陳浩， 周菲， 林擁軍

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070）

我國既是農(nóng)業(yè)大國也是人口大國，因此我國政府歷來重視農(nóng)業(yè)問題和糧食安全。習(xí)近平總書記指出“糧食安全是國之大者”。人口眾多、耕地資源有限是我國的基本國情。在此前提下，增加作物產(chǎn)能的關(guān)鍵在于提高單產(chǎn)，這意味著增加農(nóng)業(yè)產(chǎn)量保證我國的糧食安全主要依賴于科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。隨著科技的發(fā)展，作物重要農(nóng)藝性狀（如抗病性、產(chǎn)量、養(yǎng)分高效利用等）遺傳基礎(chǔ)的深入解析，基因組高通量測(cè)序技術(shù)、基因編輯技術(shù)、基因組育種技術(shù)等不斷的革新，以及抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆和玉米的產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)為作物育種注入新的活力。在國家的積極布局和大力支持下，近年來，我國在作物育種理論和技術(shù)上不斷突破和創(chuàng)新，取得了令人矚目的成績(jī)。本文圍繞作物新種質(zhì)創(chuàng)制這一主題，梳理和回顧了我國在此領(lǐng)域取得的一些具有代表性的成果，并對(duì)發(fā)展前景進(jìn)行了總結(jié)和展望。

1 重要農(nóng)藝性狀的解析和利用自然變異創(chuàng)制新種質(zhì)

目前，密植是實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)的重要策略。2019年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在玉米緊湊株型性狀調(diào)控分子機(jī)理研究方面取得重要進(jìn)展[1]。他們基于玉米自交系W22與玉米祖先大芻草（CIMMT 8759）雜交衍生的重組自交系群體，定位并克隆了2個(gè)控制玉米直立株型的主效基因UPA1和UPA2。其中，UPA2為非編碼基因，該基因在大芻草與玉米自交系W22之間存在2 bp核苷酸插入/缺失多態(tài)性，導(dǎo)致兩者存在功能差異。大芻草UPA2基因多了2 bp的核苷酸插入，導(dǎo)致其DNA序列與控制葉夾角的DRL1蛋白具有更強(qiáng)的結(jié)合能力。DRL1可與LG1蛋白互作，抑制LG1對(duì)轉(zhuǎn)錄因子基因ZmRAVL1（該基因位于UPA2基因下游9.5 kb處）的表達(dá)激活作用，導(dǎo)致受ZmRAVL1激活的油菜素內(nèi)脂合成基因brd1（即UPA1）的表達(dá)下調(diào)，降低了葉環(huán)處內(nèi)源油菜素內(nèi)脂水平，最終導(dǎo)致減小的葉夾角和緊湊株型。換而言之，大芻草來源的UPA2基因可以導(dǎo)致利于玉米密植的緊湊株型。研究還發(fā)現(xiàn)，大芻草UPA2基因類型在玉米馴化過程中已經(jīng)丟失，這意味著現(xiàn)代玉米栽培種中導(dǎo)入大芻草UPA2等位基因可以改善株型，利于密植[1]。

2021年，《Nature》雜志發(fā)表了中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究人員在水稻氮素高效利用研究上的重要進(jìn)展[2]。利用全球收集的110份水稻農(nóng)家種，開展水稻分蘗氮響應(yīng)性的全基因組 關(guān) 聯(lián) 分 析（genome-wide association studies，GWAS），鑒定出水稻氮高效基因OsTCP19。研究表明，OsTCP19上游調(diào)控區(qū)中一段29 bp核酸片段的缺失與否決定不同水稻品種分蘗氮響應(yīng)的差異。氮響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子LBD蛋白結(jié)合在OsTCP19基因上游該29 bp核苷酸序列的附近，抑制其表達(dá)。因此，氮高效品種的OsTCP19調(diào)控區(qū)普遍缺失了該29 bp核苷酸序列。在中低氮條件下，近等基因系OsTCP19-H比對(duì)應(yīng)的受體親本Kos具有更多的分蘗數(shù)目和更高的單株產(chǎn)量，其產(chǎn)量和氮利用效率較對(duì)照分別提高了約20%和30%。值得注意的是，我國現(xiàn)代水稻品種中這一氮高效變異幾乎全部丟失，因此OsTCP19基因功能的解析為培育施氮肥少且高產(chǎn)的綠色水稻品種奠定了基礎(chǔ)[2]。

2021年，《Cell》雜志發(fā)表中國科學(xué)院分子植物卓越中心在植物抗病分子機(jī)制研究上的重要進(jìn)展[3]。該研究揭示水稻鈣離子感受子ROD1通過適當(dāng)抑制水稻免疫水平，平衡水稻抗病性與生殖生長和產(chǎn)量性狀的分子機(jī)制。通過對(duì)水稻抗病種質(zhì)資源的篩選，研究人員鑒定到對(duì)稻瘟病、紋枯病和白葉枯病等主要水稻病害均表現(xiàn)出高抗的隱性突變基因rod1。正常條件下，rod1突變體生長遲緩，沒有優(yōu)勢(shì)；但在自然病圃條件下該突變體抗病性顯著，表現(xiàn)出更佳的長勢(shì)和產(chǎn)量。圖位克隆發(fā)現(xiàn)ROD1是依賴鈣離子結(jié)合能力的C2結(jié)構(gòu)域鈣感應(yīng)蛋白，可通過與過氧化氫酶CatB互作將其從過氧化物酶體轉(zhuǎn)至質(zhì)膜。ROD1依賴于其鈣結(jié)合能力促進(jìn)CatB的酶活，降解免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生的活性氧爆發(fā)和細(xì)胞死亡。即ROD1和CatB構(gòu)成Ca2+-活性氧信號(hào)通路負(fù)調(diào)控植物免疫，避免過度免疫導(dǎo)致負(fù)面效應(yīng)。水稻稻瘟病菌正是利用此機(jī)制模擬具有ROD1結(jié)構(gòu)的毒性蛋白，抑制植物免疫功能實(shí)現(xiàn)侵染目的。通過對(duì)260多份水稻材料的紋枯病抗性分析，鑒定出2個(gè)抗病性存在差異的ROD1單倍型SNP1-A和SNP1-C。其中，SNP1-A的免疫抑制能力相對(duì)較弱，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗病性，且SNP1-A對(duì)水稻的生長發(fā)育和產(chǎn)量無明顯影響。這意味著SNP1-A單倍型對(duì)于創(chuàng)制抗水稻抗紋枯病抗病育種材料具有重要應(yīng)用價(jià)值[3]。

2 基因編輯工具的革新及基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

2.1 基因編輯工具的革新

基于來自釀膿鏈球桿菌（Streptococcus pyogenes）CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，規(guī)律間隔的成簇短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白9）系統(tǒng)的基因編輯技操作簡(jiǎn)便、編輯效率高、編輯方式靈活，且產(chǎn)品可以不含有轉(zhuǎn)基因成分，目前成為基因工程領(lǐng)域最熱門的研究方向。相關(guān)研究在近幾年內(nèi)受到了科研人員的普遍關(guān)注和積極參與，獲得了飛速發(fā)展，并在多種植物中得到廣泛應(yīng)用，為作物性狀改良作出了重要貢獻(xiàn)。我國的科研人員圍繞該研究熱點(diǎn)，積極參與基因編輯技術(shù)的革新和應(yīng)用。

堿基編輯器包括胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器，是實(shí)現(xiàn)單堿基精確編輯的重要工具之一，其中胞嘧啶堿基編輯器是將胞嘧啶脫氨酶和人工突變獲得的DNA切口酶（nCas9）融合，然后在單鏈向?qū)?RNA（single-stranged guide RNA，sgRNA）的引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)堿基序列C/G→T/A的轉(zhuǎn)換；而腺嘌呤編輯器是將腺苷脫氨酶與nCas9融合，通過類似胞嘧啶編輯器的機(jī)制實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)堿基A/T→G/C的轉(zhuǎn)換[4-5]。2019年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究團(tuán)隊(duì)對(duì)單堿基編輯工具在水稻中脫靶效應(yīng)評(píng)估進(jìn)行研究[6]。研究團(tuán)隊(duì)將3種廣泛使用的堿基編輯器即胞嘧啶堿基編輯器BE3、高保真胞嘧啶堿基編輯器HF1-BE3以及腺嘌呤堿基編輯器ABE通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到水稻，然后利用全基因組測(cè)序?qū)E3、HF1-BE3或ABE編輯的再生水稻植株進(jìn)行脫靶效應(yīng)分析。研究發(fā)現(xiàn)，與未編輯的對(duì)照相比，3種單堿基編輯器沒有顯著增加插入或刪除的變異類型。但是，胞嘧啶堿基編輯器BE3和HF1-BE3較ABE和對(duì)照顯著增加了單核苷酸變異。該研究結(jié)果揭示胞嘧啶堿基編輯器會(huì)造成顯著的脫靶效應(yīng)，但是腺嘌呤編輯器不會(huì)。

2020年中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所2個(gè)研究團(tuán)隊(duì)合作構(gòu)建具有雙堿基編輯功能的STEME（saturated targeted endogenous mutagenesis editors），可以在作物中進(jìn)行定向飽和突變，實(shí)現(xiàn)原位定向進(jìn)化[7]。將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時(shí)融合在nCas9 (D10A)的N末端，同時(shí)將尿嘧啶糖基化酶抑制子UGI融合nCas9 (D10A)的C端，即可構(gòu)建為飽和靶向內(nèi)源基因突變編輯器STEME。STEME僅需1個(gè)sgRNA的引導(dǎo)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)DNA的2類堿基變異（C→T或A→G轉(zhuǎn)換），顯著增加靶基因堿基突變的飽和度和多樣性，實(shí)現(xiàn)植物內(nèi)源基因的原位定向進(jìn)化。研究人員利用STEME成功創(chuàng)制了抗除草劑水稻新材料。針對(duì)水稻乙酰輔酶A羧化酶基因OsACC的編碼蛋白的羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)了200個(gè)獨(dú)立的sgRNA，構(gòu)建到STEME-1或STEME-NG雙堿基編輯載體上。將這些表達(dá)載體分為27組轉(zhuǎn)化水稻，獲得約6 000株水稻再生苗。利用除草劑氟吡甲禾靈對(duì)再生苗進(jìn)行抗性篩選，鑒定出4個(gè)耐除草劑的突變位點(diǎn)P1927F、W2125C、S1866F和 A1884P，其 中 3個(gè) 位 點(diǎn)（P1927F、S1866F和A1884P）為新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)[7]。

2020年6月，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究人員建立“AFID系統(tǒng)”（APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion systems），該系統(tǒng)是一種新型多核苷酸靶向刪除系統(tǒng)，具有高效、精準(zhǔn)、可預(yù)測(cè)等特點(diǎn)[8]。研究人員基于胞嘧啶脫氨以及堿基切除修復(fù)的機(jī)制，將野生型SpCas9與胞嘧啶脫氨酶、尿嘧啶糖基化酶和無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)裂合酶組合，建立了新型多核苷酸靶向刪除系統(tǒng)AFIDs，成功在水稻和小麥基因組中實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)、可預(yù)測(cè)的多核苷酸刪除。通過在水稻和小麥細(xì)胞中對(duì)多個(gè)內(nèi)源DNA靶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試表明，利用高脫氨活性的APOBEC3A脫氨酶構(gòu)建AFID-3，其介導(dǎo)的刪除效率可達(dá)33.1%，產(chǎn)生從不同5’-胞嘧啶到Cas9切割位點(diǎn)間的多核苷酸刪除，其中30%以上的刪除可預(yù)測(cè)。研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)基于截短的APOBEC3B脫氨酶A3Bctd開發(fā)的eAFID-3系統(tǒng)AFID-3的刪除效率更高。利用AFID-3系統(tǒng)靶向水稻OsSWEET14基因啟動(dòng)子的效應(yīng)子結(jié)合元件，獲得多核苷酸刪除的突變體植株，經(jīng)白葉枯病接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相較于1～2 bp的插入缺失，AFID-3系統(tǒng)產(chǎn)生的水稻多核苷酸刪除突變體具有更強(qiáng)的白葉枯病菌抗性[8]。

2019年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所與美國加州大學(xué)圣地亞哥分校合作，改進(jìn)了基于CRISPR系統(tǒng)的靶向敲入技術(shù)[9]。該研究以RNA作為同源重組修復(fù)的供體模板，利用具有RNA/DNA雙重切割能力的CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)，對(duì)水稻乙酰乳酸合成酶基因片段進(jìn)行精準(zhǔn)替換，成功獲得抗乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑的水稻材料。研究還發(fā)現(xiàn)，若同時(shí)提供DNA和RNA修復(fù)模板，與僅提供RNA修復(fù)模板相比同源導(dǎo)向的DNA修復(fù)效率更高。因此，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)可在修復(fù)模板的DNA序列兩側(cè)添加CRISPR/Cpf1識(shí)別的靶點(diǎn)序列，在表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻后利用CRISPR/Cpf1的RNA/DNA雙重切割功能同時(shí)產(chǎn)生DNA 和RNA修復(fù)模板，從而提高同源導(dǎo)向的DNA修復(fù)效率[9]。

研究人員發(fā)現(xiàn)，將DNA供體片段進(jìn)行硫代修飾和磷酸化修飾能夠顯著增強(qiáng)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的靶向敲入效率。利用該技術(shù)，研究人員在14個(gè)基因位點(diǎn)上靶向敲入各類調(diào)控元件，如翻譯增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，甚至整個(gè)啟動(dòng)子，敲入供體片段最長可達(dá)2 049 bp。該方法在水稻中的敲入效率最高達(dá)47.3%，平均為25.0%。研究人員還設(shè)計(jì)了一種片段精準(zhǔn)替換的策略——“重復(fù)片段介導(dǎo)的同源重組（tandem repeats-HDR，TR-HDR）”策略，在5個(gè)基因位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了片段替換和原位標(biāo)簽蛋白的精準(zhǔn)融合，效率最高達(dá)11.4%[10]。

2019年，哈佛大學(xué)David Liu的研究團(tuán)隊(duì)在《Nature》雜志發(fā)表了可替代堿基編輯和定點(diǎn)敲入功能的新堿基編輯方法——引導(dǎo)編輯（prime editing）[11]。引導(dǎo)編輯的原理是將 nCas9（H840A）和逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV融合，然后在引導(dǎo)編輯向?qū)NA（prime editing guide RNA, pegRNA）的引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)對(duì)人體細(xì)胞目標(biāo)DNA模板的替換。其基本過程是，nCas9在pegRNA引導(dǎo)下切割目標(biāo)位點(diǎn)，然后逆轉(zhuǎn)錄酶在pegRNA上的引物結(jié)合位點(diǎn)幫助下以pegRNA上的編輯序列作為模板逆轉(zhuǎn)錄DNA。最后被編輯的細(xì)胞通過自身修復(fù)機(jī)制，以逆轉(zhuǎn)錄的DNA序列替換切口處的目標(biāo)DNA序列，完成靶位點(diǎn)的精準(zhǔn)編輯[11]。實(shí)踐證明，引導(dǎo)編輯介導(dǎo)的DNA精確編輯效率高于同源重組修復(fù)，同時(shí)又能克服單堿基編輯器的缺點(diǎn)，具有更高的靈活性，進(jìn)一步擴(kuò)展了基因組編輯應(yīng)用的范疇。2020年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究團(tuán)隊(duì)在作物中引入適合植物的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)[12]。該研究團(tuán)隊(duì)利用植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在水稻和小麥的原生質(zhì)體中實(shí)現(xiàn)了16個(gè)內(nèi)源位點(diǎn)的精準(zhǔn)編輯，包括全部12種類型的單堿基替換、多堿基替換、小片段精準(zhǔn)插入或刪除，編輯效率最高達(dá)19.2%。該團(tuán)隊(duì)還成功獲得了單堿基突變、多堿基突變及精準(zhǔn)刪除的水稻突變體植株，編輯效率最高達(dá)21.8%[12]。

2021年3月，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所對(duì)植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的重要改進(jìn)，提高了植物引導(dǎo)編輯的效率并為高效設(shè)計(jì)pegRNA提供了全套方案[13]。該研究通過測(cè)試水稻內(nèi)源位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的引物結(jié)合位點(diǎn)的熔解溫度為30 ℃左右時(shí)，平均引導(dǎo)編輯效率最高。研究人員還發(fā)現(xiàn)，若采用雙pegRNA編輯的策略，同時(shí)利用2個(gè)pegRNA分子分別靶向目標(biāo)DNA的2條鏈進(jìn)行共同編輯，比僅使用單個(gè)pegRNA分子平均編輯效率提高3倍。此外，研究人員還開發(fā)了植物pegRNA計(jì)網(wǎng)站PlantPegDesigner（http://www.plantgen omeediting.net/），可為使用者提供完整的pegRNA選擇、設(shè)計(jì)與推薦方案[13]。

2021 年，《Nature Biotechnology》雜志在線發(fā)表了中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所對(duì)植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的系統(tǒng)評(píng)估結(jié)果[14]。引導(dǎo)編輯系統(tǒng)可以在基因組的靶向位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)任意類型的堿基替換、小片段的精準(zhǔn)插入與刪除，但是其脫靶效應(yīng)還缺乏系統(tǒng)研究。引導(dǎo)編輯系統(tǒng)對(duì)間隔序列近PAM端或PBS的5’端的錯(cuò)配容忍度較低，且pegRNA依賴的引導(dǎo)編輯在水稻內(nèi)源位點(diǎn)脫靶效應(yīng)非常低，可通過合理設(shè)計(jì)pegRNA提升該系統(tǒng)的特異性。隨后，研究人員又評(píng)估了引導(dǎo)編輯系統(tǒng)是否造成不依賴pegRNA的全基因組范圍的脫靶效應(yīng)，過表達(dá)含有外源M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)源的逆轉(zhuǎn)錄生物學(xué)過程、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性以及端粒酶的活性、高豐度mRNA及pegRNA序列的逆轉(zhuǎn)錄-插入的可能性等細(xì)胞內(nèi)源生物學(xué)過程的影響，結(jié)果表明引導(dǎo)編輯系統(tǒng)也沒有造成全基因組范圍的不依賴于pegRNA的脫靶效應(yīng)[14]。因此，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)整體上具有很高的特異性。

2.2 利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制新種質(zhì)

雜交水稻占水稻總種植面積的57%，為我國的糧食安全作出巨大貢獻(xiàn)。由于雜交種子后代會(huì)發(fā)生遺傳分離，無法固定雜種優(yōu)勢(shì)，因此需要不斷的人工制種，花費(fèi)大量的人力物力。2019年中國水稻研究所研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在雜交水稻中同時(shí)敲除了4個(gè)生殖相關(guān)基因，建立了水稻無融合生殖體系，實(shí)現(xiàn)了雜合優(yōu)勢(shì)的固定[15]。其中，當(dāng)REC8、PAIR1和OSD1這3個(gè)減數(shù)分裂基因被敲除后，雜交稻可以產(chǎn)生二倍體配子和四倍體種子從而固定雜種基因型；而敲除受精相關(guān)的MTL基因后，雜交稻可以產(chǎn)生單倍體種子。因此，當(dāng)上述4個(gè)基因同時(shí)敲除時(shí)，雜交水稻可以通過自交產(chǎn)生與親本基因型一致的二倍體種子。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了雜種優(yōu)勢(shì)的固定，有望給作物的雜種優(yōu)勢(shì)利用帶來新策略[15]。

2022年3月，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控玉米穗行數(shù)的基因KRN2對(duì)玉米和水稻產(chǎn)量均有重要影響,對(duì)該基因進(jìn)行基因編輯，可以顯著提高玉米和水稻的產(chǎn)量[16]。研究人員采用基因組學(xué)技術(shù)從野生玉米資源創(chuàng)制的玉米材料中鑒定出了KRN2。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在玉米馴化和改良過程中，該基因上游非編碼區(qū)受到了明顯的選擇，導(dǎo)致基因表達(dá)量降低，進(jìn)而增加了玉米的穗行數(shù)和穗粒數(shù)并最終增加產(chǎn)量。而在水稻基因組中鑒定出的同源基因OsKRN2，其控制水稻的二次枝梗數(shù)，也最終影響穗粒數(shù)和產(chǎn)量。類似于玉米KRN2，水稻OsKN2在栽培稻馴化和改良過程中也同樣受到選擇，導(dǎo)致基因表達(dá)量降低。KRN2/OsKRN2編碼WD40蛋白，通過與功能未知蛋白DUF1644互作調(diào)控玉米穗行數(shù)與水稻穗粒數(shù)。該研究利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制KRN2和OsKRN2基因功能敲除的新材料，多年多點(diǎn)的田間小區(qū)試驗(yàn)表明，KRN2/OsKRN2敲除系分別提高約10.0%的玉米產(chǎn)量和8.0%的水稻產(chǎn)量，具有較好的應(yīng)用潛力[16]。

2022年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所利用基因編輯技術(shù)改造水稻株型調(diào)控的主效基因IPA1的啟動(dòng)子區(qū)域可提高水稻產(chǎn)量[17]。IPA1編碼含有SBP-box結(jié)構(gòu)域的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，其功能獲得基因型ipa1-1D和ipa1-2D能夠使穗部增大、無效分蘗減少、莖稈粗壯、根系發(fā)達(dá)，最終提高產(chǎn)量。雖然IPA1基因已應(yīng)用于優(yōu)良水稻品種的培育，但天然的IPA1基因在增大穗部的同時(shí)會(huì)降低分蘗數(shù)，一定程度上限制了其應(yīng)用潛力。為了克服天然IPA1基因的缺點(diǎn)，充分挖掘該基因的應(yīng)用潛力，研究人員采用“平鋪刪除”(tiling deletion)的基因編輯策略，通過多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)IPA1的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)性、高覆蓋的片段刪除，創(chuàng)制出各種IPA1啟動(dòng)子區(qū)域平鋪刪除的基因編輯材料。在這些基因編輯材料中篩選出1個(gè)分蘗數(shù)和穗粒數(shù)協(xié)同增加的編輯材料IPA1-Pro10。相較于對(duì)照品種，IPA1-Pro10株高變高、莖稈和根系粗壯，穗重和穗數(shù)同步增加，產(chǎn)量顯著增加15.9%。分子機(jī)理研究表明，馴化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子An-1通過結(jié)合IPA1啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的54 bp特定順式元件調(diào)控該基因在幼穗中的表達(dá)，進(jìn)而特異性調(diào)控穗部表型。通過對(duì)IPA1上游調(diào)控序列的平鋪刪除，破除了產(chǎn)量構(gòu)成因子之間負(fù)相關(guān)性的制約，提升了該基因的應(yīng)用潛力[17]。

除產(chǎn)量構(gòu)成因子之間存在負(fù)相關(guān)性外，作物的產(chǎn)量和抗性一般也存在負(fù)相關(guān)性。病原菌通常需要利用植物內(nèi)源的感病基因來侵染植物，感病基因突變會(huì)賦予植物廣譜、持久的抗病性，但往往導(dǎo)致生長發(fā)育的負(fù)面效應(yīng)。比如，小麥白粉病是由真菌（Blumeria graminisf. sp. tritici）引起的小麥重要病害。感病基因MLO的突變可使小麥獲得對(duì)白粉病廣譜持久的抗性，但是同時(shí)可導(dǎo)致矮化、早衰、減產(chǎn)等負(fù)面表型[18-20]。2022年，中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和中科院微生物所通過基因編輯破除了mlo突變體抗病性與產(chǎn)量之間的負(fù)相關(guān)性[21]。研究人員利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制出大量的小麥mlo基因突變體，從中鑒定出既抗白粉病又高產(chǎn)的突變體Tamlo-R32。分子機(jī)理的研究揭示，Tamlo-R32基因組TaMLO-B1位點(diǎn)附近存在約304 kb的大片段刪除，該刪除改變了染色體三維結(jié)構(gòu)，提升了上游基因TaTMT3的表達(dá)。提升的TaTMT3表達(dá)水平克服了mlo突變導(dǎo)致的不利表型。為了培育抗白粉病小麥新品種，研究人員一方面通過傳統(tǒng)雜交和回交的策略將Tamlo-R32的抗病性狀導(dǎo)入主栽品種中；另一方面直接利用基因編輯技術(shù)在小麥主栽品種中創(chuàng)制既抗白粉病又不影響產(chǎn)量的小麥新種質(zhì)。研究人員證實(shí)，相較于常規(guī)育種，基因編輯可以大幅縮短育種進(jìn)程，具有更高的育種效率[21]。

3 利用基因組技術(shù)創(chuàng)制新種質(zhì)

2021年，《Cell》雜志發(fā)表了中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所在異源多倍體水稻研究上的重要進(jìn)展，利用從頭馴化（de novodomestication）策略獲得了異源四倍體水稻新材料[22]。研究人員首先確定生物量大及抗脅迫性強(qiáng)的CCDD型異源四倍體野生稻作為從頭馴化的目標(biāo)材料。通過對(duì)收集的28份異源四倍體野生稻資源的組培再生能力、基因組雜合度及田間綜合性狀等進(jìn)行系統(tǒng)考察，篩選出1份適合做底盤種質(zhì)材料的高稈野生稻資源（Oryza alta），將其命名為PPR1。通過四倍體野生稻的基因組測(cè)序組裝，優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系，再利用基因組編輯技術(shù)改變其落粒性、芒性、株型、籽粒大小及抽穗期等馴化相關(guān)的重要性狀，實(shí)現(xiàn)了異源四倍體高稈野生稻的從頭定向馴化。該研究首次提出了異源四倍體野生稻快速從頭馴化的新策略，旨在最終培育出新型多倍體水稻作物，從而大幅提升糧食產(chǎn)量并增加環(huán)境變化適應(yīng)性[22]。

2021年，《Cell》雜志發(fā)表了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所在雜交馬鈴薯育種領(lǐng)域的突破性進(jìn)展[23]。馬鈴薯是世界上最重要的塊莖類糧食作物，全球約13億人口以馬鈴薯為主食。與其他主糧作物不同，栽培馬鈴薯是同源四倍體物種，依靠塊莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖。由于四倍體生物遺傳上的復(fù)雜性，導(dǎo)致馬鈴薯的遺傳改良效率低、進(jìn)展慢。此外，營養(yǎng)繁殖的方式還造成了薯塊繁殖系數(shù)低、儲(chǔ)運(yùn)成本高、易攜帶病蟲害等長期難以解決的技術(shù)問題。而發(fā)展二倍體雜交馬鈴薯有望從根本上解決上述問題。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所在前期解決馬鈴薯自交不親和、自交衰退等技術(shù)難題的基礎(chǔ)上，通過基因組的大數(shù)據(jù)分析制定育種策略，建立了成熟的雜交馬鈴薯基因組設(shè)計(jì)育種流程，培育出第一代高純合度（＞99%）二倍體馬鈴薯的自交系和雜交馬鈴薯品系優(yōu)薯1號(hào)。小區(qū)試驗(yàn)顯示，優(yōu)薯 1號(hào)的畝（0.067 hm2）產(chǎn)達(dá)近3 t，表現(xiàn)出顯著的產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)[23]。上述研究成果為馬鈴薯育種開辟了新途徑，有望引領(lǐng)馬鈴薯育種進(jìn)入精準(zhǔn)育種和快速迭代的新階段。

2021年，河南大學(xué)利用快速漸滲技術(shù)平臺(tái)改良小麥D亞基因組遺傳多樣性[24]。普通小麥（Triticum aestivumL）為異源六倍體物種，起源于2次雜交和多倍體化，即烏拉爾圖小麥（T. urartu,AA）與擬斯卑爾托山羊草（Aegilops speltoides, SS≈BB）雜交并多倍化，形成AABB四倍體小麥，四倍體小麥與節(jié)節(jié)麥（A. tauschii, DD）雜交并多倍化，形成異源六倍體小麥AABBDD。普通小麥中D基因組的遺傳多樣性明顯低于A和B基因組，僅有A和B基因組的16%左右，是小麥遺傳改良的瓶頸。研究人員首先解析了節(jié)節(jié)麥種群的遺傳多樣性，完成了4個(gè)代表性節(jié)節(jié)麥的高質(zhì)量參考基因組組裝和解析，對(duì)來自全球范圍內(nèi)的278份節(jié)節(jié)麥的種質(zhì)進(jìn)行了重測(cè)序，再通過比較基因組學(xué)剖析和發(fā)掘節(jié)節(jié)麥中的基因組變異。隨后通過整合遠(yuǎn)緣雜交、基因組學(xué)、表型組學(xué)和快速育種等技術(shù)，建立節(jié)節(jié)麥快速漸滲平臺(tái)，創(chuàng)制了85個(gè)節(jié)節(jié)麥核心種質(zhì)與‘矮抗58’等優(yōu)良小麥品種的人工八倍體群體，實(shí)現(xiàn)了節(jié)節(jié)麥自然群體99%的遺傳多樣性向普通小麥品種的轉(zhuǎn)移，為實(shí)現(xiàn)小麥D基因組從頭馴化建立了系統(tǒng)的方法學(xué)和遺傳材料基礎(chǔ)[24]。

4 轉(zhuǎn)基因作物的創(chuàng)制和產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)

我國自1997年開始商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因棉花，經(jīng)過20多年的發(fā)展，我國轉(zhuǎn)基因棉花種植面積占總棉花種植面積的93%以上，國產(chǎn)化率超過95%。由于目前我國的大豆、食用油和玉米進(jìn)口規(guī)模較大、對(duì)外依存度較高，近年來我國開始重視抗蟲、抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米和大豆的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化推廣。我國2019年首次批準(zhǔn)抗蟲、抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆和玉米的安全證書，截至2022年初已有11個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米和3個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆獲得生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，涉及8家單位，包括：杭州瑞豐生物科技有限公司和浙江大學(xué)共同研發(fā)的轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125；上海交通大學(xué)研發(fā)的轉(zhuǎn)g10evo-epsps基因耐除草劑大豆SHZD3201；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所研發(fā)的轉(zhuǎn)g2-epsps和gat基因耐除草劑大豆中黃6106；北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司研發(fā)的轉(zhuǎn)epsps和pat基因耐除草劑玉米DBN9858，轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲耐除草劑玉米DBN9936，轉(zhuǎn)vip3Aa19和pat基因抗蟲耐除草劑玉米DBN9501，轉(zhuǎn)epsps和pat基因耐除草劑大豆DBN9004，轉(zhuǎn)cry1Ab、epsps、vip3Aa19和pat基因抗蟲耐除草劑玉米DBN3601T；中國林木種子集團(tuán)有限公司和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的轉(zhuǎn)mcry1Ab和mcry2Ab基因抗蟲玉米ND207；杭州瑞豐生物科技有限公司研發(fā)的轉(zhuǎn)cry1Ab和cry2Ab基因抗蟲玉米瑞豐8，轉(zhuǎn)CdP450和cp4epsps基因耐除草劑玉米nCX-1；中國種子集團(tuán)有限公司研發(fā)的轉(zhuǎn)cry1Ab、pat和mepsps基因抗蟲耐除草劑玉米 Bt11×GA21，轉(zhuǎn)cry1Ab、pat、vip3Aa20和mepsps基因抗蟲耐除草劑玉米Bt11×MIR162×GA21，轉(zhuǎn)mepsps基因耐除草劑玉米GA21（[25]https://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/）。

值得注意的是，2021年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻‘華恢1號(hào)’及其衍生系Bt汕優(yōu)63在湖北省生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書續(xù)申請(qǐng)獲批[25]。這是‘華恢1號(hào)’及其衍生系Bt汕優(yōu)63的安全證書自2009年首次獲批以來第二次續(xù)申請(qǐng)獲批，為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻未來在我國的迅速產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用儲(chǔ)備了關(guān)鍵技術(shù)。

5 結(jié)語

對(duì)主要作物的重要性狀遺傳基礎(chǔ)的不斷深入解析，為育種新種質(zhì)的創(chuàng)制提供了關(guān)鍵的靶向基因和位點(diǎn)。特別是對(duì)以前育種上關(guān)注不足的野生親緣種質(zhì)和大量農(nóng)家品種的利用和挖掘，大大拓寬了育種上可用的基因資源。近年來，很多重要性狀（如產(chǎn)量、抗性、養(yǎng)分高效利用等）相關(guān)基因都是通過利用野生親緣種或者農(nóng)家品種作為材料鑒定并克隆的。尋找和利用 “丟失的”基因成為創(chuàng)制育種新種質(zhì)的重要手段?？梢灶A(yù)期，在未來很長一段時(shí)間內(nèi)，充分利用野生親緣種或者農(nóng)家品種等遺傳資源來發(fā)掘具有重要育種價(jià)值的基因仍然是研究的熱點(diǎn)之一。

自以CRIPSR系統(tǒng)為代表的基因編輯技術(shù)誕生以來，大家對(duì)基因編輯技術(shù)研究和革新一直保持著很高的研究熱度。從最開始的基因靶向敲除，到單堿基編輯、DNA片段的靶向敲入再到引導(dǎo)編輯等，基因編輯技術(shù)不斷成熟和完善，功能也愈發(fā)的強(qiáng)大，成為生物育種中的重要工具。隨著一些重要農(nóng)藝性狀基因分子機(jī)理的解析，基因編輯對(duì)于保障國家糧食安全、解決日益加劇的世界人口糧食危機(jī)表現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。2022年1月，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定并公布了《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評(píng)價(jià)指南（試行）》，首次規(guī)范了農(nóng)業(yè)基因編輯植物的安全評(píng)價(jià)管理，是我國生物育種技術(shù)研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化的里程碑事件，這標(biāo)志著基因編輯作物在我國正逐步邁入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用階段。從應(yīng)用實(shí)例來看，基因編輯的敲除、敲入以及飽和誘變、平鋪刪除等靈活多變的功能，可以創(chuàng)制自然界不存在的新型等位基因，破除基因自身的有害性狀連鎖。加之，基因編輯技術(shù)可以不引入外源DNA序列，如果可以適當(dāng)簡(jiǎn)化監(jiān)管，基因編輯技術(shù)則可以大大加速植物育種進(jìn)程，成為作物新種質(zhì)創(chuàng)制的一柄利器。

隨著大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成熟，以及基因組組裝的算法和策略的不斷完善，基于基因組層面的設(shè)計(jì)育種和從頭馴化為作物育種提供了全新的思路。從頭馴化的多倍體水稻以及二倍體雜交馬鈴薯的培育等均打破了作物育種固有的常規(guī)育種模式，實(shí)現(xiàn)了從0到1的育種創(chuàng)新?？梢灶A(yù)期，隨著表觀遺傳學(xué)和三維基因組等相關(guān)領(lǐng)域研究的不斷深入，人們將可以從多個(gè)維度來認(rèn)識(shí)作物基因組的表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)模式，必將為基因組層面的育種技術(shù)提供更多理論依據(jù)和新的思路。

長期以來，我國商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要是非食用的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。雖然轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜也實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化種植，但種植面積小，影響力不大。隨著市場(chǎng)需求的不斷增長，近年來我國開始考慮逐步推進(jìn)抗蟲、抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米和大豆的產(chǎn)業(yè)化推廣。2021年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)已獲得生產(chǎn)應(yīng)用安全證書的耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆和抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米開展了產(chǎn)業(yè)化試點(diǎn)工作，增產(chǎn)效應(yīng)和生態(tài)效果顯著。未來，轉(zhuǎn)基因大豆和玉米的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用必將大幅提高我國轉(zhuǎn)基因作物的種植面積，為轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)創(chuàng)造新的局面。同時(shí)，也必將引導(dǎo)和帶動(dòng)更多產(chǎn)業(yè)資本和社會(huì)資本參與到轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)中，極大地加快我國轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)進(jìn)程。