駱玲玲，朱梓睿，趙馨媛，王婷婷，張麗慧，楊 怡

（杭州師范大學(xué)藥學(xué)院，浙江省欖香烯類抗癌中藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省中藥資源開發(fā)與應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室，浙江省協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 311121）

雙硫侖（disulfiram），商品名為戒酒硫（Antabuse），是一種二硫代氨基甲酸鹽，分子式為C10H20N2S4，水溶解度約為0.2 g·L-1。雙硫侖的代謝產(chǎn)物可通過抑制乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）使嗜酒者血乙醛濃度升高，產(chǎn)生面部潮紅、頭痛、惡心、嘔吐等不適感而放棄酗酒，從而達(dá)到戒酒的目的［1］。1948年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)雙硫侖用于臨床治療酒精依賴癥，至今已在臨床使用70余年［2］。此外，雙硫侖也用作橡膠硫化促進(jìn)劑，在化工領(lǐng)域使用。

研究發(fā)現(xiàn)，除治療酒精依賴癥外，雙硫侖還具有多種藥理作用，如抗炎［3-4］、抗菌［5-6］、抗病毒［7-8］和調(diào)節(jié)代謝［9］。近年來(lái)，大量細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，雙硫侖具有廣譜抗腫瘤活性，能抑制多種人源腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成等，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡［10-11］。此外，雙硫侖的抗腫瘤作用與其可螯合二價(jià)銅離子（Cu2+）密切相關(guān)，二價(jià)銅離子可顯著增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)。2017年，Nature首次報(bào)道雙硫侖抗腫瘤作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［12］。目前，雙硫侖抗腫瘤治療的臨床試驗(yàn)在歐美國(guó)家廣泛進(jìn)行，但關(guān)于其針對(duì)實(shí)體瘤的療效目前還無(wú)法明確。本文就雙硫侖抗腫瘤作用及其作用機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為拓寬其臨床應(yīng)用提供思路。

1 體內(nèi)代謝

雙硫侖相對(duì)分子質(zhì)量約296，由巰基、乙基和秋蘭姆結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其中巰基基團(tuán)對(duì)其抗腫瘤作用的發(fā)揮具有重要意義［13］?？诜?，80%～90%被胃腸道吸收，1%～20%隨糞便排出［14］，半衰期約7.3 h。雙硫侖在人體組織內(nèi)廣泛分布，在腎、胰腺、肝和胃腸道中濃度較高［15］。雙硫侖主要在肝內(nèi)代謝，雙硫鍵斷開后生成兩分子二乙基二硫代氨基甲酸酯（diethyldithiocarbamate，DDC）［16-17］。DDC 是強(qiáng)效金屬螯合物，通過巰基基團(tuán)與多種重金屬離子螯合，尤其是二價(jià)銅離子。DDC在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，與Cu2+形成復(fù)合物二乙基二硫代氨基甲酸銅〔copper diethyldithiocarbamate，Cu（DDC）2〕。 Cu（DDC）2較DDC更穩(wěn)定，自身也具有抗腫瘤活性（圖1）。更重要的是，與其他組織（如肝和腦組織等）和血液相比，Cu（DDC）2在腫瘤組織中的濃度明顯增高［12］，顯示出特異性抗腫瘤的優(yōu)勢(shì)和潛力。

圖1 雙硫侖（DSF）聯(lián)合銅離子廣泛影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能.DDC：二乙基二硫代氨甲酸酯；Cu（DDC）2：二乙二硫代氨甲酸銅；ROS：活性氧；↑：誘導(dǎo)或促進(jìn)；⊥：降低或抑制.

2 抗腫瘤作用機(jī)制

雙硫侖通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，如抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；干擾細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解。另外，可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低線粒體膜電位，抑制ALDH，削弱腫瘤細(xì)胞干性，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性等（圖1）。Cu2+可明顯增強(qiáng)雙硫侖的抗腫瘤效應(yīng)。

2.1 抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移

大量細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙硫侖抗瘤譜較廣，對(duì)乳腺癌［18-20］、肝癌［21-22］、肺癌［13，23］、胰腺癌［20，24-25］、膠質(zhì)瘤［26-27］和前列腺癌［28］等癌細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。雙硫侖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)可能與其干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期有關(guān)。對(duì)人乳腺癌MCF7、人非小細(xì)胞肺癌A549和急性髓系白血病KG-1細(xì)胞，單用雙硫侖或其聯(lián)合Cu2+可致G0/G1期和S期細(xì)胞周期阻滯［29-31］。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，而血管生成則是影響該過程的重要因素之一。研究表明，雙硫侖抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，抑制血管形成［32-34］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1處理人舌鱗癌SCC-25和CAL-27細(xì)胞，該細(xì)胞出現(xiàn)上皮-間充 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），而雙硫侖可通過調(diào)控EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)，如上調(diào)E鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)、下調(diào)波形蛋白（vimentin）和Snail蛋白表達(dá)，有效抑制該細(xì)胞EMT，阻滯細(xì)胞遷移和侵襲［35-36］。雙硫侖聯(lián)合Cu2+可抑制肝癌細(xì)胞NF-κB、下調(diào)EMT的關(guān)鍵因子Snail和Slug蛋白表達(dá)［22］。此外，其通過阻斷Ⅳ型膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）和MMP-9的活性，抑制高轉(zhuǎn)移人肺腺癌CL1-5細(xì)胞、人膀胱腺癌NTUB1細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲能力［33］。人惡性膠質(zhì)瘤U87荷瘤裸鼠給予雙硫侖和葡萄糖酸銅治療，能減少血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌，抑制腫瘤新生血管生成［34］。

2.2 調(diào)控氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

雙硫侖代謝為DDC后，DDC與Cu2+螯合，使細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平異常升高，誘發(fā)細(xì)胞毒性。以雙硫侖處理口腔鱗癌細(xì)胞系，可上調(diào)ROS，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［37］。雙硫侖對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用可能與其激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器肌醇必需酶1α，使X-盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）剪切形成功能活躍的轉(zhuǎn)錄因子XBP1，調(diào)控下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP基因表達(dá)相關(guān)［38］。雙硫侖聯(lián)合Cu2+處理人乳腺癌SUM149細(xì)胞后，細(xì)胞線粒體和胞漿內(nèi)超氧自由基水平顯著升高，超氧化物歧化酶1和還原型谷胱甘肽含量明顯減少［39］。對(duì)來(lái)自多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)雙硫侖和Cu2+降低線粒體膜電位，增加ROS生成，活化胱天蛋白酶，引起細(xì)胞凋亡，而上述作用可被抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸逆轉(zhuǎn)［40］。也有學(xué)者指出，雙硫侖和Cu2+可能在短期內(nèi)通過生成ROS觸發(fā)人乳腺癌MCF7細(xì)胞損傷，長(zhǎng)期處理可通過其他信號(hào)通路引起該細(xì)胞死亡［41］。ROS作為信號(hào)分子，在體內(nèi)半衰期短，活性有限［42］。因此，雙硫侖和Cu2+必須在腫瘤細(xì)胞或鄰近腫瘤細(xì)胞的位置發(fā)揮作用。

2.3 干擾細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解

有研究團(tuán)隊(duì)指出，雙硫侖的抗腫瘤作用并非依賴于對(duì)ALDH的抑制。雙硫侖代謝產(chǎn)物與Cu2+結(jié)合，結(jié)合物與核蛋白定位蛋白4結(jié)合并促進(jìn)該蛋白聚集，從而干擾p97/含纈酪肽蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解，誘發(fā)人肺癌A549和人骨肉瘤U-2OS等細(xì)胞死亡［12，43］，提示雙硫侖的抗腫瘤效應(yīng)可能與其干擾細(xì)胞內(nèi)正常蛋白質(zhì)降解通路有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)主要通過泛素-蛋白酶體和自噬-溶酶體途徑降解。研究表明，雙硫侖或其聯(lián)合Cu2+可有效抑制蛋白酶體功能，改變?nèi)苊阁w酸性環(huán)境，使蛋白質(zhì)得不到及時(shí)清除而引起食管鱗癌和乳腺癌細(xì)胞損傷［44-45］。

3 提高腫瘤細(xì)胞放、化療敏感性

研究顯示，雙硫侖可增強(qiáng)化療藥物的作用。雙硫侖與其他臨床常用化療藥物（如順鉑和紫杉醇等）聯(lián)合使用，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，提高抑瘤效果［46-47］。睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者腫瘤組織高表達(dá)ALDH1亞型ALDH1A3［46］。在荷瘤小鼠模型中，雙硫侖和順鉑聯(lián)合用藥可降低生殖細(xì)胞移植瘤內(nèi)ALDH1A3的表達(dá)，抑制移植瘤在體生長(zhǎng)［46］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)，雙硫侖聯(lián)合Cu2+可降低紫杉醇耐藥人肺癌A549細(xì)胞和長(zhǎng)春新堿耐藥人口腔上皮癌KB細(xì)胞內(nèi)ALDH活性，逆轉(zhuǎn)耐藥［47］。

腫瘤干細(xì)胞是具有自我更新能力，產(chǎn)生異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞，是導(dǎo)致化療耐藥和放療抵抗的關(guān)鍵原因。ALDH是ROS清道夫，有助于消除氧化應(yīng)激，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，在腫瘤干細(xì)胞中表現(xiàn)出較高活性［48］。在乳腺癌來(lái)源的腫瘤干細(xì)胞中，雙硫侖抑制ALDH，抑制腫瘤細(xì)胞干性，增加ROS蓄積，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡［19］。與單獨(dú)放療組相比，軟骨肉瘤荷瘤小鼠給予雙硫侖聯(lián)合Cu2+放療可更有效降低ALDH+CD133+腫瘤細(xì)胞百分比，抑制腫瘤細(xì)胞干性，阻止腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間［49］。

因此，雙硫侖或可作為輔助治療手段之一，通過抑制ALDH活性提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，用于臨床難治性和耐藥腫瘤的治療。

4 抗腫瘤臨床試驗(yàn)療效

目前，雙硫侖用于治療腫瘤的臨床試驗(yàn)主要在歐美國(guó)家展開。截至2022年1月23日，在臨床試驗(yàn)注冊(cè)網(wǎng)站（https：//clinicaltrials.gov/）共檢索到21項(xiàng)相關(guān)研究，其中最早的1項(xiàng)自2002年啟動(dòng)，部分試驗(yàn)仍在進(jìn)行中。如表1所示，涉及膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌等實(shí)體瘤患者的臨床Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ期研究。在藥物干預(yù)方面，腫瘤患者除口服給予雙硫侖（250或500 mg·d-1）外，部分研究加用Cu2+（如葡萄糖酸銅），聯(lián)合常規(guī)化療藥治療。部分臨床試驗(yàn)已獲得初步結(jié)果，非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤等患者對(duì)雙硫侖的耐受性得到了驗(yàn)證［50-52］。對(duì)丹麥2000-2013年間首次確診的所有腫瘤患者（35～85歲，排除肝和腎疾病）的流行病學(xué)分析結(jié)果顯示，堅(jiān)持服用雙硫侖的患者比停用的患者腫瘤相關(guān)死亡率低［12］。在傳統(tǒng)化療方案的基礎(chǔ)上加用雙硫侖，可延長(zhǎng)初診非小細(xì)胞肺癌患者的生存時(shí)間［50］。如能在臨床試驗(yàn)中獲得滿意療效，雙硫侖極有可能作為一種全新的廉價(jià)腫瘤治療藥物造福腫瘤患者。然而，也有臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，雙硫侖和二價(jià)銅離子并未顯著提高替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的治療結(jié)果［52］。因此，雙硫侖抗腫瘤的療效還需更多的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

5 雙硫侖藥物遞送系統(tǒng)

盡管雙硫侖在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中顯示出優(yōu)越的抗腫瘤效應(yīng)，但因其穩(wěn)定性差、半衰期短、快速代謝等問題，限制了其臨床應(yīng)用［53］。如何提高雙硫侖的穩(wěn)定性是近期研究的熱點(diǎn)之一。因此，研究人員致力于改良藥物遞送系統(tǒng)，提高雙硫侖的抗腫瘤效應(yīng)。

通過物理封裝，將雙硫侖包裹在納米顆粒［54-58］或納米結(jié)晶［59-60］中進(jìn)行藥物遞送，有望改善藥物的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特征，這些遞送系統(tǒng)各具優(yōu)勢(shì)。例如，摻雜Cu2+并負(fù)載雙硫侖的中空介孔二氧化硅納米顆粒，利用腫瘤微環(huán)境，將二者特異性導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，而不影響周圍正常細(xì)胞［54］。這種納米催化腫瘤治療的方法具有靶向性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。以修飾改良的脂質(zhì)納米顆粒為載體遞送雙硫侖，提高載藥量、包封率和靶向性，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間［56-58］。雙硫侖與紫杉醇納米晶體可提高紫杉醇耐藥人肺癌A549細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性［59-60］。改良后的雙硫侖制劑，將有助于提高藥物穩(wěn)定性、載藥量和特異性，突破腫瘤耐藥瓶頸，在提高療效的同時(shí)保證安全性。

表1 雙硫侖治療腫瘤臨床試驗(yàn)

6 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙硫侖具有廣譜抗腫瘤潛力，為老藥新用提供新思路。雙硫侖臨床應(yīng)用的安全性已得到廣泛確認(rèn)，研發(fā)過程可免去已有的藥動(dòng)學(xué)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)，因此可大大縮短藥物開發(fā)時(shí)間和研發(fā)成本。盡管如此，關(guān)于雙硫侖治療腫瘤有效性的臨床資料還十分有限，需要更多數(shù)據(jù)資料支持。在臨床試驗(yàn)中，雙硫侖多以口服方式給藥，由于其生物利用度低、體內(nèi)易代謝降解等問題，其與Cu2+螯合物在腫瘤組織水平仍然較低，影響抗腫瘤效應(yīng)的發(fā)揮。此外，雙硫侖和Cu2+具有不同的藥動(dòng)學(xué)特征，單一制劑分別給藥難以發(fā)揮最優(yōu)的協(xié)同作用。因此，靶向腫瘤治療的雙硫侖新劑型的設(shè)計(jì)和研發(fā)，也將有望彌補(bǔ)其穩(wěn)定性差、半衰期短等缺陷，使其在臨床廣泛應(yīng)用。