宋顯偉， 唐善杰， 曹曉風

（中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，北京 100101）

表觀遺傳學是指不涉及DNA序列的改變、但可以通過有絲分裂和減數分裂進行遺傳的生物現(xiàn)象，包括DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白修 飾（histone modification）、RNA 修 飾（RNA modification）、染色質重塑（chromatin remodeling）以及非編碼RNA（non-coding RNA）等。表觀遺傳主要在轉錄和轉錄后水平調控基因表達及轉座子活性，在生物生長發(fā)育、逆境脅迫及基因組穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用。

轉座子等重復序列是表觀遺傳調控的重要對象。轉座子是基因組中活躍的DNA分子，其通過不同的轉座機制能夠從基因組中一個位點整合到新位點，對動、植物基因組組成、進化和基因表達調控具有重要作用。通常情況下，轉座子被多種表觀遺傳修飾所沉默進而維持基因組穩(wěn)定性。相比于模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana），作物基因組通常含有大量轉座子。例如玉米和大麥基因組序列含有85%左右的轉座子；在水稻基因組中，盡管轉座子含量為40%左右，但大量轉座子散布在基因周圍，可作為表觀元件精細調控基因表達，進而控制重要農藝性狀[1-2]。作物中大多數表觀遺傳因子的功能喪失會造成嚴重的發(fā)育缺陷甚至致死，表明表觀遺傳調控對于作物生長發(fā)育至關重要。

表觀遺傳修飾能迅速響應環(huán)境做出改變，因此表觀遺傳變異在生物進化過程中非常普遍，變異頻率遠高于遺傳變異，擬南芥中DNA甲基化的天然突變率約為堿基突變的1萬倍[3]。一些表觀遺傳修飾在植物生殖細胞的配子發(fā)育過程中能忠實遺傳，例如對基因表達起重要調控作用的CG位點DNA甲基化，在配子發(fā)育及受精后并不像動物那樣經歷擦除及重建過程[4]，研究表明，經歷10代高鹽脅迫的擬南芥較正常生長條件下積累了多達45%的CG位點甲基化變異，而75%的變異可傳遞給下一代[5]。表觀變異的高頻發(fā)性及穩(wěn)定跨代遺傳性為作物育種和性狀改良提供了新的變異源泉。

1 表觀遺傳調控重要農藝性狀

1.1 DNA甲基化調控

近年來隨著表觀遺傳學的深入研究，發(fā)現(xiàn)越來越多的重要農藝性狀受表觀遺傳調控，尤以DNA甲基化研究最多。DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是進化上保守的一種重要表觀遺傳修飾，在植物中可發(fā)生在CG、CHG和CHH (H代表A、T或C)位點，主要在轉錄水平抑制基因的表達和轉座子的活性，其功能對植物生長發(fā)育是必需的，例如維持CG位點甲基化的DNA甲基轉移酶OsMet1-2功能喪失導致水稻早期致死[6]。

在已有研究中，由轉座子引發(fā)的DNA甲基化變異介導重要農藝性狀形成的例子最為常見[7]。例如甜瓜的性別決定即是由插入到關鍵性別決定基因CmWIP1啟動子區(qū)轉座子的表觀遺傳狀態(tài)改變所介導的[8]；番茄果實的維生素E含量會受其合成關鍵基因VTE3(1)啟動子區(qū)域SINE逆轉錄轉座子DNA甲基化影響，不同程度甲基化介導VTE3(1)表達量不同，從而產生維生素E含量不同的番茄[9]。油棕體細胞繁殖過程高誘發(fā)的“mantled”變體現(xiàn)象也是由轉座子介導表觀變異引起的，組織培養(yǎng)引發(fā)插入到關鍵持家基因DEFICIENT的karma反轉座子DNA甲基化丟失，使得該基因拼接異常形成“mantled”變體，嚴重影響棕櫚果實產量[10]。Yang等[11]和 Huang等[12]發(fā)現(xiàn)，CACTA 及Harbinger-like類轉座子插入到光周期敏感基因ZmCCT啟動子區(qū)域，增加了此區(qū)域DNA甲基化水平并降低了ZmCCT基因表達，減弱了玉米對光周期的敏感性，促進了玉米在溫帶長日照條件下的適時開花。

由于轉座子特別是一些MITE類DNA轉座子大量分布在基因周圍，可作為表觀元件精細調控基因表達，進而控制重要性狀。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)，水稻BR合成的關鍵基因RAV6啟動子區(qū)MITE轉座子的DNA甲基化丟失，可導致該基因異位表達而產生大的葉夾角。Deng等[14]發(fā)現(xiàn)，PigmS基因上游MITE轉座子產生siRNA，通過介導DNA甲基化抑制PigmS在葉中表達，進而釋放其拮抗的PigmR進行廣譜抗稻瘟病。最近在無毛非洲栽培稻(Oryza glaberrima)中發(fā)現(xiàn)，有利于收獲和儲藏的穎殼無毛性狀是hAT轉座子插入到控制毛狀體發(fā)育基因GLAG5（GLABROUS GLUME 5)上，引發(fā)DNA甲基化，抑制了該基因表達而產生無毛的有利性狀[15]。

在非轉座子介導DNA甲基化變異方面，Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)，控制水稻理想株型的Ideal plant architecture1(IPA1)上游的結構變異會抑制啟動子區(qū)DNA甲基化，使得IPA1適量表達，產生理想株型；水稻PRC2復合體重要成員FIE1的編碼基因5’上游區(qū)域發(fā)生DNA甲基化丟失，可導致FIE1異位表達，產生矮化等表型[17]。在調控水稻穗長方面，Luan等[18]發(fā)現(xiàn)一段長非編碼RNA轉錄終止位點的DNA甲基化丟失，導致穗長嚴重變短，表明該位點的甲基化修飾調控了水稻穗長發(fā)育。

綜上所述，目前已獲得一些決定重要農藝性狀的DNA甲基化變異，為作物重要性狀改良和利用提供了表觀遺傳資源。但是作物中的重要表觀變異仍未被大規(guī)模鑒定。此外，這些表觀變異主要由自然演化產生，還缺乏人工創(chuàng)制的大量作物表觀變異資源。

1.2 非編碼RNA調控

作為表觀遺傳調控的重要組成部分，非編碼RNA，特別是小分子RNA也被發(fā)現(xiàn)調控了眾多重要性狀[19]。小分子RNA為一類長度為20～30 nt的非編碼RNA，在植物中主要分為miRNA和siRNA兩類，它們被加工成熟后，與進化保守的AGO蛋白形成沉默復合體，從而以堿基互補配對的形式靶向被調控靶基因的mRNA，通過介導DNA甲基化、剪切、翻譯抑制等方式在轉錄和轉錄后水平負調控靶基因的表達，參與幾乎各種生物學過程。

miRNA是一類進化上保守的小分子RNA，調控很多重要轉錄因子，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫中發(fā)揮重要調控作用[20]。已有研究表明，適當減弱或增強小分子RNA與其靶基因的負調控作用，會產生優(yōu)異農藝性狀，為作物遺傳改良提供了一個新途徑。例如，控制水稻理想株型的OsSPL14基因受miR156負調控，其靶向位點1個堿基變異使得miR156調控作用減弱，OsSPL14適量增加表達，產生理想株型及高抗病表型[21-22]；由自然變異或人為操縱引發(fā)的miR396對靶基因GRF4的負調控減弱，可促使水稻籽粒變長、穗子變大、產量提高[23-26]。同樣，過表達水稻miR397從而增強其對編碼木質素生物合成關鍵酶-漆酶LAC基因負調控，也可顯著提高穗粒數和種子大小[27]。但過表達梨miR397則降低了梨果實的木質素含量和石細胞數量，提高了梨的適口性[28]。抑制水稻miR147、miR1432或過表達miR408可顯著提高籽粒大小[29-30]。同樣在大麥中，適當抑制miR172的調控可提高麥粒密度[31]。除了產量及品質性狀外，miRNA也在植物與環(huán)境互作方面發(fā)揮重要調控作用，包括植物可塑性、豆科植物結瘤固氮、生物及非生物脅迫等過程[20]。

siRNA是高等植物中大量存在的一類小RNA分子，包括與異染色質相關的hc-siRNAs及次級tasiRNAs和phasiRNAs等。不同的siRNA也調控了一些重要農藝性狀。單子葉植物保守的生殖細胞大量表達phasiRNAs被發(fā)現(xiàn)調玉米和水稻環(huán)境依賴的育性[32-35]，其中一些已被應用于生產實踐。例如，在兩系雜交稻生產中，首個發(fā)現(xiàn)的兩用光敏不育系農墾58S及其衍生的溫敏不育系‘培矮64S’，其環(huán)境依賴育性被發(fā)現(xiàn)為phasiRNAs位點自然變異所介導[36-38]。最近研究發(fā)現(xiàn)，受低溫誘導表達的AGO1d介導產生的phasiRNAs調控了水稻低溫雄性不育，ago1d突變體表現(xiàn)為低溫雄性不育，具有發(fā)展為溫敏不育系的潛力[39]。此外，由MITEs產生的siRNA也被發(fā)現(xiàn)參與玉米抗旱和水稻抗病調控[40-41]。

除了DNA甲基化和小RNA外，最近的研究也發(fā)現(xiàn)，RNA m6A修飾在調控作物重要農藝性狀上發(fā)揮重要功能。在水稻和馬鈴薯中通過外源導入RNA m6A去甲基化酶FTO，一定程度上降低全基因組m6A甲基化水平，可顯著提高光合效率及抗旱能力，增加田間作物產量約50%，同時并未降低品質[42]。鑒于m6A修飾的保守性，該工作為作物育種開辟了新的技術手段和研究方向。

挖掘和克隆作物重要農藝性狀相關的非編碼RNA，闡明它們在作物性狀決定中所起的調控作用，可為高產高抗作物新品種的培育提供新的研究思路和研究手段。另外，外源小RNA介導的RNA干擾技術已成為人為調控基因表達的新手段，在提高作物抗病和抗蟲能力方面有著良好的應用前景。

2 表觀遺傳與倍性育種

倍性育種是指改變作物染色體組的數量進行育種的方法，根據其對于染色體組減半或加倍可分為單倍體育種和多倍體育種。單倍體（haploid）個體基因組來源于遺傳重組后減數分裂產生的單方配子。單倍體經簡單加倍后可獲得純合穩(wěn)定的雙單倍體（doubled haploid，DH），省去了傳統(tǒng)雜交育種中連續(xù)多代自交過程，極大地加快了育種進程。單倍體育種技術在玉米育種過程中已經得到廣泛應用，但是其他作物中由于缺少成熟高效的單倍體誘導系，制約了單倍體育種技術的發(fā)展。Ravi等[43]在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3變體著絲粒組蛋白H3(CenH3)功能弱化突變體與野生型雜交可以誘導基因組減半。隨后，Kelliher等[44]將玉米CenH3基因敲降也獲得了單倍體誘導系，但是由于其誘導效率極低并不適合生產應用。最近，Lv等[45]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除了小麥CenH3基因，獲得了最高可達8%的單倍體誘導率，進一步研究發(fā)現(xiàn)CenH3雜合編輯類型的誘導率要高于純和編輯株系。由于CenH3功能高度保守，因此基于CenH3的單倍體誘導技術具有非常廣闊的應用前景。

多倍化事件是推動生物進化的重要驅動力之一,研究顯示,幾乎所有開花植物都經歷了至少1次基因組加倍事件,主要多倍體作物包括小麥、棉花、油菜、馬鈴薯、甘蔗等[46]。多倍體作物在長期馴化過程中表現(xiàn)出強烈的適應性優(yōu)勢,具有生物量大、抗逆性強、水肥利用效率高等特征[47]。物種多倍化過程中除了大量基因丟失或加倍之外還表現(xiàn)出亞基因組不對稱性,表現(xiàn)為有偏向性地表達其中一個基因組上的基因[48]。組蛋白修飾、轉座子和染色質開放性可能是造成這種不對稱性的重要原因。Han等[49]以異源四倍體棉花及其祖先種為研究對象，深入研究了棉花進化過程中染色質開放狀態(tài)的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾、轉座子和順式調控元件之間的協(xié)同互作推動了多倍化后的染色質動態(tài)變化。Yuan等[50]發(fā)現(xiàn)，六倍體小麥多倍化過程中，開放元件遠距離互作調控差異可能是造成亞基因組間基因表達偏好性的分子基礎。也有研究指出轉座元件上的DNA甲基化修飾和24nt siRNA指導的DNA甲基化參與調控異源多倍體亞基因組的不對稱性[51-53]。盡管多倍體作物的研究存在基因組龐大、性狀解析困難等難題，但是隨著基因組學、表觀組學和群體遺傳學的飛速發(fā)展，將促進多倍體作物起源和人工馴化過程中重要農藝性狀的形成機制解析及優(yōu)異基因資源的挖掘和利用。

3 表觀遺傳育種技術

CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)以精確性和易用性逐漸替代了傳統(tǒng)的鋅指核酸酶 (zinc finger nuclease, ZFN)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技術，在作物改良上具有巨大應用前景，也越來越受到育種家重視[54]。除序列編輯外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可改造用于靶向表觀編輯。將Cas9蛋白的雙鏈DNA切割位點突變?yōu)闊o切割活性的dCas9蛋白，僅利用其在guide RNA引導下結合基因組的功能，將表觀修飾酶靶向基因組特定位點實現(xiàn)定點表觀編輯[55]。Gallego-Bartolomé等[56]在擬南芥中利用SunTag-TET1系統(tǒng)實現(xiàn)了FWA位點靶向DNA甲基化去除，產生晚花表型。Papikian等[57]將去甲基化酶TET1替換為煙草甲基化酶DRM催化結構域，實現(xiàn)了靶向DNA甲基化修飾。Tang等[58]首次在作物中建立了靶向DNA甲基化去除編輯體系，靶向去除了FIE1基因近啟動子區(qū)域的DNA甲基化，產生了一系列的植株矮化表型。更為重要的是，編輯產生的低甲基化狀態(tài)和矮化性狀可以在分離出轉基因載體的后代中穩(wěn)定遺傳。

此外，基于DNA甲基化等表觀變異可在植物世代交替過程穩(wěn)定遺傳的特性，人為創(chuàng)造全基因范圍表觀遺傳變異，利用遺傳重組實現(xiàn)表觀變異位點分離，創(chuàng)建的表觀遺傳重組自交系（epi-RILs）已在模式植物擬南芥中被成功構建[59-60]。利用DNA甲基化轉移酶MET1和染色質重塑因子DDM1功能缺失突變體，建立全基因組DNA甲基化缺失，通過與野生型雜交、分離及傳代進行epi-RILs構建。該群體不僅包含大量表觀變異，而且激活大量轉座子跳躍，介導了遺傳變異，產生了豐富的表型變異，其中包括耐鹽、抗病等優(yōu)異性狀。

表觀編輯技術及表觀重組自交系為人工創(chuàng)制表觀變異資源提供了有效工具。但在作物中，相關研究還較少。更多類型適用于作物的表觀修飾編輯器亟待開發(fā)，作物表觀重組自交系同樣亟待創(chuàng)建。

4 結語

綜上所述，表觀遺傳已被證實在調控作物重要農藝性狀上發(fā)揮重要作用，特別是對作物性狀精細調控上，表觀遺傳往往優(yōu)勢更強于遺傳調控。表觀遺傳較高的自然突變頻率引發(fā)的表觀變異及其介導的遺傳變異，極大豐富了作物表型多樣性，其中不乏優(yōu)良性狀，加之DNA甲基化等表觀遺傳修飾可在世代間穩(wěn)定遺傳，促使表觀遺傳變異成為優(yōu)良農藝性狀獲取的新型變異源泉。但是目前作物中表觀遺傳研究還相對有限，需加強并深入解析表觀遺傳在農藝性狀形成中的調控作用。因此，通過表觀遺傳編輯技術等手段創(chuàng)制能夠有效改良重要農藝性狀的表觀變異，培育高產優(yōu)質多抗的農作物品種，對于促進糧食增產穩(wěn)產具有重要的應用價值和戰(zhàn)略意義。