張 慧，郭曉梅，白 婧，張森林，孫 群

(1. 四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610064;2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610064)

0 引 言

沙門氏菌(Salmonella)是引起微生物性食源性疾病最常見的致病菌之一[1]。每年全球范圍內(nèi)大約94 000 000人因感染沙門氏菌而引起腸炎，其中約155 000人死亡[2]。2008年到2015年，我國食品中毒事件中，因微生物導(dǎo)致的食物中毒事件占60%以上，而在所有致病菌中，沙門氏菌占比為23%，居于首位[3]。自然界中，幾乎所有細(xì)菌都是以生物被膜的形式存在，只有約0.1%的細(xì)菌處于浮游狀態(tài)[4]。研究表明，生物被膜是造成食品污染、導(dǎo)致微生物性食源性疾病爆發(fā)的重要原因。據(jù)估計，約65%的食源性微生物污染由生物被膜狀態(tài)的致病菌引起[5]。成熟生物被膜胞外基質(zhì)的阻隔性以及休眠狀態(tài)的里層細(xì)菌導(dǎo)致其對各種極端環(huán)境及壓力的抗性相對于浮游菌進(jìn)一步增強[6]，從而使得常規(guī)的消毒滅菌處理效果不佳，而且消毒殺菌劑的大量使用使得細(xì)菌產(chǎn)生抗性[7]。有研究表明次氯酸鈉濃度提高5倍也無法完全殺滅生物被膜里層腸炎沙門氏菌[8]。由此可見，生物被膜一旦成熟，難以完全清除，其導(dǎo)致的一系列問題如耐藥性的出現(xiàn)或增強，將會給食品安全造成巨大的潛在威脅。因此，預(yù)防生物被膜形成對于保證食品安全是十分迫切且重要的。

生物被膜形成大致分為初始粘附、細(xì)菌聚集、成熟和分散4個階段，且在不同階段，細(xì)菌所表現(xiàn)的生理特征各不相同[9]，初始粘附階段大多數(shù)細(xì)菌能夠通過菌毛介導(dǎo)的游動或細(xì)菌自身的滑動性進(jìn)行獨立運動來促進(jìn)細(xì)菌粘附[10]，而在細(xì)菌聚集和成熟階段則主要是通過產(chǎn)生胞外多糖(extracellular polysaccharide, EPS)、胞外 DNA (extracellular DNA,eDNA)、蛋白質(zhì)和磷脂等物質(zhì)組成胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)形成并維持生物被膜三維結(jié)構(gòu)[11]。3,3′-二吲哚甲烷 (3,3′-diindolemethane,DIM)是存在于十字花科蕓苔屬蔬菜中的一種植物化學(xué)物，此前研究表明DIM具有抗腫瘤、抗癌等多種生物活性[12]，但是關(guān)于DIM對細(xì)菌生物被膜影響的研究較少且作用機(jī)制尚不完全清楚，目前缺乏定量評估DIM影響生物被膜形成過程、胞外基質(zhì)以及微觀結(jié)構(gòu)等的報道。

本研究通過測定生長曲線和細(xì)菌代謝活性分析DIM對S. enteritidis生長的影響，利用光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(CLSM)和掃描電鏡(SEM)觀察和分析DIM對生物被膜三維結(jié)構(gòu)的影響，探究DIM對生物被膜形成過程、細(xì)菌運動性以及與生物被膜三維結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的胞外基質(zhì)(EPS、eDNA)的影響，為DIM在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

實驗所使用的Salmonella enteritidis為實驗室保存的分離株。

DIM (純度≥98%，CAS:1968-05-4，Aladdin 公司)；TSB培養(yǎng)基(青島海博公司)；LB培養(yǎng)基(青島海博公司)；0.1%結(jié)晶紫染色液 (Solarbio公司)；PBS片 劑 (Solarbio公 司)；Styo 9試劑 (Thermo Fisher公司)；2.5%戊二醛固定液(北京雷根公司)；Gel extraction kit (Omega 公司)；瓊脂粉、乙醇、甲醇、二甲基亞砜(DMSO)、蒽酮等試劑均購于成都鵬世達(dá)實驗用品有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

Bio-Rad 680 酶標(biāo)儀 (Bio-Rad 公司)；BX53F 光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)；JSM-7500F掃描電子顯微鏡 (JEOL公司)；TCS SP5II激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)；BD1110超微紫外分光光度計(Bio Drop 公司)；Eppendorf 5804R 高速離心機(jī) (Eppendorf公司)等。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將保存在–20 ℃的S. enteritidis劃線于LB固體培養(yǎng)基活化，挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，于 130 r/min、37 ℃ 搖床中培養(yǎng) 12 h 進(jìn)行二次活化，將二次活化后的S. enteritidis劃線于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 h后將長有單菌落的固體平板保存于4 ℃。挑取單菌落接種于10 mL TSB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)活化。吸取1 mL過夜培養(yǎng)液于9 mL TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液濃度約為1×108CFU/mL，備用。

1.3.2 最小生物被膜抑制濃度 (MBIC)測定

將DIM溶解于DMSO制備濃度為2×10–2mol/L母液。按照方法1.3.1準(zhǔn)備菌液。在96孔板的中間選取 7列 8個復(fù)孔，第1列每孔加入5 μL DMSO、175 μL 1/10-TSB 培養(yǎng)基 (稀釋 10倍的 TSB 培養(yǎng)基)、20 μL TSB 培養(yǎng)基作為陰性對照；第 2 列每孔加入 5 μL DMSO、175 μL 1/10-TSB 培養(yǎng)基、20 μL按照方法1.3.1準(zhǔn)備的菌液作為空白對照；第3列到第7列分別加入5 μL梯度稀釋的DIM溶液、175 μL 1/10 - TSB 培養(yǎng)基、20 μL 菌液，使最后 DIM 濃度分別為 7.8，15.6，31.2，62.5，100 μmol/L。將 96 孔板于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h形成生物被膜。取出培養(yǎng)后的96孔板進(jìn)行結(jié)晶紫染色定量生物被膜，具體操作步驟：1) 棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS緩沖液輕輕洗滌兩次除去浮游細(xì)菌。每孔加入200 μL 95%甲醇溶液，室溫固定15 min后棄去固定液，室溫晾干。2) 每孔加入 200 μL 0.1% 結(jié)晶紫室溫染色15 min后棄去染液，用超純水洗滌至洗出液無色，室溫晾干。3) 每孔加入 200 μL 95% 乙醇溶液溶解15 min后，用酶標(biāo)儀測定OD570。最小生物被膜抑制濃度(MBIC)定義為當(dāng)處理濃度提高之后，生物被膜抑制率沒有顯著變化時的最小濃度[13]，DIM對S. enteritidis生物被膜抑制率采用以下算式計算：

1.3.3 DIM 對S. enteritidis生長的影響

生長曲線測定：如方法1.3.1準(zhǔn)備菌液，以1%的接種量接入 DIM濃度為 15.6，31.2 μmol/L的1/10-TSB培養(yǎng)基(稀釋10倍的TSB)中，以DMSO為空白對照。每2 h取一次樣直至48 h結(jié)束，測定OD600，繪制生長曲線。

細(xì)菌代謝活性測定：XTT作為線粒體脫氫酶的底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲臢產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑(例如PMS)聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲臢產(chǎn)物的吸光度與細(xì)胞代謝活性成正比，將XTT鈉鹽和吩嗪甲酯硫酸鹽(PMS)分別以 20 μg/mL和 300 μg/mL的濃度溶解在 PBS溶液中，并按1∶1比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。同時，按照方法1.3.2培養(yǎng)生物被膜。培養(yǎng)結(jié)束后，收集每孔的浮游菌，并用無菌PBS洗滌浮游菌，以850×g反復(fù)離心 5 min 后向沉淀中加入 200 μL XTT 與 PMS的混合液，并迅速轉(zhuǎn)移至96孔板中；同樣，孔板底部的生物被膜用無菌PBS溶液洗滌3次后，向孔中加入 200 μL XTT與 PMS混合液。最后，將 96孔板在 37 ℃、130 r/min 條件下避光孵育 3 h，用酶標(biāo)儀檢測OD490。

1.3.4 顯微鏡觀察生物被膜結(jié)構(gòu)

普通光學(xué)顯微鏡觀察步驟：預(yù)先在24孔板每孔中從三個角度豎直放入3片無菌玻片(φ 14 mm)，使其形成穩(wěn)定三角結(jié)構(gòu)，作為S. enteritidis生物被膜的載體。如方法1.3.1準(zhǔn)備菌液。在24孔板中間選取4列4個復(fù)孔，第1列每孔加入25 μL DMSO、875 μL 1/10-TSB 培養(yǎng)基、100 μL TSB 培養(yǎng)基為陰性對照；第 2 列每孔加入 25 μL DMSO、875 μL 1/10-TSB培養(yǎng)基、100 μL菌液為空白對照；第3列和第4 列每孔加入 25 μL DIM 溶液、875 μL 1/10-TSB 培養(yǎng)基、100 μL菌液，使孔中DIM終濃度分別為15.6，31.2 μmol/L，隨后將孔板置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。生物被膜培養(yǎng)結(jié)束后，取出玻片按方法1.3.2進(jìn)行結(jié)晶紫染色并用光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝放大400倍下的圖像。

激光共聚焦顯微鏡觀察步驟：如上述方法培養(yǎng)生物被膜結(jié)束后，取出覆有生物被膜的玻片，并用0.85% 氯化鈉溶液清洗 3 次，取 100 μL 3.34 μmol/L的Syto 9染液均勻覆蓋在玻片表面，將玻片置于28 ℃培養(yǎng)箱中避光染色15 min后。立即用激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜并采集圖像，并使用ImageJ軟件重建生物被膜三維結(jié)構(gòu)，COMSTAT2.1 (Dr. Claus Sternberg, DTU Systems Biology, Technical University of Denmark, Denmark)軟件計算三維結(jié)構(gòu)的定量參數(shù)。

掃描電子顯微鏡觀察步驟：預(yù)先在48孔板每孔中從三個角度豎直放入3片無菌玻片(φ 8 mm)，使其形成穩(wěn)定三角結(jié)構(gòu)，作為S. enteritidis生物被膜的載體。按照方法1.3.2培養(yǎng)生物被膜。將覆有生物被膜的玻片用無菌PBS溶液清洗3次后立即用 2.5%戊二醛固定液于 4 ℃固定 3 h。用 30%、50%、60%、70%、90%、95%和100%的乙醇溶液梯度脫水10 min后進(jìn)行臨界點干燥和噴金處理。掃描電鏡觀察并拍攝放大2000倍和5000倍下的圖像。

1.3.5 生物被膜形成過程的測定

將20 mL如方法1.3.1準(zhǔn)備的菌液與 180 mL 1/10-TSB培養(yǎng)基混合均勻后，向96孔板每孔中加入 200 μL，分別在不同時間點 (4，8，12，18，24，34，48，58，72，82，96，120 h)取出樣品，每個時間點 18個復(fù)孔，按方法1.3.2進(jìn)行結(jié)晶紫染色，酶標(biāo)儀檢測OD570，繪制生物被膜形成過程曲線。如方法1.3.2培養(yǎng)S. enteritidis生物被膜，不同之處在于分別在培養(yǎng)的 0，6 ，12，24，36 ，38 h 加入 DIM 溶液使孔中終濃度為 31.2 μmol/L，并于 48 h 停止培養(yǎng)。然后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，酶標(biāo)儀檢測OD570，并計算在不同時間加入DIM時的生物被膜抑制率以評估DIM的抑制的具體階段。

1.3.6S. enteritidis運動性能的檢測

按照方法1.3.1準(zhǔn)備菌液。準(zhǔn)備3個50 mL游動性檢測培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.25%氯化鈉、0.3%瓊脂)和3個50 mL群集性能檢測培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.25%氯化鈉、0.7%瓊脂)，冷卻到45 ℃左右分別加入1.25 mL DMSO作為空白對照、1.25 mL DIM 溶液使平板中終濃度分別為 15.6 μmol/L和31.2 μmol/L，混合均勻后倒平板，冷卻凝固后于平板中央垂直加入15 μL菌液，水平放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h后觀察并拍照。

1.3.7 胞外 DNA (eDNA)的測定

按方法1.3.4在DIM處理下培養(yǎng)S. enteritidis生物被膜，但不在24孔板中放置玻片。生物被膜培養(yǎng)結(jié)束后棄去浮游細(xì)胞并清洗生物被膜，向每孔加 5 μL EDTA (0.5 M)，4 ℃ 條件下靜置 1 h 后，向每孔加入700 μL TEN緩沖液重新懸浮生物被膜細(xì)胞。于 4 ℃ 下 18000×g離心 5 min，將 100 μL 上清液轉(zhuǎn)移到含有300 μL TE緩沖液的EP管中。然后，將混合物和等體積的結(jié)合緩沖液(Gel extraction kit)加入吸附柱。室溫靜置2 min 后，于4 ℃ 下18000×g離心 60 s，然后用洗滌緩沖液清洗吸附柱，18000×g反復(fù)離心30 s。最后加入無菌水，離心收集eDNA。使用超微紫外分光光度計測定eDNA濃度。

1.3.8 胞外多糖 (EPS)的測定

S. enteritidis生物被膜中胞外多糖的提取方法：如方法1.3.1所述準(zhǔn)備S. enteritidis菌液，在直徑為60 mm 無菌培養(yǎng)皿中依次加入125 μL DMSO、4375 μL BHIGSS培養(yǎng)基、500 μL菌液作為空白對照，處理組加入 125 μL DIM 溶液使終濃度分別為 15.6 μmol/L和31.2 μmol/L。加樣結(jié)束后將培養(yǎng)皿于在28 ℃條件下培養(yǎng)48 h以便形成生物被膜。棄去浮游細(xì)胞后，用無菌PBS洗3次后將生物被膜洗脫至2 mL PBS 中，洗脫液以 9500×g離心 10 min。收集上清液為待測樣液。胞外多糖含量采用蒽酮硫酸法測定，具體檢測步驟如下：1) 精密稱取0.100 g蒽酮試劑，溶解于100 mL 80%的濃硫酸溶液中，定容后輕輕混合均勻配制成蒽酮硫酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。2) 精密稱取0.100 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容后，稀釋成不同濃度的葡萄糖溶液。3) 向試管中加入2 mL葡萄糖溶液，以蒸餾水為對照，每組實驗3個重復(fù)。迅速加入6 mL蒽酮硫酸溶液，振蕩充分混勻，置于95 ℃沸水中加熱15 min后，迅速放在冰水中冷卻15 min，測定在 625 nm處的吸光值，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4) 取2 mL待測溶液于試管中，同前一樣的步驟，記錄在625 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品糖含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用 GraphPad Prism version 7.00 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)并做圖，以P<0.05代表差異顯著，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DIM 對 S. enteritidis的 MBIC 結(jié)果

由圖1可知，DIM在 7.8～31.2 μmol/L范圍內(nèi)隨著濃度的升高，對S. enteritidis生物被膜的抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴性增強。在31.2 μmol/L時對生物被膜的抑制率約35%，當(dāng)濃度再升高時對生物被膜抑制效果無顯著升高(P>0.05)。由此可知，DIM對S. enteritidis的 MBIC 為 31.2 μmol/L。

圖1 DIM 對 S. enteritidis 生物被膜的影響

2.2 DIM 對 S. enteritidis生長的影響

對細(xì)菌生長和生物被膜結(jié)構(gòu)的影響是評估生物被膜抑制劑效果的兩個重要指標(biāo)，有前景的生物被膜抑制劑應(yīng)該是在抑制生物被膜的前提下，對細(xì)菌生長影響小或者幾乎沒有影響[14]。DIM對S. enteritidis生長的影響如圖2所示，結(jié)果顯示在培養(yǎng)48 h后，空白對照組和處理組的S. enteritidis細(xì)胞密度也沒有顯著差異 (P>0.05) (圖2（a）) 。且 DIM 濃度在15.6 ～31.2 μmol/L 范圍內(nèi)，參與生物被膜形成的細(xì)菌代謝活性(被活細(xì)胞還原成的水溶性橙黃色甲臢產(chǎn)物在490 nm時的吸光值)以劑量依賴的方式減少，浮游細(xì)胞的代謝活性呈劑量依賴性增加，但對照組與處理組之間的代謝活性之和無顯著差異(P>0.05) (圖2（b）)，證實 DIM 在測試濃度下對S.enteritidis無抗菌活性，即是指DIM的抗S. enteritidis生物被膜活性不是通過抑制生長實現(xiàn)的。

圖2 DIM 對 S. enteritidis 生長的影響（空白對照 ：2.5% DMSO)

2.3 DIM 對 S. enteritidis生物被膜結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)過結(jié)晶紫和Syto 9熒光染料對DIM處理后的S. enteritidis生物被膜染色結(jié)果如圖3所示。普通光學(xué)顯微鏡圖像顯示對照組的生物被膜細(xì)胞團(tuán)簇互相連接，而在實驗組中可明顯觀察到生物被膜細(xì)胞團(tuán)簇變小且分散(圖3 (a))。在激光共聚焦顯微鏡圖像中也觀察到相似的結(jié)果，對照組中生物被膜的細(xì)胞團(tuán)簇是互相連接的且熒光強度較強，在15.6～ 31.2 μmol/L范圍內(nèi)隨著DIM濃度的增加，細(xì)胞團(tuán)簇減少，熒光強度明顯減弱，在31.2 μmol/L處理組中只能觀察到分散的熒光微弱的細(xì)胞團(tuán)簇(圖3 (b))。掃描電鏡圖像可見對照組的生物被膜細(xì)菌數(shù)量多且排列緊密，經(jīng)過15.6 μmol/L的DIM處理后的S. enteritidis生物被膜細(xì)菌數(shù)量明顯減少，31.2 μmol/L的DIM處理的S. enteritidis生物被膜只分布了少數(shù)的單個菌落 (見圖4)。

圖3 DIM 對 S. enteritidis 生物被膜結(jié)構(gòu)的影響（空白對照 ：2.5% DMSO)

圖4 掃描電子顯微鏡觀察 DIM 對 S. enteritidis生物被膜結(jié)構(gòu)的影響（空白對照 ：2.5% DMSO)

激光共聚焦三維重建圖像定量結(jié)果如表1所示，對照組中生物被膜厚度約為 25 μm，在 15.6～31.2 μmol/L內(nèi)隨著DIM濃度的增加生物被膜的厚度呈現(xiàn)濃度依賴性變薄，經(jīng)過31.2 μmol/L的DIM處理后的生物被膜的厚度僅8 μm，相比對照組顯著減少了約68% (P<0.05)；對照組中生物被膜生物量約為9.615 μm3/μm2，經(jīng) 15.6 μmol/L 和 31.2 μmol/L 的DIM 處理后分別為 2.828 μm3/μm2和 0.808 μm3/μm2，與對照組相比，處理組中單位面積生物量顯著減少了約70%和91% (P<0.05)。結(jié)果說明，DIM明顯抑制了生物被膜是三維結(jié)構(gòu)形成且呈現(xiàn)濃度依賴性。

表1 COMSTAT2.1 分析 DIM 對 S. enteritidis生物被膜結(jié)構(gòu)的影響1）

2.4 DIM 對 S. enteritidis生物被膜形成的影響

生物被膜形成大致分為初始粘附、細(xì)菌聚集、成熟和分散4個階段，且在不同階段，細(xì)菌所表現(xiàn)的生理特征各不相同[9]，探究生物被膜形成過程有利于進(jìn)一步研究DIM抑制生物被膜的機(jī)制。S.enteritidis生物被膜形成過程如圖5所示，在0～8 h內(nèi)OD570值偏低且上升緩慢，此時并未形成穩(wěn)定的生物被膜；8～34 h內(nèi)OD570值迅速上升，說明此時孔板中粘附的菌體越來越多；34～72 h內(nèi)的OD570值基本穩(wěn)定，說明生物被膜已經(jīng)成熟，達(dá)到一個穩(wěn)定的狀態(tài)；72 h后OD570值不斷下降，說明粘附的菌體不斷脫落，生物被膜逐漸分散。由OD570變化趨勢可知S. enteritidis生物被膜形成過程如下：0～8 h是初始粘附階段，8～34 h 是細(xì)菌聚集階段，34～72 h是生物被膜成熟階段，72～120 h是生物被膜分散階段。

圖5 S. enteritidis 生物被膜形成過程

為探究DIM對S. enteritidis生物被膜形成過程的影響，實驗選擇在生物被膜形成的不同階段加入DIM。如圖6所示，0 h添加DIM時對生物被膜的抑制率約為40%，6 h之后添加DIM，生物被膜抑制率逐漸降低，24 h之后添加DIM，生物被膜抑制率僅為10%。綜上所述，DIM對S. enteritidis生物被膜的抑制作用主要體現(xiàn)在抑制生物被膜形成過程的初始粘附階段和細(xì)菌聚集階段。

圖6 DIM 對 S. enteritidis 生物被膜的影響（＊＊P < 0.01）

2.5 DIM 對 S. enteritidis運動性的影響

在粘附初始階段，運動性是微生物的一項重要生理活動，對細(xì)菌粘附表面和生物被膜的形成起著至關(guān)重要的作用[15]。由結(jié)果2.4可知DIM抑制了初始粘附階段，因此實驗探究了DIM對細(xì)菌運動性是否產(chǎn)生影響。S. enteritidis是一種有鞭毛的細(xì)菌，其運動性包含游動和群集/蜂擁兩種，研究表明在不同瓊脂含量的培養(yǎng)基中，細(xì)菌表現(xiàn)出的運動性也不同，瓊脂含量為0.3%時，細(xì)菌的運動主要表現(xiàn)菌體游動，當(dāng)瓊脂含量為0.7%時，培養(yǎng)基中間隙較小，主要表現(xiàn)為群集運動[16]。DIM對S. enteritidis運動性的影響如圖7所示，與對照組相比，在15.6 μmol/L至31.2 μmol/L范圍內(nèi)隨著DIM濃度增加，S. enteritidis游動的直徑逐漸減小，群集性能也逐漸減弱。

圖7 DIM 對 S. enteritidis 游動 (A)和群集 (B)的影響

2.6 DIM 對 S. enteritidis eDNA 的影響

eDNA是一種普遍存在的胞外基質(zhì)，研究表明，eDNA存在于細(xì)菌細(xì)胞表面，通過酸堿相互作用增強了粘附和表面聚集[17]。DIM對S. enteritidiseDNA釋放的影響如圖8所示，DIM顯著抑制了S. enteritidiseDNA 的釋放 (P<0.05)，在 15.6 ～31.2 μmol/L 范圍內(nèi)隨著DIM濃度增加，胞外基質(zhì)中eDNA濃度從1.6 μg/mL 降低至 1.0 μg/mL，與對照組相比分別降低約46%和67%。

圖8 DIM 對 S. enteritidis eDNA 釋放的影響

2.7 DIM 對 S. enteritidis胞外多糖的影響

胞外多糖是保證生物膜三維結(jié)構(gòu)完整性的重要因素，主要在生物被膜形成過程的細(xì)菌增殖階段產(chǎn)生[18]。相關(guān)報道表明，有效的生物被膜抑制劑能抑制沙門氏菌胞外多糖的產(chǎn)生[19]。由圖9可知，DIM顯著抑制了S. enteritidis胞外多糖的產(chǎn)生(P<0.05)，DIM 在 15.6 μmol/L 至 31.2 μmol/L 范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，胞外多糖濃度逐漸降低，在15.6 μmol/L處理下，胞外多糖含量為5.8 μg/mL，相對于對照組降低約48%，在31.2 μmol/L處理下，胞外多糖濃度降低至3.4 μg/mL，相對于對照組降低約70%。

圖9 DIM 對 S. enteritidis 胞外多糖的影響

3 結(jié)束語

沙門氏菌是導(dǎo)致食源性疾病的重要致病菌之一，能通過在食品接觸表面甚至食品表面形成生物被膜來避免被清除[20]。生物被膜一旦成熟，其由EPS、eDNA、蛋白質(zhì)等組成的ECM的阻隔性使消毒劑濃度在生物被膜中由外到內(nèi)呈現(xiàn)梯度下降[6]，導(dǎo)致不能完全消滅里層細(xì)菌，造成食品污染。因此，預(yù)防生物被膜形成對于保證食品安全尤為重要。

本研究表明，DIM使常見食源性致病菌S.enteritidis生物被膜厚度減少三分之二，有效抑制生物被膜形成三維結(jié)構(gòu)。大多數(shù)細(xì)菌生物被膜的形成大致包含4個不同階段(初始粘附、細(xì)菌聚集、成熟、分散)，細(xì)菌在不同階段表現(xiàn)出不同的生理活動。通過探究DIM具體作用階段以及對相關(guān)生理活動的影響，發(fā)現(xiàn)DIM主要抑制生物被膜形成過程中的細(xì)菌粘附及聚集，細(xì)菌運動和胞外基質(zhì)分泌分別在初始粘附和細(xì)菌聚集階段起著關(guān)鍵作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，DIM阻礙了S. enteritidis的游動和群集運動，可能通過抑制細(xì)菌運動性以及eDNA、胞外多糖的產(chǎn)生從而抑制S. enteritidis細(xì)菌粘附和聚集，導(dǎo)致生物被膜形成失敗。且DIM的抗生物被膜活性不是通過抑制細(xì)菌生長實現(xiàn)的，因此具有不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗性的優(yōu)勢，有良好的應(yīng)用前景。