王全勝, 張 亮, 付 巖, 凌淑萍, 吳銀良

(寧波市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，浙江 寧波 315040)

噻唑類衍生物是一類重要的化合物，在醫(yī)藥和生物領(lǐng)域都有著極其廣泛的應(yīng)用。其中，噻二唑類衍生物具有較好的生物活性，研發(fā)了一系列噻二唑類農(nóng)藥[1]。常見的有噻唑鋅 (式1a)、噻菌銅(式1b) 和噻森銅 (式1c) ，其作用機理均為通過噻唑基團(tuán)與金屬離子的協(xié)同作用殺死病原菌。目前，這3 種農(nóng)藥在芋頭、獼猴桃、鐵皮石斛等近30 種作物上登記，用于防治軟腐病、白粉病等病害[2]。中國尚未規(guī)定噻森銅的最大殘留限量 (MRL) ，但已規(guī)定噻菌銅和噻唑鋅在部分作物上的MRL 值(如噻唑鋅在柑、橘、橙上的MRL 和噻菌銅在番茄上的MRL 均為0.5 mg/kg)[3]，且二者均以2-氨基-5-巰基-1,3,4-噻二唑(AMT，式1d)為待測殘留物。為有效監(jiān)控噻二唑類農(nóng)藥的殘留風(fēng)險，開發(fā)高效、普適、可靠的殘留分析方法不可或缺。

圖式 1 噻唑鋅(a)、噻菌銅(b)、噻森銅(c)和噻二唑(d)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Scheme 1 Chemical structure of thiazole zinc (a), thiediazole copper (b), thiosen copper (c) and AMT (d)

目前，有關(guān)噻唑鋅、噻菌銅和噻森銅的殘留分析方法研究相對較少，分析手段多為液相色譜法 (LC) ，偶有液相色譜-二極管陣列檢測器結(jié)合質(zhì)譜選擇離子監(jiān)測模式(SIM)檢測，尚未見超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的相關(guān)報道。當(dāng)前此3 種農(nóng)藥的前處理方法大同小異，基本原理均是先將其與硫化鈉溶液反應(yīng)轉(zhuǎn)化為噻二唑，再用乙腈提取、硫酸調(diào)節(jié)pH 值、乙酸乙酯液液分配凈化、濃縮后經(jīng)液相色譜檢測。趙華等[4]采用硫化鈉溶液分解、乙酸乙酯液液分配凈化、液相色譜分析，測定了噻唑鋅在水、土壤及獼猴桃中的殘留；毛江勝等[5]采用硫化鈉溶液分解、層析柱吸附、液相色譜分析，測定了噻菌銅在西瓜上的殘留；梁赤周[6]等采用硫化鈉溶液分解、乙酸乙酯液液分配凈化、液相色譜分析，測定了噻森銅在鐵皮石斛上的殘留。采用液相色譜檢測對樣品凈化要求較高且靈敏度相對較低，上述前處理過程則較為耗時，同時會產(chǎn)生硫化氫氣體并需要使用大量有機溶劑，方法的安全性、環(huán)保性和高效性均需進(jìn)一步提高。因此，本研究建立了用氫氧化鈉替代硫化鈉堿解、用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值、采用改良QuEChERS 法分析施用3 種噻二唑類農(nóng)藥后獼猴桃中噻二唑殘留的UPLC-MS/MS 方法。旨在為噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅的殘留風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支持，并對其他噻二唑類農(nóng)藥的分析方法開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

98.5%噻唑鋅(thiazole zinc, THIA)標(biāo)準(zhǔn)品，浙江新農(nóng)股份有限公司；95%噻菌銅(thiediazole copper, THIE)標(biāo)準(zhǔn)品，浙江龍灣化工有限公司；92%噻森銅(thiosen copper, THIO)標(biāo)準(zhǔn)品，浙江東風(fēng)化工有限公司；98.0% 噻二唑(2-amino-5-mercapto-1,3,4-thiadiazole，AMT)標(biāo)準(zhǔn)品，德國CNW 公司；色譜純乙腈，德國Merk 公司；分析純硫化鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、硫酸、鹽酸和乙酸，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PSA(40 ～ 63 μm)，上海安譜公司；C18(50 μm)，北京艾杰爾公司；石墨化碳黑(GCB)，美國Agilent 公司。

Xevo TQ-S 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)，配備Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm)，美國Waters 公司；KS4000ic 恒溫振蕩器及GENIUS3 旋渦混合器，德國IKA 公司；3K15 高速離心機，德國Sigma 公司。

供試獼猴桃Actinidia chinensisPlanch 品種為紅陽。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取與凈化 稱取5.00 g 樣品于50 mL離心管中，加入25.0 mL 0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，于350 r/min、40 ℃下振蕩20 min 后，用1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至2 ～ 3，加入20.0 mL乙腈繼續(xù)振蕩提取15 min，加入8 g 氯化鈉后劇烈振蕩1 min 后，以9500 r/min 離心3 min。吸取1.0 mL 上清液于裝有50 mg C18和50 mg GCB 的塑料離心管中，漩渦振搖1 min 后再于9500 r/min下離心3 min。吸取0.50 mL 上清液，于室溫下用氮氣吹至近干，用V(乙腈) :V(0.1%乙酸溶液) =1 : 9 定容至1.0 mL，過0.22 μm 濾膜后供UPLCMS/MS 測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅和噻二唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取10 mg (精確至0.01 mg) 4 種供試標(biāo)準(zhǔn)品于4 個25.00 mL 容量瓶中，前三者用體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液溶解并分別定容，噻二唑用乙腈溶解并定容至25.00 mL，超聲混勻得到4 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅和噻二唑標(biāo)準(zhǔn)中間液：用體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液分別稀釋噻唑鋅、噻菌銅和噻森銅標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成質(zhì)量濃度為0.04、0.2、0.4、2、4、20 和50 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)中間液。用乙腈稀釋噻二唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制質(zhì)量濃度為1、10 和50 mg/L 的噻二唑系列標(biāo)準(zhǔn)中間液。

噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅和噻二唑基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取1.0 mL 質(zhì)量濃度為0.04、0.2、0.4、2、4 和20 mg/L 的噻唑鋅系列標(biāo)準(zhǔn)中間液于6 個50 mL 離心管中，各加入5.0 mL 純水混勻，按1.2.1 節(jié)樣品提取凈化步驟處理，進(jìn)行至氮氣吹干步驟后，用空白樣品定容后的溶液定容至1.0 mL，分別得到質(zhì)量濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 和0.5 mg/L 的噻唑鋅或噻菌銅、噻森銅系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。另直接用該定容溶液梯度稀釋，配制相同質(zhì)量濃度的噻二唑系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 檢測條件 色譜條件：流動相A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù)) 乙酸溶液，B 相為乙腈，流速為0.25 mL/min，梯度洗脫：0 ～ 0.5 min，90% A；>0.5 ～1 min，A 相漸變至20%；>1 ～ 3 min，20% A；>3 ～3.1 min，A 相漸變至90%；3.1 ～ 5 min，90% A。色譜柱柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為10.0 μL。

質(zhì)譜條件：檢測噻唑鋅、噻菌銅和噻森銅轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物噻二唑。采用電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+) ，多重反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 模式 (表1) ，毛細(xì)管電壓為2.50 kV，霧化氣流速為1000 L/h，錐孔氣流速為50 L/h，離子源溫度為150 ℃；霧化氣溫度為500 ℃。

表1 多重反應(yīng)監(jiān)測條件Table 1 Condition of MRM

1.3 數(shù)據(jù)處理

基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。對于含某一特定已知化合物的樣品，根據(jù)文獻(xiàn)[4]及本試驗驗證，噻二唑類農(nóng)藥質(zhì)量濃度與其轉(zhuǎn)化后的噻二唑質(zhì)量濃度間呈良好的線性關(guān)系，故可基于該已知噻二唑類農(nóng)藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液直接計算其殘留量 (以母體化合物表示) ；對于含混合 (或未知) 化合物的樣品，需基于噻二唑基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液計算殘留量，此時殘留量為噻二唑類農(nóng)藥總殘留量 (以噻二唑表示) ，可按公式 (1) 計算。

其中，w為樣品中待測物的殘留量，mg/kg；ρ為標(biāo)樣中待測物的質(zhì)量濃度，mg/L；V1、V2和V3分別為提取體積、分取體積和定容體積，mL；V4、V5分別為標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的進(jìn)樣體積，μL；A、A1分別為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中待測物的峰面積；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

由于噻唑鋅、噻菌銅和噻森銅在水及各類常見溶劑中溶解度極小，無法直接檢測，因此本研究先將其轉(zhuǎn)化為噻二唑再進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)方法不同的是本研究采用氫氧化鈉溶液進(jìn)行堿解、鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值。

雖然轉(zhuǎn)化率的高低并不影響分析方法的建立[4]，但轉(zhuǎn)化生成的噻二唑的絕對量會影響方法檢出限，因此本研究選取質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 的噻二唑類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，對其轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明 (圖1) ：不同氫氧化鈉濃度 (0.1、0.25和0.5 mol/L) 下噻唑鋅、噻菌銅和噻森銅生成噻二唑的轉(zhuǎn)化率有所不同，在0.1 mol/L 下轉(zhuǎn)化率最高，平均轉(zhuǎn)化率分別為55%、42%和37%。相同氫氧化鈉濃度、不同體積 (10、20 和30 mL) 下，30 mL 時轉(zhuǎn)化率略高，但考慮到實際操作的方便性和節(jié)約原則，最終體積定為25 mL。此外，對堿解反應(yīng)的溫度 (30、40 和50 ℃) 和反應(yīng)時間(20、30 和40 min) 進(jìn)行研究的結(jié)果表明，30 ℃下轉(zhuǎn)化率相對較低，40、50 ℃下轉(zhuǎn)化率差別較小，而反應(yīng)時間的延長并未明顯提高轉(zhuǎn)化率，故最終確定于40 ℃下反應(yīng)20 min。此外，雖然同步進(jìn)行的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法[4](硫化鈉反應(yīng)) 下噻唑鋅、噻菌銅和噻森銅的轉(zhuǎn)化率 (46%、60%和75%) 較本研究方法的轉(zhuǎn)化率 (39%、48%和60%) 高10%左右，但由于本研究采用的UPLC-MS/MS 檢測具有更高的靈敏度，因此可以保證在低轉(zhuǎn)化率下仍可進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。

圖1 不同反應(yīng)條件下噻二唑類農(nóng)藥的轉(zhuǎn)化率 (n = 3)Fig. 1 Reaction conversion of THIA, THIE and THIO under different reaction conditions (n = 3)

研究中還發(fā)現(xiàn)，相同條件下，噻森銅、噻菌銅和噻唑鋅的轉(zhuǎn)化率分別為39%、48%和60%，呈現(xiàn)依次增大的趨勢。陳實等[7]研究表明，銅與大環(huán)配體在溶液中的配位穩(wěn)定性高于相應(yīng)鋅離子的配位穩(wěn)定性，據(jù)此推測噻菌銅較噻唑鋅可能更加穩(wěn)定，而由于噻森銅形成了相對更穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此噻森銅的穩(wěn)定性最大。這可能是噻森銅、噻菌銅和噻唑鋅轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)依次增大趨勢的原因之一。

2.2 樣品提取與凈化條件的優(yōu)化

對轉(zhuǎn)化后噻二唑的提取凈化條件進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：不同乙腈提取體積 (15、20、25 和30 mL) 和不同振蕩時間 (15、25 和35 min) 下的提取回收率均高于80%，綜合考慮后確定提取體積為20 mL、振蕩時間為15 min。對凈化吸附劑種類 (PSA、C18和GCB) 及用量 (50、100、150、200 和250 mg)進(jìn)行研究的結(jié)果表明 (圖2) ：PSA 凈化后回收率明顯降低，C18凈化對回收率的影響較小，而當(dāng)GCB 用量增大時，回收率也會明顯降低，因此最終確定使用50 mg C18和50 mg GCB 進(jìn)行凈化。

圖2 不同凈化吸附劑對獼猴桃中噻二唑回收率的影響 (n=3)Fig. 2 Effect of different amounts of cleanup sorbents on the recoveries of AMT in kiwi fruit (n=3)

與傳統(tǒng)方法[4]相比，本方法單個樣品的分析時間節(jié)約65%以上，大大縮短了樣品分析時間，提高了分析效率。同時，本研究前處理過程中僅產(chǎn)生了可用于后續(xù)鹽析分層的氯化鈉，無有毒硫化氫氣體的產(chǎn)生且不需要使用大量乙酸乙酯凈化，這使得方法更加安全、節(jié)約、環(huán)保。

2.3 方法線性關(guān)系

分別研究了噻二唑在ESI+和ESI?下的碎裂情況，結(jié)果表明，噻二唑在ESI+下質(zhì)核比 (m/z) 為43.2 和75.2 的兩個離子碎片響應(yīng)較高，進(jìn)一步對儀器毛細(xì)管電壓、錐孔電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使離子響應(yīng)達(dá)到最高。分別對乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%乙酸溶液流動相體系進(jìn)行了研究，噻二唑在后者體系下峰形尖銳、響應(yīng)更高。與已知文獻(xiàn)中的液相色譜分析相比，UPLC-MS/MS 檢測不但降低了樣品前處理中對凈化效果的要求、縮短了樣品檢測時間，而且檢測靈敏度得到進(jìn)一步提升。

噻二唑類農(nóng)藥均含有易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的-NH-基團(tuán)[8]，對其在獼猴桃中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅和噻二唑在獼猴桃基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng) (Me，以基質(zhì)標(biāo)曲斜率與溶劑標(biāo)曲斜率之比表示)[9]為0.5 ～ 0.7，Me<0.9 表明存在較明顯的基質(zhì)效應(yīng)，故采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。對1.2.2 節(jié)中配制的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣檢測，結(jié)果表明：在0.001 ～ 0.5 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度與響應(yīng)值間均呈良好的線性關(guān)系 (表2) 。

表2 噻二唑類農(nóng)藥在獼猴桃中的線性回歸方程(0.001～0.5 mg/L)Table 2 The linear equations of thiadiazole derived pesticides in kiwi fruit (0.001-0.5 mg/L)

2.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度

分別向空白獼猴桃樣品中添加噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅和噻二唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平均為0.01、0.1 和1 mg/kg，每個水平重復(fù)5 次，共重復(fù)3 個批次。結(jié)果表明，在0.01 ～ 1 mg/kg 添加水平下，噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅和噻二唑在獼猴桃中的平均回收率分別為82% ～ 92%、82% ～ 93%、81% ～ 91% 和85% ～ 91%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 分別為1.1% ～ 9.3%、2.2% ～ 8.1%、1.0% ～8.8%和2.5% ～ 7.5%，批間RSD 分別為3.9% ～7.5%、4.8% ～ 6.2%、4.1% ～ 6.1%和4.3% ～ 6.0%，方法定量限均為0.01 mg/kg。結(jié)果滿足農(nóng)藥殘留分析要求[10]，且靈敏度較現(xiàn)有文獻(xiàn)方法[11-13]更高。譜圖及回收率結(jié)果分別如圖3、圖4 所示。

圖3 噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅和噻二唑在獼猴桃中的添加回收試驗MRM 譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of THIA, THIE, THIO and AMT in recovery tests in kiwi fruit

圖4 噻唑鋅、噻菌銅、噻森銅和噻二唑在獼猴桃中的添加回收率 (n=15)Fig. 4 Recoveries of THIA, THIE, THIO and AMT in kiwi fruit (n=15)

2.5 方法應(yīng)用

為驗證該分析方法的實際應(yīng)用效果及可靠性，分別以本研究方法和文獻(xiàn)中的傳統(tǒng)方法[4](即采用0.1 mol/L 硫化鈉溶液反應(yīng)、乙腈提取、硫酸溶液調(diào)節(jié)pH 值、乙酸乙酯液液萃取) 對采集的獼猴桃試驗樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：兩種方法測得的噻二唑類農(nóng)藥在獼猴桃上的殘留量 (以噻二唑表示) 分別為0.23 mg/kg 和0.28 mg/kg，檢測結(jié)果較為一致，表明方法可靠。

3 結(jié)論

通過對儀器檢測條件、轉(zhuǎn)化條件和提取凈化方法的優(yōu)化，建立了獼猴桃上施用噻唑鋅、噻菌銅和噻森銅3 種噻二唑類農(nóng)藥后噻二唑殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品經(jīng)氫氧化鈉堿解反應(yīng)、鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值、QuEChERS法提取凈化即可滿足分析要求，在0.01 ～ 1 mg/kg添加范圍內(nèi)，在獼猴桃中的平均回收率81% ～93%，RSD 最大為9.3%。方法高效、安全、環(huán)保、普適，可滿足其殘留風(fēng)險監(jiān)控的需要。