王均華，付聞文，李由然，朱惠霖，徐沙，石貴陽(yáng)*，張梁，丁重陽(yáng)，顧正華

1(糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2 (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

近些年，釀酒酵母因?yàn)樽陨頁(yè)碛屑琢u戊酸代謝途徑，被廣泛應(yīng)用在萜類化合物合成的研究中[1-3]。在釀酒酵母中，甲羥戊酸途徑通過(guò)轉(zhuǎn)化前體胞質(zhì)乙酰輔酶A提供基本五碳單元異戊二烯基焦磷酸和二甲基丙烯焦磷酸去合成萜類化合物前體香葉基焦磷酸、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)和香葉基香葉基焦磷酸。通過(guò)過(guò)表達(dá)甲羥戊酸途徑關(guān)鍵限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR-CoA reductase，HMGR)編碼基因(HMG1和tHMG1)或者過(guò)表達(dá)甲羥戊酸途徑所有基因可以增強(qiáng)甲羥戊酸途徑代謝流，繼而提高萜類化合物的產(chǎn)量[4-6]。為了增強(qiáng)丙酮酸脫氫酶旁路途徑合成前體胞質(zhì)乙酰輔酶A的能力，通過(guò)缺損乙醇脫氫酶(ethanol dehydrogenase，ADH)編碼基因(ADH1,3,4,5,6)和甘油三磷酸脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPD)編碼基因(GPD1,2)可以減少副產(chǎn)物乙醇和甘油的合成，使更多的碳代謝流流向前體胞質(zhì)乙酰輔酶A的合成，提高釀酒酵母合成萜類化合物的能力[7-9]。同時(shí)，有報(bào)道通過(guò)缺損檸檬酸合酶(citrate synthase)(CIT2)和蘋果酸合酶(malate synthase)(MLS1)基因減少胞質(zhì)乙酰輔酶A流向其他細(xì)胞器[10-11]。此外，F(xiàn)PP下游途徑也受到眾多研究者的關(guān)注，通過(guò)啟動(dòng)子的替換可以降低甾醇合成途徑角鯊烯合酶(squalene synthase)(ERG9)的表達(dá)水平，或者通過(guò)Erg9P降解的方法去減少FPP流向支路甾醇合成途徑[12-15]。二?；视投姿崃姿崦?diacylglycerol pyrophosphate phosphatase)(DPP1)和脂磷酸磷酸酶(lipid phosphate phosphatase)(LPP1)基因主要負(fù)責(zé)類異戊二烯焦磷酸去磷酸化[16]，通過(guò)缺損DPP1和LPP1基因可以弱化FPP轉(zhuǎn)化合成法尼醇，繼而提高萜類化合物的產(chǎn)量[6, 17-18]。

法尼烯(C15H24)，包括α和β 2種倍型，是一種揮發(fā)性較強(qiáng)且不溶于水的油性物質(zhì)。有報(bào)道表明，法尼烯在植物中具有抵御害蟲的能力，在醫(yī)藥行業(yè)可以作為維生素E生產(chǎn)的前體，在能源行業(yè)可以作為石油的替代品[19]。盡管上面描述的代謝操作策略已經(jīng)被應(yīng)用于釀酒酵母合成萜類化合物的研究，但卻沒有將所有這些代謝操作策略在同一個(gè)宿主菌中進(jìn)行比較[20-21]。本研究以法尼烯為評(píng)價(jià)產(chǎn)物，利用基因代謝工程操作去構(gòu)建不同基因缺損法尼烯合成菌株(圖1)。首先，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的甲羥戊酸途徑強(qiáng)化菌株，通過(guò)染色體多拷貝整合法尼烯合成酶編碼基因增強(qiáng)FPP轉(zhuǎn)化合成法尼烯的能力。其次，評(píng)價(jià)缺損乙醇、甘油和法尼醇合成支路關(guān)鍵基因和胞質(zhì)乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)至其他細(xì)胞器關(guān)鍵基因?qū)Ψ嵯┖铣傻挠绊?。然后，評(píng)估缺損GAL相關(guān)基因?qū)AL啟動(dòng)子控制基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。最后，將獲得的有效基因缺損操作菌在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒信息詳見表1。本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基115 ℃滅菌20 min。LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，10%(體積分?jǐn)?shù))十二烷。固體培養(yǎng)基均加入20 g/L瓊脂粉。氨芐青霉素(ampicillin，Amp)添加終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌株的生長(zhǎng)和篩選。遺傳霉素(geneticin，G418)、潮霉素B(hygromycin，Hyg B)和硫酸諾爾斯菌素(nourseothricin sulfate，NTC)添加終質(zhì)量濃度分別為500、500、100 μg/mL，用于釀酒酵母轉(zhuǎn)化菌株的生長(zhǎng)和篩選。

圖1 釀酒酵母法尼烯合成途徑和關(guān)鍵支路Fig.1 The biosynthesis pathway and branches of farnesene production in Saccharomyces cerevisiae

表1 本實(shí)驗(yàn)涉及菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 引物

本研究所用引物見附件1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210518004)，所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)所用PrimeSTARDNA polymerase、pMD-19T simple vector、T4 DNA ligase、DNA marker、快速限制性內(nèi)切酶SacⅡ，大連TAKARA公司；其他快速限制性內(nèi)切酶，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；2×TaqPCR Master Mix，杭州寶賽公司；G418、Hyg B和NTC，上海生工公司；Amp、醋酸鋰、PEG3350、色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈、法尼烯標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC ≥ 90%)，美國(guó)Sigma公司；鮭魚精DNA，北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，蘇州AXYGEN公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID公司；十二烷，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

PCR基因擴(kuò)增儀和凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；小型高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；UV-2100型分光光度計(jì)，美國(guó)UNICO公司；超低溫冰箱，美國(guó)Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；5 L玻璃發(fā)酵罐，迪必爾生物工程上海有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 法尼烯合成酶多拷貝表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

法尼烯合成酶多拷貝表達(dá)質(zhì)粒具體構(gòu)建過(guò)程見附件2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210518004)。

1.2.2 缺損基因質(zhì)粒的構(gòu)建

缺損質(zhì)粒具體構(gòu)建過(guò)程見附件3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ& dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210518004)。

1.2.3 重組菌的篩選

本實(shí)驗(yàn)所有線性化的表達(dá)質(zhì)粒均通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法整合至釀酒酵母染色體。YPD固體培養(yǎng)基添加終質(zhì)量濃度500 μg/mL G418用于整合法尼烯合成酶編碼基因轉(zhuǎn)化子篩選；選擇固體培養(yǎng)基用于篩選氨基酸缺陷型標(biāo)記轉(zhuǎn)化子篩選。轉(zhuǎn)化平板放置于30 ℃培養(yǎng)箱，轉(zhuǎn)化子通過(guò)基因組PCR驗(yàn)證。

1.2.4 重組菌法尼烯合成搖瓶發(fā)酵

重組菌于YPD平板劃線，30 ℃培養(yǎng)箱活化2 d。挑單菌落接種于20 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)18 h。按照初始OD600=0.1轉(zhuǎn)接至30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)120 h。

1.2.5 補(bǔ)料分批發(fā)酵

重組菌于YPD平板劃線，30 ℃培養(yǎng)箱活化2 d。挑單菌落接種于20 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)18 h作為一級(jí)種子液。按照初始1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)18 h作為二級(jí)種子液。

補(bǔ)料分批發(fā)酵方法：發(fā)酵初始裝液量為2 L YPD培養(yǎng)基，十二烷20% (體積分?jǐn)?shù))，通氣量1 L/(L·min)，溫度30 ℃，添加氨水控制pH=5.5，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min。補(bǔ)料方式為連續(xù)補(bǔ)料，葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為600 g/L。

1.2.6 法尼烯HPLC檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)使用ThermoFisher UltiMate 3000高效液相色譜對(duì)α-法尼烯進(jìn)行含量測(cè)定。檢測(cè)條件：Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為232 nm，流動(dòng)相為90%甲醇、5%乙腈和5%超純水，流速為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃，樣品檢測(cè)時(shí)間為15 min。

1.2.7 發(fā)酵上清液HPLC檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜對(duì)乙醇和甘油進(jìn)行含量測(cè)定。檢測(cè)條件：示差檢測(cè)器，Shodex糖柱(SC-1011)，流動(dòng)相為5%稀硫酸溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫為50 ℃，樣品檢測(cè)時(shí)間為25 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組釀酒酵母菌株的構(gòu)建

2.1.1 多拷貝法尼烯合成酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用酶切連接的方法獲得Fsso基因多拷貝表達(dá)質(zhì)粒Ts-rso (圖2-A)。質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析如圖2-B所示。SacⅡ單酶切質(zhì)粒Ts-rso，在5.95 kpb和2.71 kbp位置有2條帶(泳道1)；XbaⅠ單酶切質(zhì)粒Ts-rso，在4.69 kpb和3.97 kbp位置有2條帶(泳道2)；NheⅠ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒Ts-rso，在1.71 kpb和6.96 kbp位置有2條帶(泳道3)。將質(zhì)粒Ts-rso送至上海生工測(cè)序，序列無(wú)堿基突變。說(shuō)明質(zhì)粒Ts-rso構(gòu)建成功。

2.1.2 基因缺損質(zhì)粒的構(gòu)建

利用引物605-YAN-U和605-YAN-D菌落PCR篩選(圖2-C，目的條帶605 bp)獲得質(zhì)粒BTS-ADH3、BTS-ADH4、BTS-ADH5、BTS-ADH6、BTS-GPD1、BTS-GPD2、BTS-GAL1、BTS-GAL7、BTS-GAL10、BTS-CIT2、BTS-MLS1、BTS-BTS1、BTS-LPP1和BTS-DPP1送至上海生工測(cè)序，質(zhì)粒序列無(wú)堿基突變。說(shuō)明上述所有質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A-質(zhì)粒Ts-rso物理圖譜；B-質(zhì)粒Ts-rso酶切驗(yàn)證；C-菌落PCR驗(yàn)證圖2 質(zhì)粒Ts-rso的構(gòu)建和BTS系列質(zhì)粒菌落PCR篩選Fig.2 The physic map and verification of plasmid Ts-rso and colony PCR

2.1.3 正確轉(zhuǎn)化子的篩選

將質(zhì)粒Ts-rso (限制性內(nèi)切酶SacⅡ消化)的線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化釀酒酵母WHE，在G418抗性YPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子，提取基因組，用引物Fsso-YAN-U和Fsso-YAN-D進(jìn)行PCR確認(rèn)(圖3-A)，得到大小為1 700 bp左右的條帶，說(shuō)明在rDNA位點(diǎn)成功整合Fsso基因，獲得菌株WHE4。

將質(zhì)粒pHcas9分別與質(zhì)粒BTS-ADH3、BTS-ADH4、BTS-ADH5、BTS-ADH6、BTS-GPD1、BTS-GPD2、BTS-GAL1、BTS-GAL7、BTS-GAL10、BTS-CIT2、BTS-MLS1、BTS-BTS1、BTS-LPP1和BTS-DPP1轉(zhuǎn)化釀酒酵母WHE4，在HygB和NTC抗性YPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子，提取基因組，用基因開放閱讀框之外的引物(見表中驗(yàn)證用引物)進(jìn)行PCR確認(rèn)(圖3-B～圖3-G)，獲得不同組合基因缺失菌株WHE4-10、WHE4-13、WHE4-14、WHE4-15、WHE4-21、WHE4-31、WHE4-32和WHE4-33。

A-Fsso基因整合確認(rèn)；B-ADH3、4、5、6基因缺損確認(rèn)；C-GPD1基因缺損確認(rèn)；D-GPD2基因缺損確認(rèn)；E-GAL1、7、10基因缺損確認(rèn)；F-CIT2和MLS1基因缺損確認(rèn)；G-BTS1、DPP1和LPP1基因缺損確認(rèn)圖3 基因整合和缺損確認(rèn)Fig.3 PCR verification of integration and deletion

2.2 不同重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.2.1 多拷貝整合法尼烯合成酶菌株的發(fā)酵

隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化平板上47個(gè)轉(zhuǎn)化子，在30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并測(cè)定法尼烯的產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出不同轉(zhuǎn)化子法尼烯的產(chǎn)量在235 mg/L左右，選擇菌株WHE4(法尼烯產(chǎn)量為253.24 mg/L)作為接下來(lái)研究的出發(fā)菌。

圖4 法尼烯合成基因整合菌株法尼烯產(chǎn)量Fig.4 Farnesene production of engineered strains integrated with Fsso

2.2.2 乙醇和甘油積累量的比較

將重組菌WHE4-10、WHE4-14和WHE4-15與WHE4在50 mL YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并測(cè)定乙醇和甘油的積累量和OD600，結(jié)果如圖5所示，條件1和條件2分別為普通250 mL搖瓶和250 mL擋板搖瓶。菌株WHE4、WHE4-10、WHE4-14和WHE4-15在普通搖瓶中乙醇的最高積累量為8.64、8.77、8.69、8.96 g/L，在擋板搖瓶中乙醇的最高積累量為8.25、8.29、8.36、8.22 g/L，ADH3，ADH4，ADH5和ADH6基因的缺損未能減少乙醇的積累，使用擋板搖瓶進(jìn)行發(fā)酵可以減少乙醇的合成(圖5-A)。菌株WHE4、WHE4-10、WHE4-14和WHE4-15在普通搖瓶中甘油的最高積累量為0.99、0.91、0.85、0.66 g/L，在擋板搖瓶中甘油的最高積累量為1.07、0.98、0.92、0.72 g/L，GPD1和GPD2基因的單缺損可以減少甘油的積累，使用擋板搖瓶進(jìn)行發(fā)酵導(dǎo)致甘油的量上升(圖5-B)。菌株WHE4、WHE4-10、WHE4-14和WHE4-15在普通搖瓶中最高OD600值為5.15、5.14、5.05和5.47，在擋板搖瓶中最高OD600值為5.36、5.35、5.19和5.55，缺損GPD1、GPD2、ADH3、ADH4、ADH5和ADH6基因?qū)w的生長(zhǎng)幾乎沒有影響，使用擋板搖瓶進(jìn)行發(fā)酵OD600有所上升(圖5-C)。以上結(jié)果表明，通過(guò)缺損ADH3、ADH4、ADH5和ADH6基因不能減少乙醇的積累量；缺損GPD1和GPD2基因可以減少甘油的積累。

A-乙醇含量的比較；B-甘油含量的比較；C-細(xì)胞生長(zhǎng)的比較圖5 基因缺損對(duì)生長(zhǎng)、乙醇含量和甘油含量的影響Fig.5 Cell growth, ethanol and glycerol production of engineered strains

2.2.3 甲羥戊酸途徑轉(zhuǎn)錄水平的比較

將重組菌WHE4和WHE4-21在50 mL YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并測(cè)定甲羥戊酸途徑所有基因轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果如圖6所示。與菌株WHE4相比，發(fā)酵30 h時(shí)，甲羥戊酸途徑ERG10、ERG13、HMG1、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1和ERG20基因的轉(zhuǎn)錄水平均處于下調(diào)狀態(tài)。以上結(jié)果表明，缺損基因GAL1、GAL7和GAL10不能提高甲羥戊酸途徑的強(qiáng)度。與之前研究中報(bào)道的缺損GAL1、GAL7和GAL10基因啟動(dòng)子相比[22]，可能直接缺損GAL1、GAL7和GAL10基因啟動(dòng)子更加有利于Gal4P與目的GAL啟動(dòng)子的結(jié)合，提高目的基因的表達(dá)水平。

圖6 GAL1、GAL7和GAL10基因缺損對(duì)甲羥戊酸途徑基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 The effects of deletion of GAL1, GAL7 and GAL10 on transcriptional levels of the mevalonate pathway genes

2.2.4 基因缺損菌株法尼烯產(chǎn)量的比較

將重組菌WHE4-10、WHE4-13、WHE4-14、WHE4-15、WHE4-21、WHE4-31、WHE4-22和WHE4-33在30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并測(cè)定法尼烯的產(chǎn)量，結(jié)果如圖7所示。菌株WHE4-13、WHE4-14、WHE4-15、WHE4-21和WHE4-31法尼烯產(chǎn)量均低于菌株WHE4，菌株WHE4-10、WHE4-32和WHE4-33法尼烯的產(chǎn)量均高于WHE4，分別為257.30、286.49、326.64 mg/L。以上結(jié)果表明，單獨(dú)缺損GPD1、GPD2和LPP1基因、同時(shí)缺損CIT2和MLS1基因和同時(shí)缺損GAL1、GAL7和GAL10基因?qū)Ψ嵯┑暮铣蔁o(wú)益，同時(shí)缺損BTS1和DPP1基因可以弱化FPP的損失，提高法尼烯的產(chǎn)量。

圖7 不同菌株法尼烯合成Fig.7 Farnesene production of engineered strains

2.2.5 5 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵

將最佳重組菌WHE4-33在5 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，結(jié)果如圖8所示。在初始20 g/L葡萄糖消耗結(jié)束后開始流加葡萄糖溶液(600 g/L)，發(fā)酵液中葡萄糖的質(zhì)量濃度始終控制在1.0 g/L以下，發(fā)酵總時(shí)長(zhǎng)為144 h，最終乙醇和法尼烯的積累分別為70.06、1 578.91 mg/L。

圖8 菌株WHE4-33在5 L發(fā)酵罐水平法尼烯的合成Fig.8 WHE4-33 fed-batch fermentation in a 5 L bioreactor

3 結(jié)論

近些年，釀酒酵母被廣泛應(yīng)用于萜類化合物合成的研究，構(gòu)建一個(gè)釀酒酵母萜類化合物高效合成平臺(tái)顯得極為重要。本研究以釀酒酵母法尼烯合成菌株為研究對(duì)象，通過(guò)使用CRISPR-cas9基因編輯技術(shù)缺損釀酒酵母關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因進(jìn)行法尼烯合成影響研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因GPD1、GPD2、CIT2、MLS1、GAL1、GAL7、GAL10、BTS1和DPP1的缺損影響法尼烯的合成；從而說(shuō)明關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因涉及的甘油合成途徑、胞質(zhì)乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、甲羥戊酸途徑和FPP消耗分支途徑影響法尼烯的合成。然而本研究在補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)乙醇積累量較高，后續(xù)將通過(guò)增強(qiáng)乙醇吸收能力提高胞質(zhì)乙酰輔酶A供給，進(jìn)一步增強(qiáng)甲羥戊酸途徑的代謝流，從而為代謝工程構(gòu)建釀酒酵母萜類化合物高效合成平臺(tái)提供參考價(jià)值。同時(shí)可與已有研究有效策略聯(lián)合使用，從而構(gòu)建釀酒酵母萜類化合物高效合成菌株。