陳寶玲, 楊開太, 龔建英, 唐慶, 蘇莉花, 汪小玉, 龍定建

野生兜蘭菌根真菌對帶葉兜蘭生長和生理指標的效應(yīng)

陳寶玲, 楊開太*, 龔建英, 唐慶, 蘇莉花, 汪小玉, 龍定建

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，南寧 530002)

為探究蘭科菌根真菌對帶葉兜蘭()生長的影響，用4個分離自廣西野生兜蘭根部的蘭科菌根真菌(、、sp.和sp.)與帶葉兜蘭試管苗和營養(yǎng)缽苗進行菌-苗共生試驗，對其生長和生理指標的變化進行了研究。結(jié)果表明，接菌處理具有明顯的促進生長作用和生理效應(yīng)，和sp.對試管苗的接種效果最佳，鮮質(zhì)量增量、3種保護酶活性和葉綠素總量均與對照存在顯著或極顯著差異，鮮質(zhì)量增加了360%～380%。、sp.對營養(yǎng)缽苗的接種效果最佳，鮮質(zhì)量增量、葉面積及3種保護酶活性均與對照存在顯著或極顯著差異，鮮質(zhì)量增加了261%～330%。因此，實際生產(chǎn)中可在帶葉兜蘭不同生長階段接種適當(dāng)菌株，sp.對帶葉兜蘭表現(xiàn)出較好的促生效應(yīng)，可研發(fā)為帶葉兜蘭育苗期通用型有益菌劑。

帶葉兜蘭；蘭科菌根真菌；生理特性；保護酶

兜蘭屬()是蘭科(Orchidaceae)植物中瀕危程度最高的類群，野生種群小、個體數(shù)量少、分布區(qū)域有限，兜蘭屬所有種均被列入野生動植物瀕危物種國際貿(mào)易公約(CITES)附錄I的保護范圍[1-2]。由于兜蘭的自然繁殖力極低，成苗緩慢，導(dǎo)致兜蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展進程遲緩。幾乎所有的蘭科植物都與菌根真菌有著共生關(guān)系。已有的研究表明，菌根真菌對蘭科植物具有獨特的生態(tài)功能，如促進種子萌發(fā)和幼苗的形態(tài)建成，幫助蘭科植物的生態(tài)入侵，影響生物群落組成及制備特定功效的生物誘導(dǎo)子，利于生態(tài)系統(tǒng)的保護、恢復(fù)或重建等方面[3]。究其機理，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，菌根真菌通過消化菌絲為胚細胞提供必需的營養(yǎng)，刺激植物產(chǎn)生赤霉素、IAA等激素，煙酸和煙酰胺等維生素，此外, 菌根真菌可在植物體內(nèi)合成植保素，進一步激發(fā)SOD、POD、CAT和PAL等的活性[4]，增強宿主植物的抗性[5-6]，同時，當(dāng)菌根真菌定殖成功并成為有益的優(yōu)勢菌群后，釋放的拮抗物質(zhì)將有效增強蘭科植物的抗病能力，對于提高幼苗的成活率和促進植株的生長具有重要意義，蘭科菌根真菌成為新的研究熱點，特別是在園藝學(xué)和植物保護學(xué)中的應(yīng)用和功效引起高度重視[7-9]，利用蘭科菌根真菌提高珍稀種類組培苗的移栽成活率、促進植株生長及保育等方面已有研究報道[10-14]，如石斛屬()、金線蓮屬()、兜蘭屬、蘭屬()、五唇蘭屬()等，將菌根化育苗技術(shù)引入人工栽培后，顯著提高了幼苗移栽成活率、鮮質(zhì)量增長率、干物質(zhì)積累和礦質(zhì)元素吸收[7,15-16]，部分菌根真菌的代謝產(chǎn)物可分泌赤霉素、IAA等植物生長調(diào)節(jié)劑[17]。目前，兜蘭屬植物有關(guān)菌根真菌的研究主要在內(nèi)生真菌的分離、鑒定[18-24]、共生萌發(fā)[25]、專一性和多樣性[26]等方面，而蘭科菌根真菌與兜蘭屬植物共生的生長和生理效應(yīng)等研究鮮有報道。本研究將分離篩選到的蘭科菌根真菌與帶葉兜蘭試管苗及營養(yǎng)缽苗分別進行共生培養(yǎng)，探討菌根真菌對帶葉兜蘭各生長階段生長和生理指標的影響，明確蘭科菌根真菌的促生機理，應(yīng)用于菌根化育苗實踐中，促進兜蘭種苗的快速繁育, 并縮短成苗周期，為珍稀瀕危植物的保育提供理論基礎(chǔ)，并為促進兜蘭產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

試管苗共生培養(yǎng)采用帶葉兜蘭()壯苗期生長健壯在DE培養(yǎng)基[10]中培養(yǎng)的無菌組培苗，具有3～4條根和3～4片葉。營養(yǎng)缽苗共生培養(yǎng)采用生根期的試管苗，具有5～6條根和4～5片葉，營養(yǎng)缽苗移栽基質(zhì)為松樹皮∶火山巖∶木炭(體積比)=4∶2∶1。

菌株P(guān)F01、PF02、PF06和PF07，其中PF01、PF06和PF07分離自廣西天峨縣野生帶葉兜蘭新鮮營養(yǎng)根中，PF02分離自廣西那坡縣野生紫紋兜蘭()新鮮營養(yǎng)根中，經(jīng)篩選均為帶葉兜蘭幼苗的益生菌株，經(jīng)根部重分離驗證為菌根真菌。經(jīng)16S rDNA序列測定和分析，PF01為、PF02為、PF06為sp.、PF07為sp.。

1.2 方法

菌株活化 將4個菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板上，置入光照培養(yǎng)箱28 ℃暗培養(yǎng)5～7 d活化菌株。

液體菌劑制備 用直徑5 mm的打孔器于活化的4個菌株菌落邊緣打孔制作成菌餅，將菌餅移入到盛有150 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種菌餅2～3塊，置于28 ℃140 r/min的搖床上培養(yǎng)10 d，然后過濾菌絲體，無菌水沖洗3～5次后，添加無菌水定容至300 mL，用組織搗碎機破碎5 min，最后用無菌水稀釋5倍, 即制成菌懸液。

營養(yǎng)缽苗處理 將生根60 d的試管苗置于大棚內(nèi)煉苗7～10 d后，洗去根部附著的培養(yǎng)基, 并用稀釋1 000倍的50%多菌靈可濕性粉劑水溶液浸泡10 min，置于陰涼處攤開晾干表面的水分，移栽入1.5寸塑料透明軟杯(口徑×高×底徑=5 cm×5 cm× 3.5 cm)。

試管苗接種菌株 將活化菌株用直徑5 mm的打孔器于菌落邊緣打孔取菌餅，無菌條件下將菌餅接種到HT-220組培瓶(220 mL，口徑×胸徑×高5.6 cm×6.9 cm×9.1 cm)中心，在周邊接種幼苗。培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，光照強度為25mol/(m2·s), 光照時間為12 h/d。2株/瓶，每處理30瓶，3次重復(fù)。共生培養(yǎng)120 d后，以瓶為單位統(tǒng)計鮮質(zhì)量、葉長、葉寬和平均根長等生長指標。

營養(yǎng)缽苗接種菌株 于試管苗移栽當(dāng)天澆施第1次菌液10 mL/杯，以澆施等量無菌水為對照，以后每隔20 d澆施1次菌液，共澆施3～4次，期間停止施肥及用農(nóng)藥。移栽后隔5～7 d淋1次無菌水，期間視空氣濕度情況適當(dāng)進行葉面噴霧，保持溫度(26±2) ℃，相對濕度70%～85%，遮陰率70%～ 80%。2株/杯，每處理30杯，3次重復(fù)。共生培養(yǎng)120 d后，統(tǒng)計幼苗移栽成活率、鮮質(zhì)量、葉長、葉寬和新根數(shù)等生長指標。

生理指標的測定 共生培養(yǎng)120 d后，采集新鮮葉片測定保護酶活性。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性的測定采用李合生[26]的方法；葉綠素含量用丙酮提取法[26]測定。均設(shè)3次重復(fù)。

蘭科菌根真菌的重分離 分別取接種菌株和不接種的帶葉兜蘭試管苗和營養(yǎng)缽苗若干，挑選新生根系，用0.1%的HgCl2溶液表面消毒1 min后，用無菌水清洗4次，然后采用組織塊分離法進行菌根真菌的重分離，置于含1L/mL慶大霉素的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)7～10 d，觀察根段的菌落生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，并采用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan’s新極復(fù)差檢驗。

單葉葉面積(cm2)采用長寬系數(shù)法測定，校正系數(shù)采用復(fù)印稱重法[27]測定, 葉面積=葉長×葉寬×校正系數(shù)(0.8317)。

2 結(jié)果和分析

2.1 共生關(guān)系的建立

共培養(yǎng)120 d后，從接種菌株的試管苗根部重分離出相應(yīng)的4個原接種菌株，分離率為83.0%～ 92.5%，且未分離出其他菌株，而試管苗對照則未分離出任何菌株。從接種菌株的營養(yǎng)缽苗根部也重分離出相應(yīng)的原接種菌株，分離率為50.0%～65.0%,接種PF02菌株的營養(yǎng)缽苗中還分離出少量的鐮刀菌菌株(5.5%)，而在對照植株中主要分離到鐮刀菌菌株()，分離率達37.5%。說明原接種菌株與帶葉兜蘭幼苗形成了共生關(guān)系，確定為帶葉兜蘭的蘭科菌根真菌。

2.2 對生長的影響

共生培養(yǎng)120 d后，不同處理的帶葉兜蘭試管苗長勢、葉片和根系的表現(xiàn)明顯不同，且接種菌株試管苗顯示出明顯優(yōu)勢，但不同菌株間的鮮質(zhì)量增加不存在顯著差異(圖1)，然而接種菌株試管苗鮮質(zhì)量與對照的差異極顯著(<0.01)，提高了320.0%～ 380.0%。植株長勢表現(xiàn)出明顯差異，接種菌株的試管苗生長旺盛，而對照植株矮小(圖2)。接種菌株試管苗的根系明顯發(fā)達，長且粗壯，黃褐色，接種不同菌株的根系長度存在顯著或極顯著差異(圖3)。其中，接種PF07試管苗根系最長，達2.8 cm，其次是PF01和PF06，分別為2.3和2.2 cm，與對照的差異極顯著，比對照分別提高了129.5%、88.5%和80.3%，對照的根系短細，黃綠色。接種菌株試管苗的葉面積差異不顯著(圖4)，但接種PF01的葉面積增長量最大，葉片油綠且舒展，達1.11 cm2，其次是PF06和PF02，分別比對照提高了37.0%、22.2%和12.3%，葉片油綠，略下垂，而CK處理的葉片黃綠色。接種菌株后，試管苗快速生長，鮮質(zhì)量、新根長度和葉面積增長極顯著，接種PF01、PF07和PF06對帶葉兜蘭試管苗生長促進效果最佳，其中，PF01極大提高了試管苗對培養(yǎng)基中水分的吸收, PF07顯著促進了新根的生長，PF06促進了試管苗葉片和新根的生長。

試管苗移栽與菌株共培養(yǎng)120 d后，帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗的生長表現(xiàn)顯著差異。接種PF06的鮮質(zhì)量增長最多，達到1.90 g，比對照提高了360.3%, 差異極顯著，比接種PF01的提高了66.4%，差異顯著(<0.05)，植株生長旺盛，根系粗壯，葉片深綠色、斜立且舒展；而接種PF02、PF07間的鮮質(zhì)量增長差異不顯著，但與對照的差異極顯著，分別提高了330.1%和261.6%。對照植株弱小，部分葉片出現(xiàn)黑斑病和軟腐病，根系短，葉片黃綠色、略翻卷且細長(圖5)。接種菌株的營養(yǎng)缽苗根系長度差異較大, 接種PF02菌株的營養(yǎng)缽苗根系最長，達6.47 cm, 比PF01和對照分別提高了102.8%和71.6%, 差異極顯著，且根系粗壯，分支較多；接種PF06和PF07的根系長度與接種PF01和對照的差異不顯著，每株3～5條根，根較細，分支較少(圖6)。接種菌株的營養(yǎng)缽苗葉面積差異顯著，以接種PF06的葉片最大，深綠色且舒展，達5.72 cm2，比CK提高了52.1%，差異極顯著，比接種PF07的提高了37.2%,差異顯著；其次是接種PF07菌株的葉面積為5.41 cm2, 比對照提高了43.9%，差異顯著，葉片略外彎，細長(圖7)。由此可見，生根試管苗移栽后，通過多次澆施菌株可較好的建立菌-苗共生關(guān)系，營養(yǎng)缽苗快速生長(圖8)，鮮質(zhì)量顯著增加，抵抗力增強。PF02和PF06對帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗生長的促進效果最佳，PF02可促進新根的伸長生長，PF06菌株的菌絲有利于擴大根系對水分的吸收范圍，促進生物量積累。

圖1 野生兜蘭有益真菌對帶葉兜蘭試管苗鮮質(zhì)量增長量的影響。**: P< 0.01; *: P<0.05。

圖2 帶葉兜蘭試管菌根苗和非菌根苗(CK)

圖3 野生兜蘭有益真菌對帶葉兜蘭試管苗新根長度的影響。**: P<0.01; *: P<0.05.

圖4 野生兜蘭有益真菌對帶葉兜蘭試管苗葉面積的影響

2.3 對生理指標的影響

帶葉兜蘭試管苗與菌株共生培養(yǎng)120 d后，葉片POD、CAT、SOD活性和葉綠素總量均顯著提高，與對照有差異顯著或極顯著(表1)。接種PF06植株葉片的POD、CAT、SOD活性和葉綠素總量增長較大, 分別為116.40 U/g、263.07 nmol/g、1748.70 U/g和0.76 mg/g, 分別比對照提高344.1%、472.8%、256.4%和68.9%；接種PF01植株葉片的POD、CAT、SOD活性和葉綠素總量分別為60.36 U/g、512.98 nmol/g、1452.91 U/g和0.73mg/g，比對照分別提高130.3%、1016.9%、196.1%和62.2%，說明接種菌株有利于提高植株葉片的保護酶活性和葉綠素含量?？梢? 帶葉兜蘭試管苗接種菌株后形成菌根，保護酶活性呈動態(tài)變化，植株的免疫效應(yīng)和光合效率提高, PF01與PF06對帶葉兜蘭試管苗生理指標的促進效應(yīng)最佳，PF01提高了CAT和SOD活性，PF06菌株提高了POD和SOD活性，且在顯著促進植株鮮質(zhì)量增加時，光合效率也提高，保證了植株基本代謝進程的穩(wěn)定。

圖5 野生兜蘭有益真菌對帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗鮮質(zhì)量增長量的影響。**: P<0.01; *: P<0.05.

圖6 野生兜蘭有益真菌對帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗新根長度的影響。*: P<0.05.

圖7 野生兜蘭有益真菌對帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗葉面積的影響。**: P<0.01; *: P<0.05.

帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗與菌株共生培養(yǎng)120 d后, 各生理指標也不同程度的提高，說明菌株處理營養(yǎng)缽苗可顯著或極顯著增強3種保護酶活性，尤其是POD活性，但葉綠素總量的差異不顯著(表2)。接種PF06菌株的營養(yǎng)缽苗葉片POD、CAT和SOD活性大幅提高，分別為365.04 U/g、132.63 nmol/g和252.34 U/g，分別比對照提高了263.5%、242.4%和170.4%，差異極顯著；接種PF02的葉片POD、CAT、SOD活性分別為349.52 U/g、71.25 nmol/g和172.81U/g，比對照分別提高了248.1%、83.9%和85.2%，差異顯著或極顯著。這表明，帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗在與菌根形成共生過程中，營養(yǎng)缽苗葉片保護酶活性激發(fā)，提高了植株的免疫效應(yīng)，PF02與PF06對帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗生理指標的促進效應(yīng)最佳, PF06優(yōu)于PF02。然而在自然遮陰條件下, 活菌對營養(yǎng)缽苗葉綠素含量的促進作用不顯著。

圖8 帶葉兜蘭營養(yǎng)缽菌根苗與非菌根苗(CK)

表1 接種兜蘭有益真菌對帶葉兜蘭試管苗生理指標的影響

**:<0.01; *:<0.05.

表2 接種兜蘭有益真菌對帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗生理指標的影響

**:<0.01; *:<0.05.

3 結(jié)論和討論

在長期的協(xié)同進化過程中，蘭科植物與蘭科菌根真菌形成特異的菌物體系，許多真菌能夠與植物形成菌根，相互共生，彼此依賴。菌根真菌從蘭科植物根部獲取所需的碳水化合物和其他營養(yǎng)元素, 同時也為蘭科植物的生長發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)、酶等。菌根的有益作用能否充分發(fā)揮，決定于菌根真菌能否對宿主植物進行有效侵染、定殖，以及菌根真菌的作用效果[5]。研究表明，龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)增加了植物根系的吸收面積，菌根的代謝活動提高了蘭科植物對難溶不易被作物吸收礦物元素的吸收，產(chǎn)生的植物激素、維生素、氨基酸等代謝產(chǎn)物既能促進植株生長，又可作為誘導(dǎo)因子激活并增強植株體內(nèi)保護酶活性及抗性[27-34]。SOD、POD和CAT是植物體膜系統(tǒng)的3大保護酶，其活性是鑒定植物抗逆性強弱的主要指標[5-6]。

在本試驗中，DE培養(yǎng)基作為試管苗共生培養(yǎng)基，碳氮含量低，營養(yǎng)相對貧瘠，帶葉兜蘭試管苗接種菌株后，生長加快，尤其是提高了試管苗的水分吸收能力，鮮質(zhì)量增長極顯著，說明保持真菌和幼苗適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)平衡是兜蘭屬植物適應(yīng)自然生境的關(guān)鍵。PF01與PF06對帶葉兜蘭試管苗生長和生理指標的促進效應(yīng)最佳，PF01極大提高了試管苗對于培養(yǎng)基中水分的吸收，激發(fā)了葉片CAT和SOD活性；PF06菌株促進了試管苗葉片和新根的生長，激發(fā)了葉片POD和SOD活性，且提高了試管苗葉綠素總量。

而試管苗出瓶移栽后，PF02與PF06對帶葉兜蘭營養(yǎng)缽苗的生長和生理指標的促進效應(yīng)最佳, PF02促進營養(yǎng)缽苗新根的伸長生長，PF06擴大了根系對水分的吸收范圍，促進生物量的積累，且提高了POD、CAT和SOD活性。這說明不同菌根真菌雖然對帶葉兜蘭不同生長階段幼苗的生長和生理指標的促進作用存在差異，但均有效提高了幼苗的生物量增長，同時激發(fā)了葉片保護酶活性，并也提高了植株的光合作用。這與前人[7,14,35-37]的研究結(jié)果一致，即不同菌根真菌對蘭科植物的促生效果不同，基質(zhì)水分含量和光照強度也會影響植株的生長與生理代謝[34,36]。

此外，本研究結(jié)果表明，4個菌株對帶葉兜蘭均不致病，但不同菌株對其生長的影響存在差異, PF06為瓶霉屬菌株，在2個苗期均表現(xiàn)出較穩(wěn)定的促生效果，大部分生長指標顯著高于對照，說明該菌株的促生作用較為穩(wěn)定。PF01對營養(yǎng)缽苗的促生效果不明顯，但對試管苗的促生效果顯著，說明各菌株有最適宜的生長環(huán)境，PF01更適宜干擾較少的瓶內(nèi)菌苗共生條件。此外，PF06對營養(yǎng)缽苗生長指標的促進效應(yīng)比試管苗的大，這可能與營養(yǎng)缽苗植株較大，正處于旺盛生長期，再加上受戶外環(huán)境影響，可更多地吸收空氣中的水分和養(yǎng)分。這與謝玲等[11]對鐵皮石斛()共生研究的結(jié)果一致，深色有隔內(nèi)生真菌24L-4對組培苗和盆栽苗均表現(xiàn)出顯著的促生作用，但盆栽苗表現(xiàn)更好。因此，生產(chǎn)中可優(yōu)選在試管苗移栽后接種蘭科菌根真菌，此階段開展規(guī)模化菌根育苗，不僅可高效建立共生關(guān)系，而且可操作強，生產(chǎn)效率高。

在本研究中，對植株促生效果最佳的菌株也有較好的生理效應(yīng)，保護酶活性和光合色素含量均提高，呈正相關(guān)效應(yīng)，可能是共生關(guān)系的建立促進了帶葉兜蘭根系對養(yǎng)分和水分的吸收，蘭科菌根真菌分泌的淀粉酶能夠提高帶葉兜蘭的碳水化合物利用水平，加快營養(yǎng)吸收，生物量增長迅速，進一步提高葉片的光合作用和光合產(chǎn)物的同化能力，從而提高了兜蘭幼苗的光合性能，同時，蘭科菌根真菌的合成功能促使菌絲團產(chǎn)生多種植物生長調(diào)節(jié)劑、酶前體等有利于兜蘭生長發(fā)育的活性物質(zhì)[38]，這些又極大的促進了植株的茁壯生長。

帶葉兜蘭對生長環(huán)境要求嚴格，今后應(yīng)進一步深入研究了解兜蘭菌根特點，篩選優(yōu)良的兜蘭菌根真菌資源，尤其是PF06有望開發(fā)為兜蘭幼苗生長的通用菌株，進一步研究其生物學(xué)特性，開展微生物互作、抗性和不同生長階段的保護酶活性研究, 以及探明活菌與菌株發(fā)酵液活性成分對兜蘭生長的促生機理，研發(fā)兜蘭的微生物菌肥，可提高帶葉兜蘭的種苗質(zhì)量，增強環(huán)境適應(yīng)性，擴大生產(chǎn)和栽培區(qū)域，開展高效種植，將極大促進兜蘭產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，同時，可為兜蘭的保育研究提供技術(shù)支撐。

[1] LUO Y B, JIA J S, WANG C L.Conservation strategy and potential advantages of the Chinese[J].Biodiv Sci, 2003, 11(6): 491?498.doi: 10.3321/j.issn:1005-0094.2003.06.009.

羅毅波, 賈建生, 王春玲.初論中國兜蘭屬植物的保護策略及其潛在資源優(yōu)勢 [J].生物多樣性, 2003, 11(6): 491?498.doi: 10.3321/ j.issn:1005-0094.2003.06.009.

[2] LIU Z J, CHEN X Q, CHEN L J, et alThe Genusin China [M].Beijing: Science Press, 2009: 1?10.

劉仲健, 陳心啟, 陳利君, 等.中國兜蘭屬植物 [M].北京: 科學(xué)出版社, 2009: 1?10.

[3] GAI X G, XING X K, GUO S X.Ecological research of orchid mycorrhizae: A review [J].Mycosystema, 2014, 33(4): 753-767.doi: 10.13346/j.mycosystema.140024.

蓋雪鴿, 邢曉科, 郭順星.蘭科菌根的生態(tài)學(xué)研究進展 [J].菌物學(xué)報, 2014, 33(4): 753-767.doi: 10.13346/j.mycosystema.140024.

[4] HOU P Y, GUO S X.Influences of fungussp.on activities of some enzymes and extracellular pH of protocorms of[J].Microbiol China, 2004, 31(2): 26?29.

侯丕勇, 郭順星.真菌對鐵皮石斛原球莖酶活性和胞外pH的影響 [J].微生物學(xué)通報, 2004, 31(2): 26?29.

[5] XU C, WU X Q.Drought resistance ofseedlings inoculated with ectomycorrhizal fungi [J].J W China For Sci, 2004, 41(6): 43?47.doi: 10.3969/j.issn.1672-8246.2012.06.008.

徐超, 吳小芹.菌根化馬尾松植株抗旱性研究 [J].西部林業(yè)科學(xué), 2012, 41(6): 47?51.doi: 10.3969/j.issn.1672-8246.2012.06.008.

[6] DENG Y, CHANG M S, ZHU Y Z, et al.Protective enzyme activity in leaves of differentcultivars [J].J S Agric, 2016, 47 (5): 686?689.doi: 10.3969/j:issn.2095-1191.2016.05.686.

鄧艷, 常明山, 朱英芝, 等.不同油茶品種葉片3種保護酶活性分析 [J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2016, 47(5): 686?689.doi: 10.3969/j:issn.2095- 1191.2016.05.686.

[7] ZHU X M, HU H, LI S Y, et al.Interaction between endophytic fungi and seedlings of two species ofduring symbiotic culture [J].Plant Div Resour, 2012, 34(2): 171-178.doi: 10.3724/SP.J.1143.2012.11144.

朱鑫敏, 胡虹, 李樹云, 等.內(nèi)生真菌與兩種兜蘭共培養(yǎng)過程中的相互作用 [J].植物分類與資源學(xué)報, 2012, 34(2): 171?178.doi: 10.3724/SP.J.1143.2012.11144.

[8] RASMUSSEN H N, RASMUSSEN F N.Trophic relationships in orchid mycorrhiza: Diversity and implications for conservation [J].Lankesteriana, 2007, 7(1/2): 334?341.doi: 10.15517/LANK.V7I1-2.19560.

[9] ZETTLER L W, POULTER S B, MCDONALD K I, et al.Conser- vation: Driven propagation of an epiphytic orchid () with a mycorrhizal fungus [J].HortScience, 2007, 42(1): 135? 136.doi: 10.21273/HORTSCI.42.1.135.

[10] CHEN B L.Re-introduction technology based on mycorrhizal fungi in the conservation of an endangered orchid:[D].Haikou: Hainan University, 2010: 20?56.

陳寶玲.瀕危植物美花石斛基于菌根真菌的再引入技術(shù)初步研究 [D].?？? 海南大學(xué), 2010: 20?56.

[11] XIE L, ZHANG W L, QIN L P, et al.Inoculation effects of dark septate endophytes (DSE) on the growth ofseedling [J].J S Agric, 2014, 45(6): 1010-1014.doi: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.6.1010.

謝玲, 張雯龍, 覃麗萍, 等.深色有隔內(nèi)生真菌(DSE)引進菌株對鐵皮石斛的接種效應(yīng) [J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2014, 45(6): 1010?1014.doi: 10.3969/j:issn.2095-1191.2014.6.1010.

[12] HOU T W, JIN H, LIU H X, et al.Mycorrhizal specificity ofa inresearch [J].Acta Phytoecol Sin, 2010, 34(12): 1433?1438.doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.12.009.

侯天文, 金輝, 劉紅霞, 等.實驗室條件下五唇蘭菌根真菌專一性研究[J].植物生態(tài)學(xué)報, 2010, 34(12): 1433?1438.doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.12.009.

[13] WU H F, SONG X Q, YANG F S, et al.Effects of symbiotic fungi on the physiological characteristics ofLindley (Orchidaceae) [J].Plant Sci J, 2011, 29(6): 738?742.doi: 10.3724/SP.J.1142.2011.60738.

吳慧鳳, 宋希強, 楊福孫, 等.共生真菌對鐵皮石斛幼苗生理特性的影響 [J].植物科學(xué)學(xué)報, 2011, 29(6): 738?742.doi: 10.3724/SP.J.1142.2011.60738.

[14] LIU S, CHEN C L, LIU M, et al.Comparing the symbiotic effects of two endophytes on growth of[J].J Huazhong Agric Univ, 2016, 35(1): 43?49.

, 等.[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2016, 35(1): 43?49.

[15] JIN H, XU Z X, CHEN J H, et alInteraction between tissue-cultured seedlings ofand mycorrhizal fungus (sp.) during symbiotic culture [J].Chin J Plant Ecol, 2009, 33(3): 433-441.doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2009.03.002.

金輝, 許忠祥, 陳金花, 等.鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養(yǎng)過程中的相互作用[J].植物生態(tài)學(xué)報, 2009, 33(3): 433?441.doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2009.03.002.

[16] ZHAO Y J, GUO S X, GAO W W, et al.The symbiosis of three endophytic fungi withsp.and its effects on the mineral nutrition absorption [J].Acta Hort Sin, 1999, 26(2): 110?115.doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.1999.02.009.

趙楊景, 郭順星, 高薇薇, 等.三種內(nèi)生真菌與大花蕙蘭共生對礦質(zhì)營養(yǎng)吸收的影響 [J].園藝學(xué)報, 1999, 26(2): 110?115.doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.1999.02.009.

[17] NONTACHAIYAPOOM S, SASIRAT S, MANOCH L.Isolation and identification of-like fungi from roots of three orchid genera,,, and, collected in Chiang Rai and Chiang Mai Provinces of Thailand [J].Mycorrhiza, 2010, 20(7): 459?471.doi: 10.1007/s00572-010-0297-3.

[18] WANG X G, LU J S, ZHOU Z G, et alIsolation and preliminary identification of mycorrhizal fungi from(Orchidaceae) [J].SW China J Agric Sci, 2016, 29(2): 316?320.doi: 10.16213/j.cnki.scjas.2016.02.020.

王曉國, 盧家仕, 周主貴, 等.帶葉兜蘭菌根真菌分離和初步鑒定 [J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2016, 29(2): 316?320.doi: 10.16213/j.cnki.scjas.2016.02.020.

[19] YI J, CHENG J, ZHANG Q X.Composition and diversity analysis on mycorrhizal fungi from fourspecies in Xingyi, Guizhou[C]// Advances in Ornamental Horticulture of China.Chengdu:Chinese Society of Horticultural Science, 2017: 84?89.

裔景, 程瑾, 張啟翔.貴州興義四種兜蘭屬植物菌根真菌的組成與多樣性分析 [C]// 中國觀賞園藝研究進展.成都: 中國園藝學(xué)會, 2017: 84?89.

[20] TIAN F, ZHU G S, GUI Y, et alStudy on isolation and culture charac- teristics ofmycorrhizal fungi [J].N Hort, 2012(7): 61?64.

田凡, 朱國勝, 桂陽, 等.硬葉兜蘭菌根真菌的分離及培養(yǎng)特性研究 [J].北方園藝, 2012(7): 61?64.

[21] TIAN F, LIAO X F, YAN F X, et al.Structure and spatial distribution of mycorrhizal fungi ina [J].Jiangsu Agric Sci, 2019, 47(2): 105?108.doi: 10.15889/j.issn.1002-1302.2019.02.024.

田凡, 廖小鋒, 顏鳳霞, 等.硬葉兜蘭菌根結(jié)構(gòu)及菌根真菌空間分布特征 [J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 47(2): 105?108.doi: 10.15889/j.issn.1002-1302.2019.02.024.

[22] TIAN F, LIAO X F, WANG L H, et al.Classification and identifition of mycorrhizal fungi of[J].N Hort, 2017(24): 116?122.doi: 10.11937/bfyy.20171417.

田凡, 廖小鋒, 王蓮輝, 等.硬葉兜蘭菌根真菌的分類鑒定 [J].北方園藝, 2017(24): 116?122.doi: 10.11937/bfyy.20171417.

[23] YANG J, REN J F, JIANG D Q, et al.Morphological characteristics and identification of mycorrhizal fungi fromin Hainan [J].Agric Inf China, 2015(22): 30?32.doi: 10.3969/j.issn.1672-0423.2015.11.010.

楊珺, 任軍方, 姜殿強, 等.海南卷萼兜蘭菌根真菌形態(tài)學(xué)特征與鑒定 [J].中國農(nóng)業(yè)信息, 2015(22): 30?32.doi: 10.3969/j.issn.1672- 0423.2015.11.010.

[24] SUN X Y, ZHANG W F, LIU H X.symbiotic seed germination, isolation and identification of effective mycorrhizal fungus in(Orchidaceae) [J].J Trop Subtrop Bot, 2015, 23(1): 59?64.doi: 10.11926/j.issn.1005-3395.2015.01.009.

孫曉穎, 張武凡, 劉紅霞.帶葉兜蘭種子原地共生萌發(fā)及有效菌根真菌的分離與鑒定 [J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2015, 23(1): 59?64.doi: 10.11926/j.issn.1005-3395.2015.01.009.

[25] SUN X Y.Diversity of mycorrhizal fungi Isolated from five species of the genus[D].Beijing: Beijing Forestry University, 2014: 10?38.

孫曉穎.五種野生兜蘭植物菌根真菌多樣性研究 [D].北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2014: 10?38.

[26] YUAN L, YANG Z L, LI S Y, et al.Mycorrhizal specificity, prefe- rence, and plasticity of six slipper orchids from South Western China [J].Mycorrhiza, 2010, 20(8): 559?568.doi: 10.1007/s00572-010- 0307-5.

[27] HU J F, GUO Y, LI M, et al.Research on correction coefficient from leaf area for different soybean leaf forms [J].J Beijing Univ Agri, 2012, 27(1): 9?11.doi: 10.3969/j.issn.1002-3186.2012.01.003.

胡家峰, 郭遠, 李夢, 等.大豆不同葉形葉面積校正系數(shù)的研究 [J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2012, 27(1): 9?11.doi: 10.3969/j.issn.1002-3186.2012.01.003.

[28] LI H S.Modern Plant Physiology [M].3rd ed.Beijing: Higher Education Press, 2012: 330-340.

李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué) [M].第3版.北京: 高等教育出版社, 2012: 330-340.

[29] HUANG Q L, YUAN Z S, LIU Y L, et al.Effect of combined inducing bacteria inoculation on the growth ofvarseedlings [J].J SW For Univ, 2020, 40(5): 40-47.doi: 10.11929/j.swfu.201908024.

黃秋良, 袁宗勝, 劉酉琳, 等.促生菌組合接種對芳樟苗生長的影響 [J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2020, 40(5): 40-47.doi: 10.11929/j.swfu.201908024.

[30] CHEN M M, CHEN B D, WANG X J, et al.Influences of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on the growth and ecological stoichiometry of clover and ryegrass grown in monoculture or in mixture at different phosphorus (P) levels [J].Acta Ecol Sin, 2009, 29(4): 1980?1986.doi: 10.3321/j.issn:1000-0933.2009.04.043.

陳梅梅, 陳保冬, 王新軍, 等.不同磷水平土壤接種叢枝菌根真菌對植物生長和養(yǎng)分吸收的影響 [J].生態(tài)學(xué)報, 2009, 29(4): 1980? 1986.doi: 10.3321/j.issn:1000-0933.2009.04.043.

[31] RANIERI A, CASTAGNA A, BALDAN B, et al.Iron deficiency differently affects peroxidase isoforms in sunflower [J].J Exp Bot, 2001, 52(354): 25?35.doi: 10.1093/jexbot/52.354.25.

[32] CHEN H J.Application and functional species and effect evaluation in microbial fertilizers [D].Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2013: 12?46.

陳慧君.微生物肥料菌種應(yīng)用與效果分析 [D].北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013: 12?46.

[33]VESSEY J K.Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers [J].Plant Soil, 2003, 255(2): 571?586.doi: 10.1023/A:1026037216893.

[34]DING C Y, QIAO H Y, SHEN Q R, et al.Control effect and action mechanism research of bio-organic fertilizer on eggplant bacterial wilt [J].Sci Agric Sin, 2012, 45(2): 239?245.doi: 10.1023/A:10260372 16893.

丁傳雨, 喬煥英, 沈其榮, 等.生物有機肥對茄子青枯病的防治及其機理探討 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(2): 239?245.doi: 10.1023/ A:1026037216893.

[35] ZHOU Y J, YANG F S, SONG X Q, et al.Effects of mycorrhizal fungi on seedling’s growth and photosynthetic capability of, endemic to Hainan [J].N Hort, 2009(12): 11?15.‘

周玉杰, 楊福孫, 宋希強, 等.菌根真菌對華石斛幼苗生長及光合性能的影響 [J].北方園藝, 2009(12): 11?15.

[36] CHEN J H, WANG C, HUANG S R, et al.Effects of three kinds of mycorrhizal fungi on growth ofseedling [J].Guangdong Agric Sci, 2017, 44(4): 46?52.doi: 10.16768/j.issn.1004- 874X.2017.04.008.

陳金花, 王存, 黃素榮, 等.3株菌根真菌對海南鉆喙蘭幼苗生長的影響 [J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 44(4): 46?52.doi: 10.16768/j.issn.1004-874X.2017.04.008.

[37] LI J L, ZHAO Z, LUO C L, et al.Comprehensive evaluation of the effects of different light intensity and water content on the growth and physiology of[J].J Chin Med Mat, 2017, 40(10): 2262?2265.doi: 10.16768/j.issn.1004-874X.2017.04.008.

李金玲, 趙致, 羅春麗, 等.不同光照強度和水分對金釵石斛生長與生理影響的綜合評價 [J].中藥材, 2017, 40(10): 2262?2265.doi: 10.16768/j.issn.1004-874X.2017.04.008.

[38] WU Y D, DU C M, SHEN J, et al.Effects of mycorrhizal fungi on seed germination and seedling growth of orchids [J].S China Agric, 2017, 11(30): 97.doi: 10.13863/j.issn1001-4454.2017.10.005.

吳玉德, 杜春梅, 申健, 等.蘭科植物菌根真菌對種子萌發(fā)苗木生長的影響研究 [J].南方農(nóng)業(yè), 2017, 11(30): 97.doi: 10.13863/j.issn1001-4454.2017.10.005.

Effects of Wild Paphiopedilum Mycorrhizal Fungi on Growth and Physiological Indexes ofSeedlings

CHEN Baoling, YANG Kaitai*, GONG Jianying, TANG Qing, SU Lihua, WANG Xiaoyu, LONG Dingjian

(Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute,Nanning 530002, China)

To investigate the effects of mycorrhizal fungi on the growth of, four strains, such as,,sp.andsp., isolated from roots of wild, were inoculated to tissue-cultured and potting seedlings offor 120 days, and then the changes in growth and physiological characters were studied.The results showed that the biomass and physiological indexes of tissue-cultured seedlings increase inoculated withandsp., the fresh weight, activities of three protective enzymes, and total chlorophyll content had significant differences compared with the control.Especially the fresh weight was more than control for 360%-380%.Two strains,andsp.had the best effect for the potting seedlings, which the fresh weight, leaf area, and activities of three protective enzymes had significant difference compared with the control, and the fresh weight increased 261%-330% than control.Therefore, appropriate strains could be inoculated toat different growth stages in actual production.sp., which showed a good promoting effect on, could be developed as a universal beneficial bacterial agent in seedling stage.

; Mycorrhizal fungi; Physiological index; Protective enzyme

10.11926/jtsb.4411

2021-03-12

2021-06-03

廣西自然科學(xué)基金項目(2020GXNSFAA259028); 廣西重點研發(fā)計劃項目(桂科AB18221003)資助

This work was supported by the Project for Natural Science in Guangxi (Grant No.2020GXNSFAA259028); and the Project for Key Research & Development in Guangxi (Grant No.AB18221003).

陳寶玲(1981～ )，高級工程師，碩士，主要從事蘭科植物的保育與繁育研究工作。E-mail: cbl_033@163.com

通信作者Corresponding author.E-mail:459306606@qq.com