胡江峰，劉舒雯，楊焱，李林霖，李迎凱，張健*

1(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津市經(jīng)濟(jì)貿(mào)易學(xué)校，天津，300381)

黑曲霉具有多種活性強(qiáng)大的酶系[1-2]，對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味和品質(zhì)起到重要作用，如酸性蛋白酶能催化發(fā)酵物料中蛋白質(zhì)的水解，增加種曲或發(fā)酵制品中氨基酸含量，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]；纖維素酶、葡萄糖氧化酶分解原料能使發(fā)酵制品的色、香、味變得更加協(xié)調(diào)。黑曲霉還是重要的有機(jī)酸產(chǎn)生菌，廣泛用于檸檬酸的生產(chǎn)[4]。由于黑曲霉在食品與發(fā)酵工業(yè)中的重要作用，利用基因工程手段對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性改造以提高其生產(chǎn)性能越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

通過(guò)遺傳代謝手段研究黑曲霉菌株，不僅可以更好地理解其代謝調(diào)控機(jī)制，還能有目的地進(jìn)行遺傳改造，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，優(yōu)化菌株的發(fā)酵性能[5]。遺傳改造過(guò)程中，篩選標(biāo)記基因必不可少，潮霉素抗性標(biāo)記hyg[6-7]，博來(lái)霉素抗性標(biāo)記ble[8]是絲狀真菌基因改造時(shí)常用的篩選標(biāo)記，但有些絲狀真菌具有較高的耐藥性，且抗性基因有被轉(zhuǎn)移到環(huán)境和其他微生物的風(fēng)險(xiǎn)，因而其應(yīng)用有一定局限性[9]。

營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記通過(guò)將標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體菌，實(shí)現(xiàn)基因功能互補(bǔ)，使受體菌恢復(fù)野生型表型，達(dá)到轉(zhuǎn)化子篩選目的。常用的營(yíng)養(yǎng)缺陷型有尿苷/尿嘧啶缺陷型[10-11]，亞硝酸鹽缺陷型[12-13]等，其中，尿苷/尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型中pyrG基因編碼乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶，缺乏該酶的菌株無(wú)法在不含尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，必須補(bǔ)充尿苷/尿嘧啶才能正常生長(zhǎng)，而野生型菌株會(huì)把5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid，5-FOA)轉(zhuǎn)化為致死的5-氟尿嘧啶，因而不能在含5-FOA的培養(yǎng)基生長(zhǎng)[14-15]。利用這個(gè)特性，一方面可以通過(guò)5-FOA篩選獲得尿苷/尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，另一方面可以用不加尿苷/尿嘧啶的培養(yǎng)基篩選回補(bǔ)原養(yǎng)型菌株。

本研究在黑曲霉中成功構(gòu)建了以pyrG 基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得1株穩(wěn)定遺傳的尿苷/尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株ng-1，并以pyrG作為回補(bǔ)標(biāo)記將紅色熒光蛋白rfp成功表達(dá)在黑曲霉中[16-17]。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

黑曲霉CICC 41702(AspergillusnigerCICC 41702)、大腸桿菌DH5α(EscherichiacoliDH5α)、根癌農(nóng)桿菌AGL1(AgrobacteriumtumefaciensAGL1)、雙元穿梭質(zhì)粒p44，天津科技大學(xué)生化過(guò)程與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建質(zhì)粒：pyrG敲除質(zhì)粒pm-1；pyrGYS回補(bǔ)標(biāo)記質(zhì)粒pm-2；紅色熒光蛋白rfp表達(dá)質(zhì)粒pm-3。

1.2 試劑

NH4Cl、(NH4)2SO4、K2HPO4、NaCl、葡萄糖、MgSO4·7H2O、瓊脂粉(均為分析純)，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；5-FOA、尿苷、尿嘧啶、頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素、卡那霉素(均為分析純)，北京市索來(lái)寶科技有限公司；DL 5 000 DNA Maker、DL 10 000 DNA Marker、快速DNA聚合酶(5 U/μL)，南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I(15 U/μL)、Hind Ⅲ(15 U/μL)、SacⅠ(15 U/μL)、PstⅠ(15 U/μL)，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌增殖培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化采用IM培養(yǎng)基[18]；黑曲霉所用培養(yǎng)基包括完全培養(yǎng)基(complete medium，CM)[19]、選擇培養(yǎng)基M+met(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：0.2% NH4Cl，0.1% (NH4)2SO4，0.05% NaCl，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4，0.002% FeSO4，2%葡萄糖，0.15%蛋氨酸。

1.4 儀器與設(shè)備

SpX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌，上海申安醫(yī)療器械廠；電子天平，無(wú)限量衡器有限公司；光學(xué)顯微鏡，OLYMpUS公司；TCL臺(tái)式高速離心機(jī)，上海醫(yī)藥分析儀器廠；全自動(dòng)凝膠成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；Wp700型格蘭仕微波爐，順德市格蘭仕電器有限公司；正置熒光顯微鏡，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.5 引物

研究所使用的引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.6 質(zhì)粒的構(gòu)建

以p44為出發(fā)質(zhì)粒，黑曲霉CICC 41702基因組為模板擴(kuò)增所需片段。根據(jù)NCBI上已經(jīng)公布的黑曲霉乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因(pyrG)序列(an12 g03570)設(shè)計(jì)上下游引物，利用pm1-pyrGL-F/R引物對(duì)，pm1-pyrGR-F/R引物對(duì)分別擴(kuò)增得到pyrG上、下游同源臂pyrGL(1 200 bp)和pyrGR(1 200 bp)。用引物pm1-pyrGL-F和pm1-pyrGR-R將2個(gè)同源臂片段融合成1個(gè)片段pyrGLR(2 400 bp)。連接以SacⅠ 和PstⅠ 雙酶切的p44質(zhì)粒和片段pyrGLR，獲得質(zhì)粒pm-1。

利用pm2-pyrGYS-F/R引物對(duì)擴(kuò)增pyrGYS片段，該片段包括：pyrG基因上游啟動(dòng)子區(qū)734 bp，pyrG基因1 127 bp，pyrG基因下游終止子區(qū)336 bp。以EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切p44質(zhì)粒并與pyrGYS片段連接獲得質(zhì)粒pm-2。

利用pm3-pyrGYS-F/R，pm3-gpdA-F/R，pm3-rfp-F/R引物對(duì)分別擴(kuò)增得到pyrGYS(2 197 bp)、gpdA啟動(dòng)子(1 250 bp)和rfp紅色熒光蛋白基因(678 bp)，用pm3-gpdA-F和pm3-rfp-R引物先將gpdA啟動(dòng)子和rfp紅色熒光蛋白融合為1個(gè)片段形成gpdA-rfp(1 928 bp)，再用pm3-pyrGYS-F和pm3-rfp-R引物將pyrGYS與gpdA-rfp融合形成pyrGYS-gpdA-rfp(4 125 bp)。將雙酶切的p44質(zhì)粒(酶切位點(diǎn)EcoRI，HindⅢ)與pyrGYS-gpdA-rfp連接獲得質(zhì)粒pm-3，如圖1所示。

圖1 pm-1、pm-2和pm-3質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 The plasmid construction of pm-1, pm-2 and pm-3

1.7 轉(zhuǎn)化子的篩選

利用同源重組原理，將敲除質(zhì)粒pm-1通過(guò)電轉(zhuǎn)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AGL1中[20]，菌落PCR驗(yàn)證成功后，將其與黑曲霉新鮮孢子在含有硝酸纖維膜的IM固體培養(yǎng)基中25 ℃避光共培養(yǎng)60 h，用無(wú)菌水將黑曲霉孢子洗至含有尿苷(0.5 g/L)、尿嘧啶(0.5 g/L)、5-FOA(2 g/L)、0.1 g/L的氨芐青霉素和0.25 g/L頭孢噻肟鈉的M+met培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)7～10 d，待其長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后提基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子在CM培養(yǎng)基中遺傳10代驗(yàn)證其穩(wěn)定性，獲得尿苷/尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株ng-1[21]。將構(gòu)建的質(zhì)粒pm-2 和pm-3分別電轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL1中后，分別與ng-1的新鮮孢子共培養(yǎng)60 h，以M+met作為選擇培養(yǎng)基，其中添加0.1 g/L的氨芐青霉素和0.25 g/L頭孢噻肟鈉，25 ℃培養(yǎng)7～10 d，待其長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后提基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，正確的轉(zhuǎn)化子即為pyrG營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的回補(bǔ)菌株和rfp表達(dá)菌株。

1.8 轉(zhuǎn)化子的熒光測(cè)定

首先準(zhǔn)備干凈的載玻片，用移液槍槍頭吸1滴無(wú)菌水滴在載玻片，挑取CM培養(yǎng)基上適量的幼嫩菌絲至載玻片的小水滴中，蓋上蓋玻片，輕輕按壓蓋玻片，擠出蓋玻片內(nèi)的氣泡和多余的無(wú)菌水。放置在正置熒光顯微鏡上的載物臺(tái)上，滴1滴香柏油，高倍鏡觀察菌絲形態(tài)。在黑暗環(huán)境中找到清晰的菌絲后調(diào)節(jié)光源至綠色光觀察菌絲是否具有紅色熒光[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pyrG敲除菌株的篩選及驗(yàn)證

如圖2-a所示，尿苷/尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化子在含有5-FOA和尿苷、尿嘧啶的M+met培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，而野生型菌株無(wú)法生長(zhǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子接發(fā)酵小瓶，2 d后待其長(zhǎng)出菌絲，提基因組，以引物pm1-pyrGL-F/R驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，如圖2-b所示，1、2、4、5、6號(hào)泳道條帶大小與預(yù)期相符，為正確轉(zhuǎn)化子，7號(hào)泳道為陰性對(duì)照；圖2-c中1號(hào)泳道為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，由此可知黑曲霉CICC 41702中的pyrG基因被敲除。挑取正確的轉(zhuǎn)化子傳10代進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證明pyrG基因敲除性狀能夠穩(wěn)定的遺傳，選擇1株pyrG基因敲除轉(zhuǎn)化子命名為黑曲霉ng-1，進(jìn)行后續(xù)pyrG回補(bǔ)試驗(yàn)。

M-DL 5 000a-pm-1轉(zhuǎn)化子在復(fù)篩板的生長(zhǎng)情況；b-pm-1轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證[1～6-同源重組轉(zhuǎn)化子黑曲霉；7-黑曲霉CICC 41702陰性對(duì)照(3 527 bp)]；c-pm-1質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照(2 400 bp)圖2 pm-1轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證Fig.2 Transformants verification of pm-1

2.2 pyrG營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的回補(bǔ)

將pm-2質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至根癌農(nóng)桿菌AGL1，侵染黑曲霉菌株ng-1，以不含尿苷/尿嘧啶的M+met作為選擇培養(yǎng)基，共篩選出3株隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子。以pm2-pyrGYS-F/R為引物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。如圖3所示，3個(gè)轉(zhuǎn)化子條帶大小與預(yù)期相符。將條帶大小正確的轉(zhuǎn)化子接入添加尿苷、尿嘧啶和5-FOA的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化子不生長(zhǎng)；接入只添加尿苷/尿嘧啶的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)，證明從黑曲霉CICC 41702基因組擴(kuò)增得到的pyrGYS回補(bǔ)標(biāo)記可用于pyrG型尿苷/尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型黑曲霉恢復(fù)突變，同時(shí)證明黑曲霉ng-1為穩(wěn)定的pyrG基因缺陷型，可直接用于基因轉(zhuǎn)化。

M-DL 5 000;1～3-pm-2轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證全長(zhǎng)；4-出發(fā)菌株ng-1陰性對(duì)照；5-pm-2質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照(2 197 bp)圖3 pm-2轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證Fig.3 Transformants verification of pm-2

2.3 紅色熒光蛋白在黑曲霉中的表達(dá)

以黑曲霉ng-1作為出發(fā)菌株，以pyrGYS為回補(bǔ)標(biāo)記，gpdA為紅色熒光蛋白rfp的啟動(dòng)子pm-3質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，以不含尿苷/尿嘧啶的M+met作為選擇培養(yǎng)基，共篩選出14株隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子。如圖4所示，以引物pm3-pyrGYS-F和pm3-rfp-R對(duì)轉(zhuǎn)化子全長(zhǎng)驗(yàn)證，其中3、5、10、11、13號(hào)泳道條帶大小與預(yù)期相符，為正確轉(zhuǎn)化子。將正確的轉(zhuǎn)化子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，待其長(zhǎng)出菌絲后，對(duì)轉(zhuǎn)化子菌絲進(jìn)行熒光顯微鏡檢測(cè)，如圖5所示，可知紅色熒光蛋白在ng-1的菌株中很好的表達(dá)，證明pyrG基因可作為篩選標(biāo)記直接進(jìn)行基因改造，并實(shí)現(xiàn)以此為標(biāo)記的基因操作。

M-DL 10 000a-pm3轉(zhuǎn)化子全長(zhǎng)驗(yàn)證(1-黑曲霉CICC 41702陰性對(duì)照；2～15-轉(zhuǎn)化子基因組擴(kuò)增全長(zhǎng))；b-pm-3質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照(4 125 bp)圖4 pm-3轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證Fig.4 Transformants verification of pm-3

a-白光下黑曲霉野生菌絲；b-紅光下黑曲霉野生株菌絲；c-白光下轉(zhuǎn)化子菌絲；d-紅光下轉(zhuǎn)化子菌絲圖5 轉(zhuǎn)化子的熒光觀察Fig.5 Fluorescence observation of transformants

3 結(jié)論

本研究利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，基于同源重組原理，敲除了黑曲霉CICC 41702中pyrG基因，獲得性狀穩(wěn)定的尿苷/尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型黑曲霉ng-1。將包含黑曲霉菌株CICC 41702中pyrG全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒pm-2成功轉(zhuǎn)化到菌株ng-1中，可恢復(fù)菌株ng-1的合成尿苷/尿嘧啶的能力，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型菌株恢復(fù)野生型菌株的表型，充分證明黑曲霉pyrG基因是一種嚴(yán)格的營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記，可用于黑曲霉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)，成功構(gòu)建5株熒光蛋白報(bào)告菌株，為從細(xì)胞水平研究黑曲霉中蛋白的分泌和定位奠定了基礎(chǔ)。