谷慶花，李銘遠，司鑫鑫，高 嵩

(江蘇海洋大學藥學院，江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，江蘇連云港 222005)

殺鮭氣單胞菌()是已知最古老的魚類癤病的病原體，屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬，是一種不能運動、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界中。該菌可引起鮭鱒魚類如大西洋鮭()、褐鱒()、虹鱒()等發(fā)生癤病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。目前對該病的治療主要依賴于抗生素，但抗生素的長期使用已導致耐藥性、藥物濫用等諸多問題的出現(xiàn)。因此，建立一種快速、方便的殺鮭氣單胞菌現(xiàn)場檢測方法，在感染早期對該病原菌進行檢測以便及時采取相應措施，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

針對殺鮭氣單胞菌的傳統(tǒng)檢測方法為分離鑒定法，該方法既繁瑣又耗時，且由于殺鮭氣單胞菌及其亞種的復雜性，很難達到檢測的重復性和特異性要求。近年來，許多分子生物學技術，如常規(guī)PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)等，已被應用于殺鮭氣單胞菌的快速檢測，這些方法的應用使準確檢測病原體所需時間從幾天減少到幾個小時。然而，由于這些方法需要依賴昂貴的儀器設備和專業(yè)的技術人員，且存在引物設計復雜、耗時長等缺點，導致在現(xiàn)場快檢時仍有一定局限。

近幾年來，重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)技術被引入到水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的檢測中。該方法是一種能夠在35～45 ℃的恒溫下實現(xiàn)擴增的技術，利用重組酶UvsX與引物結合并尋找與引物互補的同源序列后，解鎖局部雙鏈DNA，不需對模板高溫變性，隨后單鏈結合蛋白gp32進一步打開雙鏈，最后通過Bsu聚合酶來擴增目標序列，30 min內就可獲得大量的擴增產(chǎn)物。該擴增方法不依賴昂貴的儀器，操作簡單，接近人體溫度就可以進行目的基因的擴增。RPA擴增結束后可結合側向流試紙條(lateral flow strips,LFS)對產(chǎn)物進行終點目視讀出。RPA-LFS的聯(lián)用是一種對設備依賴性小、非常適合現(xiàn)場快檢的技術。本研究建立了一種基于RPA-LFS的殺鮭氣單胞菌檢測方法，為殺鮭氣單胞菌感染的現(xiàn)場快速診斷提供了一種可行的技術選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

溫和氣單胞菌(ATCC 43979)、豚鼠氣單胞菌(ATCC 15468)、維氏氣單胞菌(ATCC 35624)、哈維氏弧菌(ATCC 14126)、 燦爛弧菌(ATCC 33125)和熒光假單胞菌(ATCC 13525)購自美國American Type Culture Collection(ATCC)菌種保藏中心，并用于本研究。殺鮭氣單胞菌(ATCC 33658)、嗜水氣單胞菌(ATCC 13040)、溶藻弧菌(ATCC 17749)、副溶血弧菌(ATCC 17802)、遲緩愛德華氏菌(CICC 10630)、小腸耶爾森氏菌(ATCC 23715)由本實驗室保存。以上菌株均經(jīng)過了16S rRNA測序確認。

1.2 主要試劑及儀器

RPA試劑包括TwistAmp Basic Kit和TwistAmp nfo Kit，購自英國TwistDx Inc公司；核酸檢測試紙條(LFS)及配套緩沖液購自杭州優(yōu)思達生物技術有限公司；手持式第三代組織研磨器購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物及探針的設計與合成

根據(jù)殺鮭氣單胞菌遺傳性質保守的鐵載受體(ferric siderophore receptor,fstA)基因(GenBank accession no.X87995.1)的序列，利用NCBI Primer-BLAST設計特異性引物，參數(shù)設置參考RPA試劑說明書對引物的設計要求。使用Primer Premier 5軟件在引物定義的區(qū)域內設計探針。根據(jù)TwistAmp nfo Kit說明書要求，探針和反向引物的5′端分別修飾FITC和生物素基團；探針序列中部的一個堿基使用四氫呋喃(THF)基團取代，且探針3′端添加可以阻斷聚合酶延伸的SpC3基團。引物和探針[通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司]序列見表1。

1.4 RPA實驗流程及電泳檢測

RPA實驗根據(jù)TwistAmp Basic Kit說明書進行。在50 μL反應體系中，添加1 μL模板，正向、反向引物(10 μmol/L)各2.4 μL，以及試劑盒提供的其他反應成分。通過添加2.5 μL乙酸鎂(280 mmol/L)啟動反應，并在37 ℃孵育30 min。該反應的模板來自細菌培養(yǎng)液，10CFU/mL的殺鮭氣單胞菌培養(yǎng)液經(jīng)100 ℃煮沸10 min后直接用作模板。該反應的擴增產(chǎn)物經(jīng)吸附柱純化后，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.5 RPA-LFS實驗流程

在RPA-LFS實驗中，RPA擴增部分按照TwistAmp nfo Kit說明書進行。在50 μL反應體系中添加正向、反向引物(10 μmol/L)各2.1 μL，探針(10 μmol/L)0.6 μL，1 μL模板，以及試劑盒提供的其他反應成分。通過添加2.5 μL乙酸鎂(280 mmol/L)啟動反應，并在30～45 ℃孵育10～30 min。反應模板來自細菌培養(yǎng)液，首先將各細菌培養(yǎng)液用去離子無菌水稀釋至所需的濃度(濃度單位：CFU/mL)，然后經(jīng)100 ℃煮沸10 min后直接用作模板。RPA擴增完成后，取5 μL擴增產(chǎn)物滴加到核酸檢測試紙條(LFS)的樣品墊上，然后將試紙條的側向流起始端浸入100 μL側向流緩沖液(主要成分為PBS和Tween-20)中。在試紙條上，沿著側向流的方向有樣品墊、金標墊(附有帶FITC抗體的納米金顆粒)、檢測線(標記了鏈霉親和素)、質控線(標記了FITC抗體的二抗)和吸收墊。在側向流試紙條上，擴增產(chǎn)物會結合納米金顆粒并聚集在檢測線上產(chǎn)生陽性信號，而未與擴增產(chǎn)物結合的納米金顆粒會聚集在質控線上指示側向流的完成。在5 min內側向流實驗即可完成。

1.6 人工污染樣本的準備

從本地市場購買健康活鯉，經(jīng)國標培養(yǎng)法(GB/T 15805.6-2008)確認無殺鮭氣單胞菌污染。使用手持式第三代組織研磨器將腸、腎、脾和肌肉組織分別勻漿。將1 g勻漿重懸于10 mL PBS中，并按實驗需要摻入不同量的殺鮭氣單胞菌。將重懸液加熱至100 ℃孵育10 min后，以5 000離心5 min使組織殘留物沉降，取1 μL上清液直接用作人工污染樣本模板。

2 結果

2.1 殺鮭氣單胞菌fstA基因片段的RPA擴增

將殺鮭氣單胞菌的培養(yǎng)液經(jīng)熱處理后制備成模板，進行fstA基因片段的RPA擴增。結果顯示獲得單一條帶，擴增片段長度為255 bp，與預期大小一致(圖1)，表明該對引物可用于RPA擴增殺鮭氣單胞菌的fstA基因片段。

圖1 殺鮭氣單胞菌fstA基因片段的RPA擴增Fig.1 RPA amplification of fstA gene fragment of A.salmonicidaM：DNA分子質量標準；1：以殺鮭氣單胞菌為模板的RPA擴增產(chǎn)物；2：無模板對照

2.2 RPA-LFS反應條件優(yōu)化

為確定RPA-LFS方法的最佳反應條件，對RPA擴增反應溫度和時間進行了篩選。結果表明：RPA-LFS在30～40 ℃溫度范圍內均產(chǎn)生了陽性信號，且信號強度隨著溫度升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當溫度在37 ℃時信號強度最大，檢測線的顯色最明顯(圖2A)。由此確定RPA擴增的最佳反應溫度為37 ℃。然后測試10～30 min之間不同反應時間對結果的影響，結果顯示反應時間為25 min時檢測線的信號最明顯(圖2B)，由此確定RPA擴增的最佳反應時間為25 min。

圖2 RPA-LFS反應條件優(yōu)化Fig.2 Reaction condition of the RPA-LFS method

2.3 RPA-LFS檢測方法的特異性

RPA-LFS方法的反應溫度和時間確定后，應用該方法檢測殺鮭氣單胞菌及其他11種水產(chǎn)常見致病菌模板，結果表明除殺鮭氣單胞菌模板外，其他致病菌模板的RPA-LFS檢測結果均為陰性(圖3)，說明本研究建立的殺鮭氣單胞菌RPA-LFS檢測方法具有良好的特異性。

圖3 RPA-LFS檢測方法的特異性Fig.3 Specificity of the RPA-LFS method

2.4 RPA-LFS檢測方法的靈敏度

使用1×10～5×10CFU的殺鮭氣單胞菌樣本確定RPA-LFS檢測方法的靈敏度和最低檢測限。在此檢測范圍內，RPA-LFS方法均產(chǎn)生了明顯的陽性信號，表明該方法檢測殺鮭氣單胞菌的靈敏度可達到單次反應1 CFU的最低檢測限(圖4)。

圖4 RPA-LFS檢測靈敏度(純培養(yǎng)物)Fig.4 Limit of detection of the RPA-LFS method for pure culture

以上所測為細菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度。為了解在實際檢測中，樣本中其他成分(如魚的組織成分)是否會影響該檢測靈敏度，人工制備了鯉魚組織(包括腸、腎、脾和肌肉)的殺鮭氣單胞菌污染樣本并對檢測靈敏度進行了驗證。單個反應所檢測的鯉魚組織污染樣本中殺鮭氣單胞菌含量的范圍是1×10～1×10CFU。結果顯示，盡管個別信號強度有所減弱，但不同組織污染樣本的檢測靈敏度仍然能達到單次反應1 CFU，未受組織成分的影響(圖5)。因此，本研究建立的殺鮭氣單胞菌RPA-LFS檢測方法的靈敏度為單次反應1 CFU。

圖5 RPA-LFS檢測靈敏度(鯉魚組織污染樣本)Fig.5 Limit of detection of the RPA-LFS method for spiked samples

3 討論

殺鮭氣單胞菌廣泛分布在自然界中，是條件致病菌，一旦爆發(fā)感染就會給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)報道，該菌引發(fā)的疾病每年可造成加拿大水產(chǎn)養(yǎng)殖損失超過4億美元。因此，如何快速準確地檢測該病原菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖等領域顯得十分重要。

目前針對殺鮭氣單胞菌的檢測方法已被陸續(xù)開發(fā)出來。早在1993年，童裳亮等利用ELISA技術建立了快速檢測水樣中殺鮭氣單胞菌的方法；BEAZ-HIDALGO等評估一種新的PCR方案，旨在檢測魚組織中的殺鮭氣單胞菌；SAVAN等根據(jù)基因設計了特異性引物并應用環(huán)介導等溫擴增技術來檢測大西洋鱈魚非典型癤病的病原殺鮭氣單胞菌。但這些方法存在時間跨度長、需要專業(yè)的儀器設備和操作人員，且不能滿足偏遠地區(qū)或資源貧乏地區(qū)的檢測要求。

RPA-LFS是一種近年來發(fā)展起來的對設備依賴性小、簡單、快速的檢測技術，特別適合資源貧乏地區(qū)的現(xiàn)場快速檢測。例如DONG等建立的基于RPA-LFS方法，適用于海水養(yǎng)殖業(yè)的溶藻弧菌致病菌株的現(xiàn)場檢測；彭遙等建立的側流層析-重組酶聚合酶擴增技術在臨床及現(xiàn)場檢測土拉弗朗西斯菌中具有應用前景。本研究建立了一種基于RPA-LFS的殺鮭氣單胞菌可視化快速檢測技術，基于殺鮭氣單胞菌的毒力基因fstA保守區(qū)設計引物和探針，并對反應時間和反應溫度進行了優(yōu)化，結果顯示37 ℃、25 min為最佳反應條件。該方法特異性好，與其他魚類致病菌無交叉反應。該方法靈敏度高，最低檢測限可達單次反應1 CFU。而目前其他檢測方法，包括基于PCR、qPCR和LAMP的檢測方法等，最低檢測限在單次反應10至100 CFU之間。盡管本研究確定靈敏度時將細菌添加到組織勻漿液中，與從細菌感染的組織中提取細菌DNA的效率有所差異，但本研究僅使用熱處理釋放DNA，而未經(jīng)DNA提取純化步驟，說明在粗模板狀態(tài)下該方法的靈敏度是令人滿意的。另外，應用該方法檢測鯉魚組織污染樣本中殺鮭氣單胞菌時，粗模板的檢測靈敏度未受到明顯影響，也印證了RPA擴增可耐受一定擴增抑制劑的特征。此外，用于RPA擴增的反應組分為干粉形式，便于運輸和儲存，這種特性使將RPA-LFS方法組裝成一個“移動手提箱實驗室”成為可能，便于在現(xiàn)場使用。

綜上所述，本研究建立的基于RPA-LFS的殺鮭氣單胞菌可視化快速檢測技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、結果可通過肉眼觀察、不依賴昂貴的儀器設備等優(yōu)點，適用于養(yǎng)殖業(yè)中殺鮭氣單胞菌的現(xiàn)場檢測。