彭一凡，王榮榮，2，莊笑梅，張文鵬，鄧耀辰，高 靜，張 慧，鄭愛萍

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850；2.華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山063210；3.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 東莞 523822）

熱射病是一種嚴(yán)重的中暑，主要臨床表現(xiàn)為核心體溫＞40℃，皮膚干熱，中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，嚴(yán)重時可出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）［1］。熱射病發(fā)病急驟，臨床表現(xiàn)兇險，病死率和病殘率極高，目前國內(nèi)外均無用于該病治療的特效藥上市。

姜黃素（curcumin）是一種從姜黃中提取的酸性酚類化合物，在抗炎、抗氧化、抗感染、抗腫瘤和降血脂等方面有很好的療效，且尚未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，具有廣闊的開發(fā)前景［2-7］。研究表明，姜黃素對熱射病引起的肺損傷［8，12］、心肌損傷［9，18］、肝損傷［11］、腎損傷［15］、腦損傷［13］和腸黏膜病理損傷［10，17］均有良好的改善作用，并能維持血液指標(biāo)穩(wěn)定［14］，糾正電解質(zhì)紊亂［16］，是防治熱射病的良好藥物。然而，姜黃素屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)4類藥物（水中溶解度僅為11 μg·L-1［19］），其難溶性嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用。

納米晶制劑具有可提高藥物飽和溶解度和溶出速率、降低食物效應(yīng)、藥物劑量調(diào)整范圍寬、不良反應(yīng)輕、易于工業(yè)化生產(chǎn)和劑型多樣化等優(yōu)勢［20-28］。為解決溶解度低的問題，本研究采用目前上市納米晶藥物最常用的介質(zhì)研磨技術(shù)，選用硬度高、雜質(zhì)殘留少、符合美國FDA認(rèn)證的氧化鋯珠進(jìn)行介質(zhì)研磨［29］，制備穩(wěn)定的姜黃素納米晶混懸液，以提高姜黃素的溶解度和溶出速率，進(jìn)而提高生物利用度，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

姜黃素（批號：20201027），陜西億康龍生物技術(shù)有限公司。吐溫80（批號：20180801），江西益普生藥業(yè)有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，批號：WXBC1167V），上海麥克林生化科技有限公司；冰醋酸（批號：20190325），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。激光粒度儀（Nano-ZS90），英國Malvern公司；研磨機（DYNO?-MILL ECM-AP05），華爾寶機械有限公司；溶出試驗儀（RC806D），天津市天大天發(fā)科技有限公司；磁力攪拌器（HJ-3），常州金壇晨陽電子儀器廠；冷凍干燥機（LGJ-18C），北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；真空干燥箱（DZF-6050），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀（UltiMate 3000），美國Thermo公司；X射線衍射儀（D8 advance），德國布魯克公司；差示掃描量熱儀（DSC 200F3），德國NETZSCH公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM-7900F）和透射電子顯微鏡（JEM-1400Plus），日本電子株式會社；電子分析天平（BT-25S），德國Sartorius公司。

1.2 動物

12只SD大鼠，雄性，體重200～230 g，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，許可證號：SCXK（京）2018-0010。大鼠置于溫控22～25℃、相對濕度40%～50%、12/12 h晝夜明暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)7 d，自由飲水?dāng)z食。本研究涉及的動物實驗經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，審查編號IACUCDWZX-2020-639。

1.3 姜黃素納米晶混懸液制備工藝

采用介質(zhì)研磨法制備姜黃素納米晶混懸液。稱取處方量的吐溫80加蒸餾水溶解，獲得穩(wěn)定劑溶液，將適量姜黃素原料藥均勻分散于穩(wěn)定劑溶液中，然后將混懸液轉(zhuǎn)移到研磨機中（填充60%0.3 mm氧化鋯珠），開啟研磨機將轉(zhuǎn)速升至3000 r·min-1，研磨得到目標(biāo)粒徑的納米混懸液。

1.4 Box-Behnken實驗優(yōu)化姜黃素納米晶處方工藝

預(yù)實驗研究發(fā)現(xiàn)，研磨轉(zhuǎn)速、姜黃素用量和穩(wěn)定劑與藥物的比例是影響納米晶粒徑的關(guān)鍵參數(shù)。本研究采用Box-Behnken設(shè)計系統(tǒng)研究3種關(guān)鍵參數(shù)對納米晶粒徑的影響，根據(jù)預(yù)實驗對3個關(guān)鍵參數(shù)范圍的篩選，確定穩(wěn)定劑與原料藥質(zhì)量比（A）為1∶10～1∶2，姜黃素質(zhì)量百分比（B）為10%～30%，轉(zhuǎn)速（C）為1500～3000 r·min-1。使用軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行實驗設(shè)計，共進(jìn)行17次實驗，每次研磨30 min，設(shè)計方案見表1。對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，預(yù)測最優(yōu)處方工藝。

Tab.1 Design and result data on Box-Behnken test for optimizing formation process of curcumin nanocrystalline suspensions

1.5 姜黃素納米晶混懸液粒度和Zeta電位測定

納米晶混懸液在不同溫度下儲存，監(jiān)測放置期間的穩(wěn)定性。定期取適量姜黃素納米晶混懸劑，蒸餾水稀釋至40 mg·L-1，采用Nano-ZS90粒度分析儀測定姜黃素納米晶的粒度、多分散系數(shù)和Zeta電位，測定溫度25℃，平衡時間60 s，每個樣品測量3次。

1.6 姜黃素納米晶形態(tài)觀察

分別采用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察姜黃素納米晶混懸液的形態(tài)及分布特征。取1滴稀釋后的納米晶混懸液滴于SEM樣品臺上，自然晾干后噴金進(jìn)行SEM觀察；取1滴稀釋后的納米晶混懸液滴于載樣銅網(wǎng)上，室溫置5 min后用濾紙吸干，加3%磷鎢酸負(fù)染5 min，自然晾干后在加速電壓100 kV下進(jìn)行TEM觀察。

1.7 X-射線粉末衍射分析（X-ray powder diffraction，XRPD）姜黃素納米晶制劑晶型

取姜黃素原料藥、空白輔料（吐溫80）、物理混合物（姜黃素原料藥和吐溫80）、納米晶混懸液凍干粉末和納米晶混懸液真空干燥粉末各適量，進(jìn)行XRPD測定。工作條件為管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描范圍3～40°，掃描速度每步停0.1 s，步長0.02°。所得結(jié)果繪制XRPD曲線圖，根據(jù)姜黃素衍射峰變化判斷晶型的變化。

1.8 差示掃描量熱分析（differential scanning calorimetry，DSC）姜黃素納米晶制劑晶型

取姜黃素原料藥、空白輔料（吐溫80）、物理混合物（姜黃素原料藥和吐溫80）、納米晶混懸液凍干粉末和納米晶混懸液真空干燥粉末各適量于鋁坩堝中，蓋上扎孔，進(jìn)行測試。工作條件為氮氣流速20 mL·min-1，以 10℃·min-1的速度由 28℃升至300℃，測得結(jié)果繪制DSC曲線圖，根據(jù)姜黃素吸熱峰位和強度的變化判斷晶型的變化。

1.9 體外溶出實驗

參考2020版《中華人民共和國藥典》收載的姜黃素高效液相色譜（HPLC）法，結(jié)合本研究的特點，對流動相比例進(jìn)行了相應(yīng)調(diào)整，建立HPLC法測定姜黃素含量。色譜條件：色譜柱為Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-4%冰醋酸溶液（55∶45，V/V）；檢測波長430 nm；柱溫30℃；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。

采用2020版《中華人民共和國藥典》中的槳法考察不同粒徑姜黃素混懸液的溶出特性。取含姜黃素90 mg的各混懸液，加入900 mL溶出介質(zhì)（1%SDS水溶液）中，轉(zhuǎn)速75 r·min-1，溫度為37℃。分別于5，10，15，20，30，45，60，90，120和180 min取樣10 mL，用0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾，收集濾液，HPLC法測定其中姜黃素濃度，計算累積溶出度并繪制溶出曲線。累積溶出計算公式：Xi累積=Xi+（X1+X2+Xi-1）V2/V1。其中，Xi為第i次實際測得的相對百分溶出度，Xi累積為第i次經(jīng)校正后的累積百分溶出度，V1為溶出介質(zhì)總體積，V2為每次取樣后的補液體積。

1.10 藥動學(xué)實驗

將12只健康雄性SD大鼠隨機分為2組，分別ig給予姜黃素原料藥混懸液和姜黃素納米晶混懸液，給藥前禁食12 h，自由飲水。按照劑量為200 mg·kg-1ig給藥后，分別于0.125，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12 和 24 h 大鼠眼眶采血 0.5 mL，置EDTA-K2抗凝管中，2500×g離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至空白Ep管中，-20℃保存。

采用HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用法測定每個時間點的血藥濃度。分析條件：流動相A相為水（含0.1%甲酸），B相為乙腈（含0.1%甲酸）；梯度洗脫：0～0.3 min，10%B；0.3～2.5 min，10%B→95%B；2.5～3.0 min，95%B；3.0～4.0 min，10%B；流速為0.7 mL·min-1；柱溫40℃；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式測定姜黃素（m/z為369.3/177.1）的濃度，普萘洛爾作內(nèi)標(biāo)（m/z為260.1/116.1），離子源為電噴霧離子源。準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率和穩(wěn)定性等均符合要求。

取待測血漿樣本25 μL，加β-葡萄糖醛酸苷酶2.5 μL，混勻后37℃孵育1 h，再加100 μL內(nèi)標(biāo)工作液（50 μg·L-1），混勻后于4℃，2500×g離心10 min；取上清液 70 μL，加 50% 乙腈 210 μL 混勻，于 4℃，2500×g離心2 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用DAS 2.0軟件以非房室模型分析方法計算藥代動力學(xué)參數(shù)，由IBM SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化的姜黃素納米晶處方工藝

按Box-Behnken設(shè)計實驗優(yōu)化納米晶混懸劑的處方工藝，通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸擬合，得各實驗因子對粒徑影響的回歸方程：Y=250.84+5.55A+12.86B-56.56C+2.92AB+2.28AC-17.90BC+1.83A2-4.75B2+23.16C2，基中A：穩(wěn)定劑與原料藥質(zhì)量比；B：姜黃素質(zhì)量百分比；C：研磨轉(zhuǎn)速，方差分析結(jié)果見表2?；貧w方程擬合模型P值為0.0002，表明模型有效可靠，失擬項P＞0.05，表明模型與實際值差異較小，采用該實驗設(shè)計優(yōu)化處方工藝可信度高。除線性關(guān)系外，各參數(shù)間還存在交互影響，其中B，C，BC和C2對粒徑的影響最為顯著，所考察參數(shù)與粒徑關(guān)系的響應(yīng)面分析見圖1。由圖1可知，穩(wěn)定劑與原料藥質(zhì)量比-姜黃素質(zhì)量百分比的響應(yīng)面圖坡度平緩，表明二者交互作用弱，對粒徑影響??；穩(wěn)定劑與原料藥質(zhì)量比-轉(zhuǎn)速的響應(yīng)面圖較陡，但作用主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)速方面；姜黃素質(zhì)量百分比-轉(zhuǎn)速響應(yīng)面圖坡度較陡，說明轉(zhuǎn)速、姜黃素質(zhì)量百分比以及二者的交互作用對粒徑影響顯著。根據(jù)軟件分析結(jié)果，得制備姜黃素納米晶口服混懸劑的最優(yōu)參數(shù)為：穩(wěn)定劑與原料藥質(zhì)量比1∶10，姜黃素質(zhì)量百分比30%，轉(zhuǎn)速3000 r·min-1，理論上得到粒徑198.731 nm的混懸液，按該參數(shù)制備的姜黃素納米晶混懸液粒徑實測值為（202.3±1.2）nm（n=3），與理論值極為接近，說明優(yōu)化結(jié)果預(yù)測性優(yōu)良。

Tab.2 Results obtained from ANOVA of Box-Behnken experiment design

Fig.1 Response surface diagrams of three parameters and their interactions with particle size.See Tab.1 for the results of the 17 experiments designed.The response surface diagrams were drawn with Minitab software.A：the 3D surface（A1）and contour（A2）of stabilizer：API-curcumin mass percentage；B：the 3D surface（B1）and contour（B2）of stabilizer：API-grinding speed；C：the 3D surface（C1）and contour（C2）of curcumin mass percentage-grinding speed.

2.2 納米晶混懸液粒度和Zeta電位的穩(wěn)定性

納米晶混懸液穩(wěn)定性考察結(jié)果（表3）表明，制劑在4，25和40℃條件下，關(guān)鍵質(zhì)量屬性粒徑和多分散系數(shù)在2個月時間內(nèi)均無明顯變化，姜黃素顆粒尺寸始終維持在約200 nm，且電位無明顯變化，表明處方穩(wěn)定性良好，后續(xù)穩(wěn)定性考察正在進(jìn)行中。

Tab.3 Stability of nanocrystalline suspensions at different temperatures

2.3 姜黃素納米晶形態(tài)

采用SEM和TEM對姜黃素納米晶的形態(tài)及分布進(jìn)行表征（圖2和3）。據(jù)2種電鏡表征結(jié)果，混懸液中姜黃素納米晶形狀不規(guī)則，實際粒徑約為200 nm，產(chǎn)品粒度分布較為均一，與2.2穩(wěn)定性考察中粒度分析儀所測結(jié)果基本相符。

Fig.2 Scanning electron microscope（SEM）characterization of curcumin nanocrystals.A，B，C and D were the nanocrystals observed under 5000，10 000，10 000，and 20 000 magnifications respectively

Fig.3 Transmission electron microscope（TEM）characterization of curcumin nanocrystals.A，B，C and D were the nanocrystals observed under 10 000，50 000，50 000，and 40 000 magnifications respectively.

2.4 姜黃素納米晶制劑對晶型的影響

繪制姜黃素原料藥、空白輔料、物理混合物和納米晶的XRPD圖譜（圖4），可見穩(wěn)定劑吐溫80常溫下為液體，無特征衍射峰，而姜黃素原料藥在6～30°范圍內(nèi)有特征衍射峰，為結(jié)晶態(tài)。相比于物理混合物，制成納米晶后衍射峰位置無顯著變化，表明以吐溫80為穩(wěn)定劑的納米晶晶型未發(fā)生顯著改變。

Fig.4 X-ray powder diffraction patterns of curcumin nanocrystalline suspensions，APl and preparation excipients.1：API；2：Tween 80；3 and 4 were the physical mixture of vacuum drying and freeze drying respectively；5 and 6 were vacuum-dried and freeze-dried nanocrystals，respectively.

姜黃素吸熱峰約在183℃，吐溫80常溫下為液體，吸熱峰＜0℃，對物理混合物和納米晶峰形無影響。納米晶吸熱峰位置和強度較物理混合物均無明顯變化，與XRPD結(jié)果相印證，表明該處方晶型基本未發(fā)生改變，且干燥方式對晶型無明顯影響（圖5）。

Fig.5 Differential scanning calorimetry（DSC）thermograms of curcumin nanocrystalline suspensions，APl and preparation excipients.1：API；2：Tween 80；3 and 4 were the physical mixture of vacuum drying and freeze drying，respectively；5 and 6 were vacuum-dried and freeze-dried nanocrystals，respectively.

2.5 粒徑對姜黃素體納米晶混懸液外溶出的影響

利用槳法考察不同粒徑姜黃素納米晶混懸液的溶出特性，其體外溶出效果見圖6。未經(jīng)研磨的姜黃素原料藥3 h累積釋放為（81.5±0.5）%，未完全溶出。與原料藥組比較，隨著粒徑減小，2 μm，500 nm和200 nm組姜黃素溶出速率顯著增加（P＜0.01），原料藥、2 μm、500 nm和200 nm納米晶樣品5 min累積溶出分別為（23.8±1.6）%，（52.1±2.3）%，（84.4±2.6）%和（100.7±1.2）%，其中平均粒徑200 nm的姜黃素納米晶在5 min內(nèi)即可完全溶出，表明將姜黃素粒徑減小到約200 nm能顯著提高其溶出度及溶出速率，促進(jìn)體外釋放。

Fig.6 In vitro dissolution curves of curcumin nanocrystalline suspensions and APl of different particle sizes.The suspension samples of each group were added to 900 mL dissolution medium at a speed of 75 r·min-1and a temperature of 37℃.The dissolution samples were collected at 5，10，15，20，30，45，60，90，120 and 180 min，and the concentration of curcumin was determined by HPLC.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 5 min cumulative dissolution of API；##P＜0.01，compared with 2 μm group；ΔΔP＜0.01，compared with 500 nm group.

2.6 姜黃素納米晶大鼠體內(nèi)藥動學(xué)

2組藥動學(xué)參數(shù)見表5，藥時曲線如圖7。姜黃素原料藥組和納米晶混懸液的Tmax與T1/2均無統(tǒng)計學(xué)差異，表明制成納米晶未對姜黃素的達(dá)峰時間和半衰期產(chǎn)生顯著影響。與原料藥混懸液相比，姜黃素納米晶混懸液的MRT（0-t）明顯降低（P＜0.05），Cmax和AUC（0-t）均顯著升高（P＜0.01），姜黃素納米晶制劑Cmax是原料藥的7.75倍，相對生物利用度可達(dá)461%，表明將姜黃素原料藥制成納米晶制劑后能顯著提高姜黃素的體內(nèi)生物利用度。

Tab.5 Pharmacokinetic parameters of curcumin nanocrystalline suspension and APl in rats

Fig.7 Plasma concentration-time curves of curcumin nanocrystalline suspensions and APl.See Tab.5 for rat treatment.±s，n=6.

3 討論

本研究采用介質(zhì)研磨技術(shù)制備了姜黃素納米晶混懸液。為更客觀有效地評價各因素對姜黃素粒徑的影響，提高納米晶制備效率，采用Box-Behnken設(shè)計對處方工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳參數(shù)為姜黃素質(zhì)量百分比30%，轉(zhuǎn)速3000 r·min-1，穩(wěn)定劑與原料藥質(zhì)量比為1∶10，按此處方工藝可高效穩(wěn)定地制備粒度與軟件預(yù)測結(jié)果相符的口服混懸劑。表明實驗設(shè)計在納米晶處方工藝優(yōu)化方面有很高的應(yīng)用價值，能極大提高處方工藝的篩選效率。SEM、TEM以及粒度分析表征結(jié)果一致，表明制備的姜黃素納米晶粒徑接近200 nm且分布較為均一，處方在4℃、室溫和40℃條件下粒度均未發(fā)生明顯改變，具有良好的穩(wěn)定性（＞60 d）。XRPD和DSC考察表明，姜黃素制成納米晶混懸液前后晶型基本未發(fā)生改變。

通過制備不同粒徑的姜黃素納米晶混懸液，比較其體外溶出效果，表明減小姜黃素粒徑能有效改善其溶出行為，研磨至200 nm的納米晶增溶效果顯著。本研究結(jié)果表明，姜黃素納米晶混懸液體內(nèi)吸收迅速，與體外溶出速率的增加相符，該制劑在大鼠體內(nèi)的峰值濃度和生物利用度分別達(dá)到原料藥的7.75和4.61倍，優(yōu)勢明顯。

本研究制備了室溫下放置穩(wěn)定的姜黃素納米晶混懸液，確定了最優(yōu)的處方工藝，顯著提高姜黃素的體外溶出度和體內(nèi)生物利用度，為充分發(fā)揮其藥理活性奠定了基礎(chǔ)。相關(guān)研究構(gòu)建的難溶性藥物增溶關(guān)鍵技術(shù)體系具有普適性，可為后續(xù)新藥研發(fā)提供新思路。