楊林英，徐凡，耿培妍，尹顯達，耿丹萌，王謙

(河北大學(xué) 生物工程技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071002)

在綠色發(fā)展理念下，食藥用真菌對各種農(nóng)林廢棄物的分解利用，成為當(dāng)前國內(nèi)重要的解決生態(tài)環(huán)境中農(nóng)業(yè)面源污染的技術(shù)與產(chǎn)業(yè)方向之一；黑木耳現(xiàn)在成為國內(nèi)栽培規(guī)模最大的品種，在生態(tài)循環(huán)中，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生的菌糠成為隨之出現(xiàn)需要解決的問題，其資源化利用就成為科技部、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部引導(dǎo)的領(lǐng)域重點研發(fā)方向之一；菌糠中含有豐富的菌絲蛋白、脂肪、菌絲體的次生代謝產(chǎn)物和鈣、磷、鈉等多種微量元素[1-2].目前，黑木耳菌糠大部分被丟棄在田間地頭、河流兩岸，不但造成資源浪費，還會造成環(huán)境污染[3-5].本團隊早在利用中國第17顆返回式衛(wèi)星開展《衛(wèi)星搭載食用真菌菌種應(yīng)用研究》中，就發(fā)現(xiàn)食用菌菌絲體中，存在激素類物質(zhì)，因此，菌糠中激素類物質(zhì)的檢測及相關(guān)應(yīng)用是其資源化開發(fā)的技術(shù)途徑之一.

測定激素類物質(zhì)的方法有很多種，主要分為3大類：生物學(xué)鑒定法、免疫學(xué)方法、物理化學(xué)法.生物學(xué)鑒定法的周期長，準(zhǔn)確度不高[6]；免疫學(xué)方法雖靈敏度高，但是制備抗體比較復(fù)雜[7]；物理化學(xué)方法中最常用的是分光光度法、高效液相色譜法、高效氣相色譜法，色譜法靈敏度高、選擇性好，但是該種方法儀器價格昂貴，對樣品前處理要求高，因為其分辨有一定的限度，若達不到一定的純度要求，可能會出現(xiàn)一種以上的化合物保留時間接近甚至相同，對檢測結(jié)果有一定的影響[8].分光光度法相比較色譜法而言，更加經(jīng)濟，簡易，實用，易操作[9].

目前國內(nèi)外對黑木耳菌糠中激素類物質(zhì)含量測定的研究比較少，對黑木耳菌糠中激素類物質(zhì)的進一步研究，能夠幫助人們進一步探索黑木耳菌糠的資源化開發(fā)利用，也是本團隊作為河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)黑木耳產(chǎn)業(yè)體系的崗位任務(wù).本文采用分光光度法對黑木耳菌糠中的赤霉素、吲哚乙酸進行了含量測定，并且選擇生長較快、口感好、營養(yǎng)成分獨特、營養(yǎng)價值高且具有觀賞性的紫葉生菜品種[10]，初步探索了黑木耳菌糠與菜園土、砂質(zhì)土不同質(zhì)量配比對紫葉生菜生長的影響.

1 材料與試劑

黑木耳菌棒(常規(guī)雜木屑配方材料)：選自河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系黑木耳綜合實驗站.

紫葉生菜種子：市購.

試劑A：15 mL 0.5 mol/L 的FeCl3,300 mL體積分?jǐn)?shù)為96%的濃硫酸，500 mL蒸餾水，使用前混勻即可，避光保存.

2 實驗方法

2.1 黑木耳菌糠中激素類物質(zhì)含量的測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1.1 赤霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別配置質(zhì)量濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0 μg/mL的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取2 mL(即質(zhì)量分別為0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、4.0 μg)于5 mL的具塞刻度試管中，40 ℃水浴加熱直至液體蒸干，冷卻后加2 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶解，再分別加入體積分?jǐn)?shù)85%的濃硫酸3 mL，加塞搖勻，室溫下放置40 min后，于412 nm波長處測定吸光度值.標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為赤霉素質(zhì)量(μg)，縱坐標(biāo)為吸光度值.

2.1.1.2 吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別配置質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0，20.0、25.0 μg/mL的吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取2 mL(即質(zhì)量分別為0、1.0、2.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg)于5 mL的具塞刻度試管中，40 ℃水浴加熱直至蒸干，冷卻后加2 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶解，然后分別加入配置好的試劑A溶液8 mL，于40 ℃恒溫水浴鍋放置30 min后，于530 nm波長處測定吸光度值.以吲哚乙酸的含量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.1.2 樣品處理

用電熱鼓風(fēng)干燥箱將采收后的新鮮、無霉變的黑木耳菌棒烘干，粉碎機粉碎后過40目(孔徑425 μm)篩網(wǎng)，用于后續(xù)實驗.

稱取5 g干燥的黑木耳菌糠于250 mL錐形瓶中，再加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇50 mL，于4 ℃條件下浸提12 h后，在4 ℃ 3 500 r/min條件下離心20 min，收取上清液，沉淀用10 mL體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶解并在同樣離心條件下重復(fù)離心15 min，離心共重復(fù)3次，合并上清液，即為黑木耳菌糠初提液.

取菌糠初提液2 mL，加等體積石油醚(為了除去部分色素和脂質(zhì))萃取脫色3次，棄醚相，調(diào)pH值至2. 加2 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，黑木耳菌糠中的激素類物質(zhì)即在酯相中.

2.1.3 赤霉素含量測定

取2 mL有機相，40 ℃水浴加熱直至液體蒸干，加2 mL體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶解，加3 mL體積分?jǐn)?shù)85%的濃硫酸搖勻，40 min后于412 nm下測吸光度值.

2.1.4 吲哚乙酸含量測定

取2 mL有機相，40 ℃水浴加熱直至液體蒸干，加2 mL體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶解，加8 mL試劑A，40 ℃恒溫水浴鍋放置30 min，于530 nm下測吸光度值.

2.1.5 回收率的測定

為了驗證本文中赤霉素和吲哚乙酸提取、測定方法的可靠性，在黑木耳菌糠中分別添加赤霉素、吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用同樣方法提取、純化和測定，最后計算赤霉素和吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的回收率.

2.2 黑木耳菌糠對紫葉生菜發(fā)芽率及發(fā)芽時間的影響

2.2.1 黑木耳菌糠的預(yù)處理

將粉碎后的無霉變、無污染的黑木耳菌糠在陽光下暴曬3 d，然后加水?dāng)嚢杈鶆?，水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在60%～70%.選擇晴朗無風(fēng)的潔凈地面進行堆積，第1層鋪攪拌均勻的濕菌糠，然后再撒1層微生物菌劑，將濕菌糠和微生物菌劑依次交錯堆積.用木棍在堆中插孔，堆積物表面覆蓋塑料薄膜從而達到保濕、保溫的效果.每間隔5 d翻堆1次，并加入適量的水補充水分，翻堆要翻透徹，使黑木耳菌糠發(fā)酵均勻.

2.2.2 黑木耳菌糠對紫葉生菜生長的影響

按照表1中列舉的不同配方，將處理好的黑木耳菌糠與砂質(zhì)土、菜園土進行配比.混合均勻后放入穴盤中，不要壓實，要保證良好的透氣性，用水澆濕.在每個穴盤放5粒紫葉生菜菜籽，然后灑上1層薄土覆蓋種子.在穴盤上蓋上報紙，每天噴2次水.將穴盤放置于25 ℃左右的生長環(huán)境下，記錄在不同配方下紫葉生菜的發(fā)芽率和發(fā)芽時間.依據(jù)記錄的相關(guān)數(shù)據(jù)，確定適宜的菌糠添加量.

表1 黑木耳菌糠、砂質(zhì)土、菜園土不同混合比例Tab.1 Different proportion of Auricularia auricula bran, sandy soil and soil square

3 結(jié)果分析

3.1 黑木耳菌糠中激素類物質(zhì)含量測定結(jié)果

3.1.1 赤霉素、吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)數(shù)據(jù)分別繪制赤霉素和吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1和圖2所示.

圖1 赤霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gibberellins

圖2 吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of indoleacetic acid (IAA)

3.1.2 赤霉素、吲哚乙酸含量測定

結(jié)合吸光度值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黑木耳菌糠中赤霉素和吲哚乙酸的含量，結(jié)果如表2和表3所示.

表2 黑木耳菌糠中赤霉素含量Tab.2 Content of gibberellins in Auricularia auricula bran

表3 黑木耳菌糠中吲哚乙酸含量Tab.3 Content of IAA in Auricularia auricula bran

由表2和表3可知，黑木耳菌糠中赤霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.52 μg/g，吲哚乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.42 μg/g，說明黑木耳菌糠能夠為植物生長提供一定量的激素類物質(zhì).

3.1.3 回收率

在黑木耳菌糠中添加赤霉素和吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過同樣方法的處理后分別測得赤霉素和吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的回收率如表4所示.

表4 標(biāo)準(zhǔn)品的回收率Tab.4 Recovery of standard

由表4可知，添加赤霉素和吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的平均回收率分別為98.28%和94.70%，證實該研究中采用的赤霉素和吲哚乙酸的測定方法可靠.

3.2 黑木耳菌糠不同配比對紫葉生菜發(fā)芽率、發(fā)芽時間的影響結(jié)果

不同比例的黑木耳菌糠栽培紫葉生菜，對其發(fā)芽率和發(fā)芽時間的影響結(jié)果如表5所示.

表5 黑木耳菌糠不同配比對紫葉生菜發(fā)芽率和發(fā)芽時間的影響Tab.5 Effects of different proportion of Auricularia auricula bran on germination rate and average germination time of purple leaf lettuce

由表5可知，配方3種植的紫葉生菜與其他配方相比，發(fā)芽率最高，而且與其他配方呈現(xiàn)極顯著性差異，發(fā)芽時間最短；配方2和配方1的發(fā)芽率逐漸降低，發(fā)芽時間逐漸增長;配方1抑制了紫葉生菜生長.

4 結(jié)論

黑木耳菌糠中含有赤霉素和吲哚乙酸；與對照相比，一定比例的黑木耳菌糠的使用，可以提高紫葉生菜發(fā)芽率、縮短發(fā)芽時間；研究初步表明黑木耳菌糠可以為植物的生長發(fā)育提供一定量的激素類物質(zhì).通過對比含不同比例的黑木耳菌糠配方對紫葉生菜發(fā)芽率、發(fā)芽時間的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的黑木耳菌糠時，栽培出來的紫葉生菜發(fā)芽率可達86.91%，而且發(fā)芽時間最短，約為7 d.綠色發(fā)展理念下，菌糠中激素類物質(zhì)的檢測及相關(guān)應(yīng)用為黑木耳菌糠資源化開發(fā)利用提供了一種生態(tài)循環(huán)技術(shù)路徑.菌糠添加量為55%時抑制紫葉生菜生長，具體原因還需要進一步探究.