王夢杰，吳華，劉嘉華，張龍飛

(青海大學 農牧學院，青海 西寧 810000)

現(xiàn)代快節(jié)奏的生活，使得人們的一些習慣發(fā)生改變，如晝夜顛倒、飲食不規(guī)律等，這些不規(guī)律和不健康的生活方式成為誘發(fā)各類癌癥的主要因素之一.其中，肝癌的發(fā)病率和死亡率均高居癌癥的前6位，2020年全球死于肝癌的人數(shù)達80多萬，占全球癌癥總死亡人數(shù)的8.3%[1].近些年，人們在研究和開發(fā)抗腫瘤藥物的過程中逐漸將目光轉向了可食用的天然化合物，其中就包括黃酮類化合物[2].茄科黑果枸杞多分布于中國西北地區(qū)，富含多種花青素類天然色素，其含量居漿果類植物之首[3-4].花青素是一種類黃酮物質，屬黃酮類化合物的一個亞群，在抗腫瘤方面具有較強的生理活性，具有一定的食品開發(fā)和醫(yī)學研究意義[2,4].前期研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞提取物(LyciumruthenicumMurray extraction，LRME)可有效抑制HepG2細胞增殖和遷移，并具有劑量和時間依賴性[4].基于此，本實驗擬從細胞和分子層面揭示LRME基于內質網應激和線粒體自噬對HepG2細胞自噬影響的分子機理，為開發(fā)黑果枸杞的藥用價值提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

LRME,青海金麥杞生物科技有限公司[4]；HepG2細胞,中國科學院上海細胞庫；細胞周期檢測試劑盒，碧云天生物技術研究所.

1.2 實驗方法

1.2.1 流式細胞術測細胞周期

分別設對照組(NC),LRME組.將1×105/mL的HepG2細胞接種至6孔板進行常規(guī)培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱穩(wěn)定24 h后，加入LRME進行誘導，控制LRME終質量濃度分別為0、25 μg/mL.誘導24 h后收集細胞，用體積分數(shù)為70%的冷乙醇固定過夜，PI染色后上機檢測.

1.2.2 qRT-PCR檢測關鍵基因mRNA表達

分別設NC組、LRME組、自噬抑制劑組(3-MA)、LRME+3-MA組.將1×105/mL的HepG2細胞接種至6孔板進行常規(guī)培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱穩(wěn)定24 h后進行分組處理，控制LRME終質量濃度分別為0、25 μg/mL，3-MA的終濃度為5 mmol/L.誘導24 h后通過Triol法提取總RNA，并按TIANGEN試劑盒說明書進行RNA逆轉錄和qRT-PCR反應，引物由上海生物公司合成(表1).使用 Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System 對各組樣本進行擴增，記錄各樣品擴增Ct值(Ct值指每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環(huán)數(shù))，采用2-△△Ct法計算各目的基因的相對表達量.

1.2.3 Western blot檢測關鍵基因蛋白表達

將1×105/mL的HepG2細胞接種至6孔板進行常規(guī)培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱穩(wěn)定24 h后進行分組處理，控制LRME終質量濃度分別為0、25 μg/mL，3-MA的終濃度為5 mmol/L.細胞誘導24 h后，由含體積分數(shù)1% PMSF的裂解液進行裂解，離心后取上清液，BCA 法定量.蛋白于PCR儀上95 ℃加熱5 min，變性后泳道上樣，制備體積分數(shù)8%的分離膠和體積分數(shù)5%的濃縮膠.SDS-PAGE 電泳濃縮膠 70 V、30 min；分離膠 120 V、90 min.電泳后轉膜至PVDF膜，按體積比1∶1 000配制ATF4、FUNDC1及β-tubulin 一抗，4 ℃封閉過夜后洗膜.加入二抗，室溫1 h后洗膜.向PVDF膜滴加發(fā)光液試劑并反應5 min后曝光顯影.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結果分析

2.1 LRME調控HepG2細胞增殖

2.1.1 LRME調控HepG2細胞周期

經流式細胞術檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，LRME可有效阻滯HepG2細胞周期(圖1).

a.NC組；b.LRME組；c.細胞所處周期百分比.與NC組比較*P<0.05；**P<0.01.圖1 LRME調控HepG2細胞周期Fig.1 Regulation of LRME on cell cycle in HepG2 cells

由圖1可知，與NC組相比，LRME可極顯著上調HepG2細胞在G0/G1期的細胞數(shù)(P<0.01)，并顯著下調HepG2細胞在S期的細胞數(shù)(P<0.05).表明LRME可顯著抑制HepG2細胞增殖，并可有效阻滯HepG2細胞從G0/G1期向S期轉化.

2.1.2 LRME調控HepG2細胞關鍵增殖因子mRNA表達水平

檢測增殖關鍵因子mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，LRME可有效抑制HepG2細胞增殖，結果見圖2.

由圖2可知，與NC組相比，LRME可極顯著上調增殖關鍵因子TP53在mRNA水平的表達(P<0.01)，并顯著下調CCND1、CDK4和PCNA在mRNA水平的表達(P<0.05).表明LRME可通過上調TP53，下調CCND1、CDK4和PCNA的mRNA表達抑制HepG2細胞增殖.

與NC組比較*P<0.05；**P<0.01.圖2 HepG2細胞增殖關鍵因子在mRNA水平的表達Fig.2 Expression of proliferation factors at mRNA level in HepG2 cells

2.2 LRME調控HepG2細胞內質網應激關鍵因子mRNA和蛋白表達水平

分別選用LRME(25 μg/mL)和3-MA(5 mmol/L)誘導細胞，結果發(fā)現(xiàn)，LRME可有效增強HepG2細胞的內質網應激(圖3).

與NC組比較**P<0.01.與3-MA組比較## P<0.01.

由圖3可知，與NC組相比，LRME可極顯著上調ATF4的mRNA表達水平和蛋白表達水平(P<0.01)，3-MA可極顯著下調ATF4的mRNA表達水平和蛋白表達水平(P<0.01)，LRME+3-MA可極顯著上調ATF4的mRNA表達水平和蛋白質表達水平(P<0.01)；阻斷細胞自噬后，與3-MA組相比，LRME和LRME+3-MA均可極顯著上調ATF4的mRNA表達水平和蛋白表達水平(P<0.01).說明LRME可通過上調ATF4在mRNA水平和蛋白水平的表達，增強HepG2細胞的內質網應激.

2.3 LRME調控HepG2細胞線粒體自噬關鍵因子mRNA和蛋白表達水平

分別選用LRME和3-MA誘導細胞，結果發(fā)現(xiàn)，LRME可有效促進HepG2細胞的線粒體自噬(圖4).

由圖4可知，與NC組相比，LRME可極顯著上調FUNDC1的mRNA表達水平和蛋白表達水平(P<0.01)，3-MA可極顯著下調FUNDC1的mRNA表達水平和蛋白表達水平(P<0.01)，LRME+3-MA可顯著上調FUNDC1的mRNA表達水平(P<0.05)并極顯著上調FUNDC1的蛋白表達水平(P<0.01)；阻斷細胞自噬后，與3-MA組相比，LRME和LRME+3-MA均可極顯著上調FUNDC1的mRNA表達水平和蛋白表達水平(P<0.01).說明LRME可通過上調FUNDC1在mRNA水平和蛋白水平的表達，促進HepG2細胞線粒體自噬.

與NC組比較**P<0.01；與3-MA組比較## P<0.01.

2.4 LRME對HepG2細胞自噬關鍵因子mRNA表達的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，LRME可顯著促進AMPK和LC3在mRNA水平的表達[4].本實驗檢測自噬關鍵因子mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，LRME可顯著抑制mTOR的mRNA表達水平(P<0.05).阻斷細胞自噬后，與3-MA組相比，LRME+3-MA可極顯著上調AMPK和LC3在mRNA水平的表達(P<0.01)，并顯著下調mTOR在mRNA水平的表達(P<0.05)(圖5).表明LRME可通過下調mTOR并上調AMPK和LC3的mRNA表達，促進HepG2細胞自噬.

a.mTOR mRNA表達量；b.AMPK、mTOR和LC3 mRNA表達量.

3 討論

3.1 LRME調控HepG2細胞增殖

細胞分裂過程中，CCND1基因所編碼的細胞周期蛋白D1可與細胞分裂蛋白激酶4相結合，調控細胞由G1期向S期過渡，研究發(fā)現(xiàn)CCND1和CDK4下調，細胞周期進程可被有效阻滯[5-6].此外，增殖細胞核抗原PCNA在細胞內由G0期開始表達，S期到達峰值，M期出現(xiàn)回落[7].作為評價腫瘤細胞增殖能力的標志物，PCNA表達量越高，表示細胞增殖越旺盛[8].而“分子衛(wèi)士”抑癌基因TP53則在細胞DNA發(fā)生損傷時發(fā)揮重要作用.研究發(fā)現(xiàn)，TP53所編碼的野生型p53蛋白可使G0/G1期和G2/M期細胞停止發(fā)育，從而抑制細胞增殖[9].基于花青素可有效抑制腫瘤細胞增殖和阻滯細胞周期[10]，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，LRME顯著下調HepG2細胞S期的細胞數(shù)，將HepG2細胞阻滯在G0/G1期；并通過下調PCNA、CCND1、CDK4和上調TP53的mRNA表達來阻滯HepG2細胞周期，進而抑制HepG2細胞的增殖.

3.2 LRME基于線粒體自噬和內質網應激對HepG2細胞自噬的影響

自噬是細胞自身的一種分解代謝機制，可通過溶酶體降解損傷細胞器和異常蛋白[11]，其中包括線粒體和內質網等在內的細胞質內含物可通過雙膜自噬小體將物質傳遞至溶酶體進行大量降解[12].雖然自噬通常被認為可通過減輕細胞應激促進細胞存活，但目前基于癌癥病理生理學發(fā)現(xiàn)，細胞的異常自噬對誘導癌細胞死亡起著重要作用[13-14].內質網是合成和加工蛋白質的場所，當細胞穩(wěn)態(tài)被破壞時，為了生存，細胞將啟動一系列自我保護事件，其中就包括細胞自噬和內質網應激[15].內質網應激通常被認為是細胞的一種病理性狀態(tài)，即蛋白質在內質網內發(fā)生折疊錯誤和聚集異常，當細胞持續(xù)發(fā)生內質網應激時，自噬囊泡可吞噬并降解受損的內質網，降解的內質網片段可被細胞重新組裝形成新的內質網，恢復細胞的正常生理狀態(tài)[15].腫瘤內部細胞因缺氧存在著輕度的內質網應激，而重度內質網應激則可造成線粒體損傷，進而抑制腫瘤細胞的存活[16].ATF4是反應響應細胞發(fā)生應激的一種基因，可參與調節(jié)內質網應激和自噬[12].mTOR自噬途徑和AMPK基因可響應并調節(jié)內質網應激誘導的自噬反應，進而抑制癌細胞的存活[17-18].本實驗研究發(fā)現(xiàn)LRME可有效上調ATF4的mRNA和蛋白表達，顯著下調mTOR的mRNA表達并上調AMPK的mRNA表達，說明LRME可通過上調ATF4、AMPK和下調mTOR促使HepG2細胞內質網應激并誘導HepG2細胞過度自噬，進而抑制HepG2細胞的存活.

線粒體可參與細胞多種代謝活動，是細胞的“能量加工廠”，當線粒體發(fā)生損傷時，細胞則會啟動線粒體發(fā)生自噬以保證代謝的正常運行[19].線粒體自噬需要線粒體與自噬機制相互作用，使細胞去除受損或多余的線粒體[20].FUNDC1是哺乳動物的一類典型的線粒體受體，可與線粒體相互作用并將LC3募集到線粒體，并借此誘導線粒體自噬[21].本實驗研究發(fā)現(xiàn)，LRME可有效上調FUNDC1的mRNA和蛋白表達，并顯著上調LC3的mRNA表達，表明LRME可通過上調FUNDC1和LC3促進HepG2細胞線粒體自噬，并抑制HepG2細胞存活，這與Chen等[21]研究結果一致.

4 結論

LRME可在體外有效促進線粒體自噬和內質網應激反應，促進HepG2細胞自噬，降低HepG2細胞活力.