經(jīng)過(guò)多種微生物共同發(fā)酵后，會(huì)使發(fā)酵液富含多種酶類(lèi)，包括超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶等功效酶[12，13]，保護(hù)機(jī)體不受自由基損害的同時(shí)提高功能性化合物的活性[14]。目前開(kāi)發(fā)的發(fā)酵豆類(lèi)產(chǎn)品多以單一原料為主，復(fù)合發(fā)酵的研究相對(duì)較少，因此本研究選用蕓豆、大豆為復(fù)合發(fā)酵原料，探究其最佳發(fā)酵條件及抗氧化活性，旨在為開(kāi)發(fā)新型復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆、大豆；活性干酵母、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)；耐高溫α-淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(10 000 U/mL)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、羥自由基檢測(cè)試盒。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-Y912料理機(jī)；S220 pH計(jì)；H1850R冷凍離心機(jī)；BCV-6S1超凈工作臺(tái)；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱；V-5100B可見(jiàn)分光光度計(jì)；YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

菌種的活化與培養(yǎng)：乳酸菌活化時(shí)取10%液態(tài)保藏的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌菌液于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，菌液待用。酵母菌活化時(shí)活性干酵母于10倍體積蒸餾水中溶解，30～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，待用。

清汁的發(fā)酵：紫花蕓豆、大豆清洗后去皮，按1∶3料水質(zhì)量體積比打漿。雙酶法進(jìn)行水解，液化條件為α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH=6.0、酶解溫度97 ℃、時(shí)間20 min；糖化條件為加酶量200 μL/100 mL、pH 4.5、溫度60 ℃、時(shí)間30 min。酶解液于高速離心機(jī)中以1.0×104r/min離心15 min得清汁。調(diào)清汁pH 5.0、裝瓶量30 mL、糖添加量8%后滅菌。冷卻后接種0.2%酵母菌，32 ℃恒溫振蕩24 h進(jìn)行預(yù)發(fā)酵，按1∶1(共同發(fā)酵)比例接種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌恒溫發(fā)酵24 h。4 ℃后發(fā)酵并保藏備用。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

清汁初始pH 5.0，添加8%白砂糖后滅菌，接種3%復(fù)配乳酸菌，32 ℃發(fā)酵24 h(發(fā)酵時(shí)間由前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定)，測(cè)定發(fā)酵液SOD活力。固定其他條件，分別考察糖添加量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度對(duì)SOD活力的影響，使用超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒測(cè)定。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型，以糖添加量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度4個(gè)單因素為自變量，以發(fā)酵液SOD活力為響應(yīng)值，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.3.5 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

取2 mL樣品溶液與2 mL 0.02 mg/mL DPPH-乙醇溶液混勻，室溫下暗反應(yīng)30 min，空白組以無(wú)水乙醇代替試樣，517 nm處測(cè)定樣品吸光度值。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用無(wú)水乙醇代替DPPH時(shí)測(cè)得對(duì)應(yīng)濃度的吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.3.5.2 羥自由基清除能力測(cè)定

使用羥自由基測(cè)試試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由圖1所示，SOD活力隨糖添加量增加而升高，在糖添加量為6%時(shí)出現(xiàn)峰值，隨后有所下降，推測(cè)糖類(lèi)作為菌種發(fā)酵最重要的碳源物質(zhì)，在一定范圍內(nèi)糖濃度增大可能誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)主要代謝途徑的酶活力水平有所提升[15]，但是糖濃度過(guò)高會(huì)使發(fā)酵液滲透壓增高，造成細(xì)胞壁特性發(fā)生改變，使菌種生長(zhǎng)周期停滯甚至凋亡[16]，影響發(fā)酵的正常進(jìn)行。因此本實(shí)驗(yàn)條件下確定最適糖添加量為6%。

由圖1所示，SOD活力隨初始pH的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，初始pH為4時(shí)達(dá)到峰值，原因可是SOD化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，其分子內(nèi)部規(guī)律性結(jié)構(gòu)易受pH、溫度等物理或化學(xué)因素影響，導(dǎo)致氫鍵斷裂進(jìn)而使空間結(jié)構(gòu)遭到破壞[17]，使酶活性降低。

接種量的高低會(huì)影響發(fā)酵初期乳酸菌的生長(zhǎng)速度，由圖可知，SOD活力隨接種量的增大而增大，但當(dāng)接種量大于4%時(shí)，SOD活力呈下降趨勢(shì)，分析原因可能是當(dāng)乳酸菌超過(guò)適宜接種量時(shí)，會(huì)縮短延滯期并很快到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，體系的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在此階段易被迅速消耗掉[18]，不利于后期發(fā)酵的持續(xù)性進(jìn)行，而接種量過(guò)低易污染雜菌不利于菌種生長(zhǎng)增殖[19]，因此選用4%為最佳接種量以保證發(fā)酵過(guò)程的正常進(jìn)行。

發(fā)酵溫度會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而影響發(fā)酵液中抗氧化物質(zhì)含量和活性[20]。由圖1所示，SOD活力隨著發(fā)酵溫度的升高逐漸增大，說(shuō)明發(fā)酵溫度的升高有利于增強(qiáng)微生物的活性，可促進(jìn)維生素C、酚類(lèi)等抗氧化物質(zhì)的溶出或產(chǎn)生[21]，使體系抗氧化物質(zhì)含量增加而增強(qiáng)SOD活力，但是溫度過(guò)高就會(huì)抑制微生物中酶的活性，同時(shí)縮短發(fā)酵周期，影響微生物的正常生長(zhǎng)代謝，從而使產(chǎn)生的SOD及各產(chǎn)物量變低。因此本實(shí)驗(yàn)條件下選用32 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果及分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)各因素水平的復(fù)合發(fā)酵液SOD活力見(jiàn)表2。對(duì)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，所得回歸方程為：Y=270.03+2.44A-2.20B+4.43C+0.64D-2.10AB-4.23AC+2.72AD+6.16BC-5.05BD-1.92CD-23.06A2-18.79B2-18.64C2-11.43D2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸方程方差分析及結(jié)果

2.2.3 交互作用分析

通過(guò)三維響應(yīng)面和二維等高線圖分析可得，隨著糖添加量、初始pH、接種量和發(fā)酵溫度的增大，發(fā)酵液SOD活力隨之增大，但當(dāng)4個(gè)因素增加到一定程度時(shí)，SOD活力呈下降趨勢(shì)，其中初始pH與接種量、發(fā)酵溫度兩因素交互作用等高線圖密集成橢圓形，說(shuō)明兩因素交互作用顯著，由響應(yīng)面圖對(duì)比可知，接種量和糖添加量曲面彎曲程度較大，表明其對(duì)發(fā)酵液SOD活力影響顯著，與方差分析結(jié)果相一致。經(jīng)Design Expert 8.0.6優(yōu)化復(fù)合發(fā)酵液工藝參數(shù)得：糖添加量6.10%，初始pH 3.98，接種量4.10%，發(fā)酵溫度32.07 ℃，此條件下發(fā)酵液SOD活力預(yù)測(cè)值可達(dá)270.383 U/mL?？紤]到實(shí)踐操作可行性，調(diào)整工藝參數(shù)為糖添加量6%、初始pH 4.0、接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)得復(fù)合發(fā)酵液SOD活力為268.46 U/mL(誤差0.61%)，與理論值基本吻合，證明優(yōu)化的工藝參數(shù)具有準(zhǔn)確性。

2.3 不同發(fā)酵階段復(fù)合發(fā)酵液抗氧化活性分析

2.3.1 發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率變化

DPPH是一個(gè)以氮原子為中心的穩(wěn)定脂溶性自由基，是體外檢測(cè)物質(zhì)抗氧化效果最常用的一種方法，可在短時(shí)間內(nèi)較穩(wěn)定評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性[22]。如圖2所示，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除率呈先迅速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。發(fā)酵24 h時(shí)，DPPH自由基清除率迅速增長(zhǎng)約2倍，隨后以小幅趨勢(shì)繼續(xù)增長(zhǎng)，說(shuō)明在適當(dāng)發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，發(fā)酵液DPPH自由基清除能力會(huì)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而有所提高，至發(fā)酵結(jié)束可達(dá)90.72%，分析原因可能與發(fā)酵過(guò)程釋放的酚類(lèi)、黃酮物質(zhì)有關(guān)，同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生如超氧化物歧化酶等抗氧化酶，它們共同作用可提高DPPH自由基清除率。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中DPPH、羥自由基清除能力的變化

2.3.2 發(fā)酵過(guò)程中羥基自由基清除能力變化

羥自由基是一種重要的活性氧，是人體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基，它可以使組織中的糖類(lèi)、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化，遭受氧化性損傷和破壞，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或突變[23]。如圖2所示，羥基自由基的清除能力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)清除能力增長(zhǎng)至606.26 U/mL，約為發(fā)酵初始值的2倍。羥基自由基清除能力的提高可能是由于發(fā)酵液中有機(jī)酸、大豆多酚等包含有自由羥基的酚類(lèi)物質(zhì)，能提供活潑的氫終止自由基連鎖反應(yīng)。同時(shí)，發(fā)酵能夠?qū)⒋蠓肿拥鞍追纸鉃槟┒税被釟埢哂锌寡趸钚缘男》肿佣嚯腫24]，增強(qiáng)體系抗氧化能力。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)蕓豆/大豆復(fù)合發(fā)酵液工藝參數(shù)優(yōu)化及功能性分析，結(jié)果表明：復(fù)合發(fā)酵液最優(yōu)工藝條件為糖添加量6%、初始pH 4.0、接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃，此條件下發(fā)酵液SOD活力為268.46 U/mL。復(fù)合發(fā)酵液DPPH自由基清除率及羥自由基清除率能力顯著增長(zhǎng)，至發(fā)酵結(jié)束其清除能力分別為90.72%和606.26 U/mL，證明經(jīng)工藝優(yōu)化后的發(fā)酵液具有良好的抗氧化活性。