彭青，溫彥靜，李茜，李曼，常美英

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝綜合征，作為妊娠期常見并發(fā)癥，其臨床發(fā)病率較高，占妊娠婦女的2%~8%，且在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)，如果未得到及時(shí)診斷及治療則發(fā)生流產(chǎn)、胎兒畸形、并發(fā)子癇前期等不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加［1］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力受損及螺旋動(dòng)脈血管重構(gòu)異常是子癇前期發(fā)展的基本特征［2］。研究顯示，高糖可誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一種抑癌基因，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞等凋亡，抑制細(xì)胞侵襲［4］。賈真等［5］研究顯示，PTEN在子癇前期胎盤中過表達(dá)，其過表達(dá)可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和血管生成能力。邱瑞瑩等［6］研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖代謝異常是子癇前期發(fā)病的危險(xiǎn)因素，顯著增加子癇前期發(fā)生率。目前有關(guān)PTEN在高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在探討PTEN在高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡中的作用機(jī)制，以期為深入研究人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常相關(guān)的病理性妊娠提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo（批號(hào)MCM-0599）購(gòu)自寧波明舟生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào)NBG1236）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清（批號(hào)36G5782）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素（批號(hào)FH673J）、二甲基亞砜（批號(hào)N6582J）、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)SI70019）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，批號(hào)1120-02-1）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制劑（GDC-0349，批號(hào)T6510）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PTEN-siRNA的陰性對(duì)照（批號(hào)SJ6009R）、PTEN-siRNA（批號(hào)SJ5002R）購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；胰蛋白酶（批號(hào)BD735N）、蛋白提取試劑盒（批號(hào)ME861R）、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（批號(hào)HUDY03）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved caspase-3）抗體（批號(hào)XIN-56）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體（批號(hào)XMN-68）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體、PTEN抗體（批號(hào)BYCM-10005059）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抗體（批號(hào)PL0402037）、磷酸化PI3K（p-PI3K）抗體（批號(hào)JCSW2521）、蛋白激酶B（AKT）抗體（批號(hào)FNab00273）、磷酸化AKT（p-AKT）抗體（批號(hào)F48643）、mTOR抗體（批號(hào)ATA33361）、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（批號(hào)IC194464）、GAPDH抗體（批號(hào)AL00167）、山羊抗兔二抗（批號(hào)674GN6）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)NHD DYE1738）購(gòu)自日本sanyo公司；Elx800酶標(biāo)儀（型號(hào)HSG9832）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)BeamCyte）購(gòu)自常州必達(dá)科生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)BioDoc-It220）購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置于37℃飽和濕度、5%CO2及20%O2培養(yǎng)箱中，穩(wěn)定傳代后收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 取1.2.1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo，重懸后接種于6孔板（1×106個(gè)/孔），待細(xì)胞融合度至80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用含10%滅活胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后分組。（1）空白對(duì)照組：僅加無血清培養(yǎng)基。（2）高糖組：加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液［7］處理48 h。（3）NC組（陰性對(duì)照組）：加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h后，加入5μL Lipofectamine 3000和PTEN-siRNA的陰性對(duì)照。（4）PTEN-siRNA組（抑制PTEN表達(dá)組）：加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h后，轉(zhuǎn)染PTEN-siRNA序列。（5）GDC-0349組（mTOR通路抑制劑組）：加入濃度為50 mmol/L葡萄糖溶液處理48 h，轉(zhuǎn)染PTEN-siRNA序列后，加入50μmol/L GDC-0349溶液［8］。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后用無血清新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖能力 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo，經(jīng)胰酶消化后接種至96孔板（5×104個(gè)/孔）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，向各孔加入MTT（5 g/L）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，再分別加入150μL二甲基亞砜振蕩15 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀中490 nm處測(cè)定各孔細(xì)胞光密度（OD），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，取平均值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=（空白對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD）/空白對(duì)照組OD×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo，PBS溶液洗滌2次，棄上清，并調(diào)節(jié)濃度至1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取100μL細(xì)胞懸液加入5μL的AnnexinV/PITC及10μL質(zhì)量濃度為20 mg/L的PI混勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。細(xì)胞凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。每組重復(fù)6次。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白及PTEN/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo，每組重復(fù)6次，PBS洗滌2次，冰上加裂解液，裂解30 min，離心取上清，Lowry法進(jìn)行蛋白定量。取50μg蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（95 mA電流）3 h。脫脂牛奶（5%）封閉3 h，加入cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、GAPDH抗體作為一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，次日加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）及TBST，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，采用Quantity One凝膠成像系統(tǒng)抓拍圖像并檢測(cè)各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖及凋亡情況比較 與空白對(duì)照組比較，高糖組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與高糖組、NC組比較，PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率均顯著降低（P＜0.05）；與PTENsiRNA組比較，GDC-0349組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖1、表1。

2.2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組比較，高糖組HTR-8/SVneo細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與高糖組、NC組比較，PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與PTEN-siRNA組比較，GDC-0349組HTR-8/SVneo細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.1 Flow cytometry of HTR-8/SVneo cell apoptosis in each group圖1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡流式圖

Tab.1 Comparison of the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HTR-8/SVneo cells between the five groups表1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率的比較（n=6，%，±s）

Tab.1 Comparison of the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HTR-8/SVneo cells between the five groups表1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率的比較（n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與高糖組比較，c與NC組比較，d與PTEN-siRNA組比較，P＜0.05；表2、3同。

組別空白對(duì)照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F細(xì)胞增殖抑制率0 29.32±5.82a 29.36±5.85a 12.56±2.92abc 21.53±3.58abcd 17.120＊＊凋亡率8.51±1.59 30.87±4.93a 30.00±4.95a 15.33±3.05abc 22.82±4.37abcd 34.671＊＊

2.3 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN/mTOR通路蛋白表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組比較，高糖組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著降低（P＜0.05）；與高糖組、NC組比較，PTEN-siRNA組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著升高（P＜0.05）；與PTEN-siRNA組比較，GDC-0349組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR顯著降低（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.2 Western blot detection of HTR-8/SVneo cell apoptosis-related proteins in each group圖2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白印跡圖

Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in HTR-8/SVneo cells between the five groups表2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in HTR-8/SVneo cells between the five groups表2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=6，±s）

組別空白對(duì)照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F Bcl-2 1.17±0.18 0.36±0.05a 0.35±0.04a 0.87±0.09abc 0.55±0.06abcd 78.174＊＊Bax 0.19±0.04 1.25±0.18a 1.26±0.19a 0.63±0.13abc 0.97±0.15abcd 56.575＊＊cleaved caspase-3 0.23±0.04 1.18±0.18a 1.19±0.19a 0.61±0.11abc 0.87±0.13abcd 50.034＊＊

Fig.3 Western blot detection of PTEN/mTOR pathway-related proteins in HTR-8/SVneo cells圖3 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN/mTOR通路蛋白印跡圖

Tab.3 Comparison of PTEN/mTOR pathway protein expression levels between five groups of HTR-8/SVneo cells表3各組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN/mTOR通路蛋白表達(dá)水平比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of PTEN/mTOR pathway protein expression levels between five groups of HTR-8/SVneo cells表3各組HTR-8/SVneo細(xì)胞PTEN/mTOR通路蛋白表達(dá)水平比較 （n=6，±s）

組別空白對(duì)照組高糖組NC組PTEN-siRNA組GDC-0349組F PTEN 0.20±0.03 1.07±0.16a 1.08±0.16a 0.70±0.10abc 0.69±0.09abc 55.543＊＊p-PI3K/PI3K 1.06±0.16 0.25±0.03a 0.26±0.04a 0.87±0.13abc 0.52±0.09abcd 74.672＊＊p-AKT/AKT 1.13±0.17 0.32±0.05a 0.33±0.05a 0.90±0.14abc 0.60±0.09abcd 61.671＊＊p-mTOR/mTORimages/BZ_16_377_2680_379_2682.png1.26±0.18 0.27±0.04a 0.28±0.05a 0.97±0.15abc 0.59±0.09abcd 84.559＊＊

3 討論

3.1 高糖抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖 研究顯示，妊娠合并糖尿病患者胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒畸形及先兆子癇等發(fā)生率高達(dá)6%~10%［9］。人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞來源于胚胎外胚層，具有類似腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)等生物學(xué)特性，能夠侵入母體蛻膜組織，為胚胎的發(fā)育提供充足的氧氣與營(yíng)養(yǎng)［10］。目前有關(guān)高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖抑制的機(jī)制尚未明晰。本研究通過采用含50 mmol/L葡萄糖RPMI-1640培養(yǎng)基模擬高糖環(huán)境，觀察高糖對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，高糖可抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖。

3.2 高糖促進(jìn)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞過度凋亡、細(xì)胞浸潤(rùn)能力減弱是子癇前期、胎兒畸形等發(fā)生的原因之一［11］。韓云等［12］研究發(fā)現(xiàn)，妊娠糖尿病合并胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限可能與人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞過度凋亡關(guān)系密切。Bcl-2是一種原癌基因，能抑制細(xì)胞凋亡［13］。Bax是人體最主要的促凋亡基因之一，當(dāng)受到誘導(dǎo)凋亡刺激時(shí)，兩者結(jié)合在線粒體膜上形成異二聚體，使線粒體膜通透性增加［14］。caspase-3是凋亡途徑的關(guān)鍵因素［15］。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，高糖組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡率升高，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高，且Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，與韓云等［12］研究結(jié)果一致，提示高糖可誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡。

3.3 高糖通過PTEN/mTOR通路影響人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和凋亡 PTEN是一種雙重脂質(zhì)磷酸酶，是一種抑癌因子。方曉珊等［16］研究顯示，子癇前期胎盤中PTEN高表達(dá)能夠加重母體內(nèi)皮損傷以及胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞損傷。且有研究證實(shí)，PTEN負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路［17］。PI3K是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的起始因子，其活化產(chǎn)生第二信使膜磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進(jìn)一步磷酸化AKT蛋白的Thr308位點(diǎn)，促使AKT活化，而活化的AKT磷酸化并激活其下游靶蛋白mTOR，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡［18］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)PTEN表達(dá)后HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低，且Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示抑制PTEN表達(dá)可以促進(jìn)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖，抑制其凋亡，可能與促進(jìn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，加入mTOR通路抑制劑可在一定程度上逆轉(zhuǎn)抑制PTEN表達(dá)對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖、凋亡的影響，進(jìn)一步提示下調(diào)PTEN表達(dá)可能通過激活PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮促HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，高糖可誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo凋亡，可能與上調(diào)PTEN表達(dá)、抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化有關(guān)，可為人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常相關(guān)的病理妊娠提供一定參考。本研究尚存在一定不足：首先，本研究未通過上、下游阻斷和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTEN調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)表型變化的影響；其次，僅測(cè)定了mTOR總蛋白的表達(dá)變化，未單獨(dú)檢測(cè)mTOR1和mTOR2的蛋白水平；另外，未能明確PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路在高糖誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡中的具體作用機(jī)制。后期仍需進(jìn)一步研究。