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QCR2調(diào)控p53泛素化對(duì)SiHa細(xì)胞株的周期阻滯作用

2022-02-22 08:47程海玲曹芹雪霍會(huì)蠶
關(guān)鍵詞:泛素細(xì)胞周期試劑盒

程海玲,王 寧,曹芹雪,霍會(huì)蠶,王 琛

宮頸癌是婦科惡性腫瘤致死的重要原因。每年約1/3的新發(fā)病例發(fā)生在我國,且發(fā)病率逐年升高[1]。既往研究[2-3]顯示,腫瘤細(xì)胞中線粒體數(shù)量多于正常細(xì)胞,且線粒體復(fù)合物一、三抑制劑可抑制腫瘤生長,推測腫瘤細(xì)胞中線粒體功能活躍。該課題組根據(jù)組蛋白去乙?;敢种苿?trichostatin a,TSA)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡具有特異性誘導(dǎo)作用的原理,篩選出凋亡相關(guān)基因泛醇-細(xì)胞色素C還原酶亞基2(ubiquinol-cytochrome C reductase subunit 2,QCR2),且發(fā)現(xiàn)其異常高表達(dá)于宮頸癌組織,推測QCR2作為致癌基因參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展。該研究通過構(gòu)建沉默QCR2的宮頸癌SiHa細(xì)胞株,研究其對(duì)該細(xì)胞的周期阻滯作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞宮頸癌SiHa細(xì)胞株購于上海江林生物科技有限公司。培養(yǎng)條件:含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基,標(biāo)準(zhǔn)條件(37 ℃,5% CO2)培養(yǎng)箱。

1.2 藥物、主要試劑和儀器攜帶綠色熒光蛋白的QCR2 siRNA(上游:5′-AUGACUGCCGCAUGUUACG CACAC-3′,下游:5′-UGCACAGCUGUGCACGCUAC GUGC-3′)、QCR2 siRNA2(上游:5′-UGCAGCGUG CGUGCACGCGUGACG-3′,下游:5′-UGCACGCUGCA CUAGUGGCUGCAC-3′)、control siRNA質(zhì)粒(深圳默賽爾生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司);LipofectamineTM3000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(美國Sigma公司);QCR2、p53一抗(美國Santa Cruz公司);碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);泛素-蛋白酶體抑制劑PS341(美國Thermo Fisher Scientific公司);Pierce Crosslink IP kit試劑盒(上海北諾生物科技有限公司)。DMI4000B型熒光顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司);FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)期SiHa細(xì)胞,胰蛋白酶消化,接種于24孔板,細(xì)胞融合度達(dá)75%時(shí),更換成雙抗完全培養(yǎng)基。嚴(yán)格按照LipofectamineTM3000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染說明書操作,LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑5 μl加至Opti-MEM無血清培養(yǎng)基100 μl中(A液),待轉(zhuǎn)質(zhì)粒(QCR2 siRNA1、QCR2 siRNA2、control siRNA)各5 μl加至Opti-MEM無血清培養(yǎng)基100 μl中(B液),A液與B液混合,室溫孵育5 min。孵育期間,每個(gè)孔板更換為新鮮培養(yǎng)基1.8 ml,孵育完成后每孔加入混合液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,篩選有效siRNA。將轉(zhuǎn)染有效siRNA、control siRNA質(zhì)粒的細(xì)胞分別設(shè)為QCR2 siRNA組、control siRNA組,未經(jīng)處理的SiHa細(xì)胞設(shè)為空白組,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。熒光顯微鏡下觀察,發(fā)出明亮的綠色熒光者為陽性細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.2qRT-PCR、Western blot檢測QCR2 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量 取空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組細(xì)胞,加入TRIzol 1 ml,經(jīng)濃度、純度檢測后逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,鑒定后對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行設(shè)置,重復(fù)40次,72 ℃延伸5 min。以GAPDH為內(nèi)參基因,2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。QCR2上游引物序列:5′-TGCACGCATAGCAGGCACGTGCAC-3′,下游引物序列:5′-GTACGTGTGACAGTCGTACAACGC-3′;GAPDH上游引物序列:5′-GTGACCGTGAATTCACCGCACGCT-3′,下游引物序列:5′-TGACACGACGTGCACACAGTCGTG-3′。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

取空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組細(xì)胞,PBS洗滌,RIPA細(xì)胞裂解液裂解,離心收集沉淀,BCA試劑盒定量。取40 μg樣品混合上樣緩沖液,100 ℃水浴5 min,10 000 r/min離心15 min,收集上清液,恒壓下分離,濕法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉常溫封閉2 h,加入QCR2一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBTS漂洗,加入山羊抗兔IgG二抗(1 ∶8 000)常溫孵育2 h,TBTS漂洗。暗室顯影,F(xiàn)luor Chem FC2成像系統(tǒng)掃描、分析,以QCR2/GAPDH灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3PI染色檢測細(xì)胞周期 取空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組細(xì)胞,至融合度80%左右時(shí)胰蛋白酶消化,培養(yǎng)基終止消化,輕吹細(xì)胞,移至15 ml離心管,4 ℃,2 500 r/min離心5 min;預(yù)冷PBS沖洗,同條件離心5 min;100 μl PBS重懸,加入1 ml 70%預(yù)冷乙醇,混合均勻;4 ℃固定12 h,2 500 r/min,半徑12 cm離心5 min,預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞;加入PI染液(RNaseA 10 μl,染色緩沖液0.5 ml,PI染液25 μl),遮光冰浴30 min;300細(xì)胞濾網(wǎng)過濾,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.4qRT-PCR、Western blot檢測p53 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量 取QCR2 siRNA組細(xì)胞,用生理鹽水(normal saline,NS)溶液溶解泛素-蛋白酶體抑制劑PS341,以終濃度50 nmol/L干預(yù)QCR2 siRNA組細(xì)胞4 h,設(shè)為QCR2 siRNA+PS341組,另取QCR2 siRNA組細(xì)胞以等量NS干預(yù)4 h,設(shè)為QCR2 siRNA+NS組。

qRT-PCR分別檢測空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量。操作同1.3.2, p53上游引物序列:5′-TGCGCGCAACTGCAC GCGTGCACGC-3′,下游引物序列:5′-CGTACGCTGCACGCTAGCTGCACGC-3′;GAPDH上游引物序列:5′-GTCGAAAACCACACTGCACCGCGTC-3′,下游引物序列:5′-GTCAACGGGTTTGCACGCTGCAACT-3′。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

Western blot檢測空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組,空白組、QCR2 siRNA組、QCR2 siRNA+NS組、QCR2 siRNA+PS341組p53蛋白相對(duì)表達(dá)量。操作同1.3.2,封閉液封閉后加入p53一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBTS漂洗,加入山羊抗兔IgG二抗(1 ∶8 000)常溫孵育2 h,TBTS漂洗。暗室顯影,F(xiàn)luor Chem FC2成像系統(tǒng)掃描、分析,以p53灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測p53泛素化水平 取空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組細(xì)胞,按照Pierce Crosslink IP kit試劑盒說明書要求操作。于NP-40裂解緩沖液中裂解,10 000 r/min離心15 min轉(zhuǎn)移上清液至新離心管。Protein A/G瓊脂糖珠經(jīng)PBS洗滌2次后制成50% Protein A/G瓊脂糖珠工作液。振蕩器4 ℃振蕩10 min以避免非特異性結(jié)合蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。10 000 r/min離心15 min轉(zhuǎn)移上清液至新離心管,棄去Protein A/G瓊脂糖珠,加入QCR2、p53一抗至總體積500 μl。振蕩器4 ℃緩慢振蕩過夜,離心收集免疫沉淀產(chǎn)物,PBS洗滌。加入上樣緩沖液15 μl,沸水浴5 min行Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率觀察轉(zhuǎn)染48 h,熒光顯微鏡下觀察,QCR2 siRNA1的轉(zhuǎn)染效率大于QCR2 siRNA2,將其作為有效siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率 ×200

2.2 QCR2 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量比較與空白組、control siRNA組比較,QCR2 siRNA組mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 qRT-PCR、Western blot檢測QCR2表達(dá)與空白組比較:**P<0.01;與control siRNA組比較:##P<0.01

2.3 各組細(xì)胞周期分布對(duì)比與空白組、control siRNA組比較,QCR2 siRNA組G0/G1占比升高(P<0.01),S、G2/M占比降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞周期分布情況A:各組細(xì)胞周期流式圖;B:各組細(xì)胞周期柱狀圖;與空白組比較:**P<0.01;與control siRNA組比較:##P<0.01

2.4 各組p53 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與空白組、control siRNA組比較,QCR2 siRNA組p53蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 qRT-PCR、Western blot檢測QCR2表達(dá)與空白組比較:**P<0.01;與control siRNA組比較:##P<0.01

2.5 各組p53蛋白相對(duì)表達(dá)量比較空白組、QCR2 siRNA組、QCR2 siRNA+NS組、QCR2 siRNA+PS341組p53蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.21±0.03)、(0.82±0.09)、(0.80±0.10)、(0.24±0.04),與空白組、QCR2 siRNA+PS341組比較,QCR2 siRNA組、QCR2 siRNA+NS組p53蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 Western blot檢測p53蛋白表達(dá)A:空白組:B:QCR2 siRNA組;C:QCR2 siRNA+NS組;D:QCR2 siRNA+PS341組

2.6 各組p53泛素化程度比較空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組p53泛素化程度分別為(70.58±8.54)%、(71.03±8.62)%、(20.27±4.15)%,與空白組、control siRNA組比較,QCR2 siRNA組p53泛素化程度降低(t=11.848,P<0.001;t=11.864,P<0.001)。見圖6。

圖6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測p53泛素化水平1:空白組; 2:control siRNA組; 3:QCR2 siRNA組

3 討論

宮頸癌是婦科高發(fā)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,目前臨床關(guān)于其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,多認(rèn)為與細(xì)胞周期調(diào)控異常、ATM信號(hào)通路被激活、3q區(qū)域擴(kuò)增、內(nèi)切酶活性增強(qiáng)等有關(guān)[4-5]。由于該病早期無明顯及特異性癥狀,多數(shù)患者早期難以確診,僅能采取放化療為主的姑息治療方式,但治療靶向性不足,且具有較強(qiáng)的神經(jīng)、肝腎毒性,預(yù)后不良[6]。隨著對(duì)宮頸癌分子機(jī)制研究的逐步深入,基因靶向干預(yù)為該病治療提供了新的方向。

研究[7-8]證實(shí),細(xì)胞周期調(diào)控基因突變是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。該研究結(jié)果中,與空白組、control siRNA組比較,QCR2 siRNA組QCR2 mRNA與蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞周期G0/G1占比升高,提示沉默QCR2可將宮頸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期,從而抑制腫瘤。Abbaszadeh et al[9]研究認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞中無氧糖酵解途徑增強(qiáng)的主要原因是線粒體氧化磷酸化水平提高,且伴隨相關(guān)蛋白表達(dá)的增加。QCR2是線粒體氧化磷酸化復(fù)合體三的重要組成蛋白,本課題組以其與腫瘤細(xì)胞凋亡具有相關(guān)性為線索,進(jìn)一步檢測其在多種腫瘤組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其普遍高表達(dá)于乳腺癌、宮頸癌、肺癌、食管癌等疾病中,且與部分臨床特征具有相關(guān)性,揭示其致癌作用,為進(jìn)一步研究其參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

p53是目前公認(rèn)的作用最廣泛、最重要的抑癌基因,恢復(fù)其表達(dá)及功能活性是治療腫瘤的重要思路[10-11]。調(diào)控p53蛋白可從轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白修飾等層面進(jìn)行,其中泛素化降解過程是最重要的調(diào)控方式。泛素化是一種對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過程,可調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡等多種進(jìn)程,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[12]。該研究結(jié)果顯示,與空白組、control siRNA組比較,QCR2 siRNA組p53 mRNA表達(dá)未發(fā)生明顯變化,蛋白表達(dá)升高,推測QCR2對(duì)p53具有調(diào)控作用,且該調(diào)控并非在轉(zhuǎn)錄水平,而是發(fā)生在蛋白水平,可能經(jīng)p53泛素-蛋白酶體降解途徑對(duì)其蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。為驗(yàn)證該推測,該研究在沉默宮頸癌細(xì)胞QCR2的同時(shí)加入泛素-蛋白酶體抑制劑PS341,結(jié)果顯示p53蛋白表達(dá)未發(fā)生變化,提示QCR2對(duì)p53蛋白表達(dá)的調(diào)控可能依賴于蛋白酶體。由于蛋白酶體是泛素化蛋白發(fā)生降解的主要場所,該研究進(jìn)一步檢測了沉默QCR2對(duì)p53泛素化水平的影響,顯示其泛素化水平降低。綜合以上結(jié)果,推測沉默QCR2可將宮頸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期,其作用機(jī)制與抑制p53泛素化,提高其蛋白表達(dá)有關(guān)。Han et al[13]研究顯示,QCR2在多種人類腫瘤中表達(dá)上調(diào),抑制其表達(dá)可通過激活p53信號(hào)傳導(dǎo)并誘導(dǎo)p21依賴性細(xì)胞周期阻滯和衰老來抑制癌細(xì)胞生長,該研究結(jié)果與其具有相似性。

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