余 巍, 桂英愛, 毛希琴, 李海燕, 張敬波

(大連市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116630)

開展農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留分析及相應(yīng)的監(jiān)管是保障消費(fèi)者食品安全的重要手段，受到各國政府及公眾的廣泛關(guān)注。為此，中國制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[1]，相應(yīng)地，為滿足殘留檢測需求，各種各樣的技術(shù)和方法被開發(fā)出來。在常規(guī)分析實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)藥殘留分析往往要面對多種復(fù)雜基質(zhì)和性質(zhì)各異的化合物，給農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留監(jiān)測帶來了極大的挑戰(zhàn)。

QuEChERS 樣品前處理方法快速、簡便、高效[2]，已成為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的快速檢測技術(shù)。同時，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 (GC-MS)[3]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 (LC-MS)[4-6]以及高分辨質(zhì)譜法 (HRMS)[7-9]等技術(shù)，其適用性和可靠性均得到了廣泛的證實(shí)。在氣相色譜進(jìn)樣過程中，共提取基質(zhì)成分會減少色譜系統(tǒng)活性位點(diǎn)與目標(biāo)待測物作用的機(jī)會，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，并且往往導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)[10-11]，因此，在定量時，減少基質(zhì)效應(yīng)的影響是必須考慮的問題。減少基質(zhì)效應(yīng)的方法通常有基質(zhì)凈化去除法[12]、標(biāo)準(zhǔn)添加法[13]、同位素內(nèi)標(biāo)法[14-15]和基質(zhì)匹配曲線法[7，9]等。其中，基質(zhì)凈化去除法通常在針對某一類目標(biāo)化合物時應(yīng)用優(yōu)勢較大，但用于農(nóng)藥多殘留檢測則存在耗時長、待測化合物損失多和樣品污染等問題；標(biāo)準(zhǔn)添加法有一定局限性且較少應(yīng)用于日常檢測；同位素內(nèi)標(biāo)法會增加檢測成本?；|(zhì)匹配校準(zhǔn)法是目前應(yīng)用最為廣泛且可靠的方法，能有效減少基質(zhì)效應(yīng)和提升方法準(zhǔn)確度?；|(zhì)匹配校準(zhǔn)法通常有兩種方式：一種是取不含待測物的空白基質(zhì)樣品，經(jīng)過與樣品前處理相同的方法制得空白基質(zhì)溶液，并用其稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制；另一種是在空白基質(zhì)樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過與樣品相同的前處理，再通過以樣品中待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、以其響應(yīng)值為縱坐標(biāo)建立的校準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量。許多文獻(xiàn)往往采用其中的一種方式，尚未見將兩種定量方法進(jìn)行比較的研究報道。鑒于此，本研究采用QuEChERS 前處理方法和GC-MS/MS 相結(jié)合、一次進(jìn)樣測定葡萄中78 種農(nóng)藥殘留的分析方法，來評估4 種基質(zhì)匹配曲線校準(zhǔn)方法的優(yōu)劣，以期為日常實(shí)驗(yàn)室中的農(nóng)藥多殘留檢測提供應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890B-7010B 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配電子轟擊離子源 (EI) 和 Agilent MassHunter 工作站，美國Agilent 公司；XS 204 型分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；3-16L 離心機(jī)，德國Sigma公司；N-EVAP 112 型氮吹儀，美國Organomation公司；HS 501 型機(jī)械振蕩器，德國IKA 公司。

外環(huán)氧七氯 (1000 mg/L)，購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司，其他農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 (100 mg/L) 均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；QuEChERS 前處理方法提取包(含4 g 硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉) 和QuEChERS 前處理方法凈化包(含900 mg 硫酸鎂及150 mg PSA)，購自美國Agilent 公司；乙腈、乙酸乙酯和丙酮均為色譜純，購自美國Tedia 公司。樣品購自本地市場。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：取除外環(huán)氧七氯外的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各1 mL，混合，濃縮至近干；用2 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，配制成50 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。外環(huán)氧七氯用乙酸乙酯稀釋成10 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.2 樣品前處理

稱取樣品10 g (精確至0.01 g) 于50 mL 離心管中，加入100 μL 10 mg/L 外環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)工作溶液和10 mL 乙腈，混合均勻后加入QuEChERS 提取包，振蕩提取30 min 后于4000 r/min 下離心5 min；取6 mL 上清液，置于裝有QuEChERS 凈化包的15 mL 離心管中，渦旋混合1 min 后于4000 r/min 下離心1 min；取1 mL 上清液氮吹至近干，用1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜，待測定。

1.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

1.3.1 空白基質(zhì)溶液配制 稱取空白葡萄樣品10 g(精確至0.01 g)，按1.2 節(jié)的步驟進(jìn)行前處理，獲得空白基質(zhì)溶液。取1 mL 空白基質(zhì)溶液氮吹至近干，用1 mL 配制好的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 (0.005、0.01、0.02、0.05 和0.1 mg/L，內(nèi)標(biāo)均為0.1 mg/L) 復(fù)溶后過0.22 μm 濾膜，待測定。該溶液中每毫升含1 g葡萄基質(zhì)，定量分析時分別采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。

1.3.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取空白葡萄樣品10 g (精確至0.01 g)，置于50 mL 離心管中，分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL，配制成0.005、0.01、0.02、0.05 和0.1 mg/kg內(nèi)標(biāo)含量為0.1 mg/kg 的空白添加基質(zhì)樣品，經(jīng)過同1.2 節(jié)的前處理制備得到一系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。定量分析時分別采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：HP-5ms UI 石英毛細(xì)管色譜柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣；進(jìn)樣口溫度240 ℃。程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min 的速率升至120 ℃；再以5 ℃/min 的速率升至310 ℃。柱流量1.04 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：EI 離子源；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子電壓70 eV；動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測 (dMRM) 模式；溶劑延遲2 min。各農(nóng)藥優(yōu)化后的儀器采集參數(shù)見表1。

表1 78 種農(nóng)藥的保留時間、定量離子對、定性離子對和碰撞電壓Table 1 Retention time, quantifier mass transition, qualifier mass transition, collision energies of the 78 pesticides

續(xù)表1Table 1 (Continued)

續(xù)表1Table 1 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的選擇

QuEChERS 方法被提出后，分別衍生出了針對酸堿敏感農(nóng)藥的乙酸緩沖鹽提取體系，以及較弱酸性的檸檬酸緩沖鹽提取體系，前者形成了美國官方分析方法AOAC 2007. 01，后者形成了歐盟官方分析方法EN 15662，中國也于2018 年發(fā)布了結(jié)合以上兩種方法的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113[16]。以上方法在各種基質(zhì)中、針對大量不同性質(zhì)的農(nóng)藥殘留分析均取得了滿意的分析結(jié)果[17]，已經(jīng)有成熟的可以借鑒的分析流程。因此，本研究遵循EN 15662 的方法，采用商品化的提取和凈化試劑包，以減少試驗(yàn)過程中人為產(chǎn)生的誤差，方法僅在內(nèi)標(biāo)選擇和進(jìn)樣溶劑選擇上參照了國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113，即進(jìn)樣溶劑由乙腈置換成了乙酸乙酯，內(nèi)標(biāo)則選擇外環(huán)氧七氯。進(jìn)樣溶劑置換是因?yàn)橐宜嵋阴ケ纫译娓m合氣相色譜進(jìn)樣，且比乙腈有更穩(wěn)定的回收率和重現(xiàn)性[17]。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

通過對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的全掃描，借助美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院 (NIST) 標(biāo)準(zhǔn)庫匹配檢索得到待測物的保留時間和特征碎片離子，優(yōu)化碰撞能量，選擇合適的定量和定性離子對，采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式 (dMRM) 進(jìn)行定量。為了保證定量準(zhǔn)確性和減少干擾，78 種農(nóng)藥和1 種內(nèi)標(biāo)的采集時間經(jīng)過優(yōu)化后，最低駐留時間確定為16 ms，避免了因采集點(diǎn)過少、峰形差導(dǎo)致的定量偏差。保留時間通過前期確定后，限定在前后0.2 min 范圍內(nèi)進(jìn)行采集。同時，對于部分由同分異構(gòu)體構(gòu)成的農(nóng)藥混合物，采用分別積分后，再進(jìn)行響應(yīng)加和的方式定量，如氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等。葡萄中78 種農(nóng)藥在dMRM 模式掃描下的總離子流圖見圖1。

圖1 78 種農(nóng)藥動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測總離子流色譜圖(0.01 mg/kg)Fig. 1 Total ions chromatograms of dMRM of 78 pesticides (0.01 mg/kg)

2.3 定量校準(zhǔn)方法的選擇

EN 15662 方法和GB 23200.113 方法均采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法參與定量，兩者的差異主要是內(nèi)標(biāo)加入階段不同，而這種差異會造成定量結(jié)果差異：EN 15662 方法在稱樣時加入內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)同待測物一起經(jīng)歷前處理過程，在一定程度上會補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)和回收率對結(jié)果的影響；而GB 23200.113 方法在進(jìn)樣前才加入內(nèi)標(biāo)，待測物能得到一定的基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償，但回收率得不到補(bǔ)償。需要注意的是，由于內(nèi)標(biāo)不可能與所有分析對象有著相同的基質(zhì)效應(yīng)和回收率，這種差異會導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)引起的補(bǔ)償不匹配，造成結(jié)果偏離[17]，因此外標(biāo)法也應(yīng)該被考量。因此，本研究制定了圖2 所示的4 種定量校準(zhǔn)方法，就4 種方法在實(shí)驗(yàn)室日常檢測準(zhǔn)確性方面進(jìn)行了方法學(xué)評價。

圖2 4 種定量校準(zhǔn)方法流程圖Fig. 2 Scheme for the four selected calibration methods for quantification

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液線性關(guān)系及定量限 根據(jù)國際食品法典委員會頒布的《CXG 90—2017 食品和飼料中農(nóng)藥殘留測定分析方法的性能標(biāo)準(zhǔn)指南》中的要求，在低濃度測定 (μg/kg 級別)時，建議采用加權(quán)線性回歸或者二次擬合函數(shù)，普通線性回歸的結(jié)果誤差較大[18-19]。這是由于曲線中農(nóng)藥濃度較高的點(diǎn)往往具有更大的權(quán)重，其產(chǎn)生的異方差導(dǎo)致普通最小二乘法不再是最合適的回歸模型。因此，本研究中4 種標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制均采用二次擬合函數(shù)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。目前國內(nèi)外法規(guī)的殘留限量要求中，農(nóng)藥在水果中的定量限通常不低于0.01 mg/kg，故選擇樣品中添加水平為0.01 mg/kg，得到的待測物信噪比均大于10，滿足定量限要求。

2.4.2 準(zhǔn)確度與精密度 向葡萄中添加0.01 mg/kg的78 種農(nóng)藥，按照1.2 節(jié)處理，每個水平重復(fù)6 次。經(jīng)4 種校準(zhǔn)方法定量，78 種目標(biāo)化合物的平均回收率分別為81%～110% (校準(zhǔn)方法1)，82% ～114% (校準(zhǔn)方法2)，56% ～ 95% (校準(zhǔn)方法3) 和47% ～87% (校準(zhǔn)方法4)。平均回收率低于60%的數(shù)據(jù)包括：校準(zhǔn)方法3 中的氟胺氰菊酯，校準(zhǔn)方法4 中的四氯硝基苯、硫環(huán)磷、亞胺硫磷、蠅毒磷、氯氰菊酯和氟胺氰菊酯。由于上述農(nóng)藥回收率過低，相應(yīng)的數(shù)據(jù)已經(jīng)失去了用于精密度統(tǒng)計(jì)的價值。除上述農(nóng)藥外，4 種校準(zhǔn)方法中其他農(nóng)藥的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在20%以內(nèi)，由圖3 可知，校準(zhǔn)方法1 和2 的回收率普遍要高于校準(zhǔn)方法3 和4 的，同時校準(zhǔn)方法1 采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校準(zhǔn)后，定量結(jié)果相對于校準(zhǔn)方法2 更接近真值。而校準(zhǔn)方法3 和4 的定量結(jié)果在未經(jīng)回收率校準(zhǔn)的情況下明顯偏低。根據(jù)中國GB/T 27404 中實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范的要求，當(dāng)添加水平為0.01 mg/kg時，回收率范圍為60%～120%，RSD 小于21%[20]。78 種農(nóng)藥在校準(zhǔn)方法1 和2 中的回收率和精密度均滿足要求。

圖3 78 種農(nóng)藥在4 種定量校準(zhǔn)方法下的回收率Fig. 3 Recoveries of 78 pesticides using four calibration methods for quantification

由圖3 可知，對于大多數(shù)農(nóng)藥來說，同是內(nèi)標(biāo)法的校準(zhǔn)方法1 和3，以及同是外標(biāo)法的校準(zhǔn)方法2 和4，其回收率均有一定差值，說明在樣品前處理初期加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后，在前處理過程中產(chǎn)生的損失已經(jīng)體現(xiàn)在校準(zhǔn)方法1 和2 的校準(zhǔn)曲線中，最后的校準(zhǔn)結(jié)果等同于經(jīng)過回收率校正的結(jié)果。理論上，校準(zhǔn)方法3 和4 通過回收率校正依然能夠獲得接近真值的結(jié)果，但在實(shí)際樣品測試中，當(dāng)方法滿足回收率和精密度的要求時，回收率校正是不必要的[21]。因此，在本研究的實(shí)例中，使用校準(zhǔn)方法3 和4 得到的結(jié)果與真值有一定偏離，在判定檢出限或定量限等方面，直接測得的結(jié)果容易導(dǎo)致假陰性。并且，在校準(zhǔn)方法3 和4 中，個別農(nóng)藥的回收率低于60%，已經(jīng)不能滿足檢測需求了，如果不改變校準(zhǔn)方法，這部分農(nóng)藥需要通過改變前處理方法或進(jìn)樣方法進(jìn)行檢測，才能獲得滿意的檢測結(jié)果。

在方法回收率偏低的情況下，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)的結(jié)果更理想。這是由于目標(biāo)化合物添加在空白基質(zhì)樣品中經(jīng)歷了同樣品一樣的前處理過程，待測物的損失和受基質(zhì)影響同樣品一致，表現(xiàn)在定量結(jié)果上得以補(bǔ)償。需要注意的是，采用內(nèi)標(biāo)法校準(zhǔn)時，與內(nèi)標(biāo)物性質(zhì)差異較大的化合物的定量結(jié)果也將產(chǎn)生偏差[11]，如速滅磷、四氯硝基苯和樂果采用校準(zhǔn)方法1 所得的回收率低于校準(zhǔn)方法2，此情況下可以選擇加入更合適的內(nèi)標(biāo)物對其進(jìn)行單獨(dú)校準(zhǔn)，比如相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物。同時，還需注意基質(zhì)差異，盡可能選擇理化性質(zhì)相同或相近的基質(zhì)，避免因基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致定量結(jié)果差異。

3 結(jié)論

由于食品中農(nóng)藥多殘留分析需要考慮所有待測化合物的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)以及基質(zhì)的差異，因此選擇合適的定量方法以獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)尤為重要。日常農(nóng)藥多殘留檢測往往不具備對單一農(nóng)藥或單一基質(zhì)進(jìn)行有針對性檢測的條件，因此在痕量濃度上提高檢測準(zhǔn)確度，才能避免假陽性或假陰性的結(jié)果。從本研究結(jié)果可以看出，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)法能夠有效補(bǔ)償樣品分析過程中產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)和回收率差異，運(yùn)用目前已有的成熟方法，結(jié)合GC-MS/MS 在一次進(jìn)樣中即可完成葡萄中78 種農(nóng)藥的分析，獲得滿意的結(jié)果，適合作為實(shí)驗(yàn)室日常分析的定量方法進(jìn)行推廣。