李 陽(yáng)， 余曉暉， 郭 玫， 杜 弢*

[1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000]

西藏凹乳芹Vicatiathibeticade Boiss.是常用藏藥，也為藏藥基礎(chǔ)方五大根藥之一，主要分布于我國(guó)云南西北部、四川西部、西藏等地，以西南地區(qū)最為集中[1]，其干燥根在當(dāng)?shù)孛耖g被作為當(dāng)歸的替用品，也常作為營(yíng)養(yǎng)蔬菜用于燉肉、燉雞等, 并且鮮品還可生吃，風(fēng)味獨(dú)特[2]。近年來(lái)研究表明，西藏凹乳芹含有多種類(lèi)型成分，如黃酮、香豆素、甾體類(lèi)、酚酸等[3-5]，具有抗疲勞、抗缺氧、耐高溫等生物活性，在滋補(bǔ)性功能的食品開(kāi)發(fā)和藥用價(jià)值方面具有較大的開(kāi)發(fā)潛力及應(yīng)用前景[6-9]。

目前，西藏凹乳芹總黃酮的提取方法大多為回流提取，而本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取，并且采用Box-Behnken響應(yīng)面法篩選最優(yōu)工藝，以期為該藥材后續(xù)研究提供更深入的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 西藏凹乳芹引種自西藏，產(chǎn)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院杜弢教授鑒定為傘形科凹乳芹屬植物西藏凹乳芹Vicatiathibeticade Boiss.的根。蘆丁對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Y19N7S25244)。無(wú)水乙醇(分析純，批號(hào)20190215)、氫氧化鈉(分析純，批號(hào)20161102)、硝酸鋁(分析純，批號(hào)20160411)(天津大茂試劑有限公司)；亞硝酸鈉(分析純，天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng))；水為超純水。

1.2 儀器 電子天平(萬(wàn)分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；超聲波清洗儀(型號(hào)KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；粉碎機(jī)(型號(hào)LG-500A，瑞安市百信藥機(jī)械廠(chǎng))；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(型號(hào)UV-2401PC，上海元析儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品12.5 mg，置于25 mL量瓶中，70%乙醇超聲提取并微熱以使其溶解，放冷，定容，得到質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的貯備液，精密吸取2、4、6、8 mL至10 mL量瓶中，70%乙醇定容，即得(質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 參考文獻(xiàn)[10-12]報(bào)道，精密吸取0.2 mg/mL對(duì)照品溶液2 mL，加入5% NaNO2溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，搖勻，靜置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入5 mL 10%NaOH溶液，70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，在400～600 nm 波長(zhǎng)處掃描，發(fā)現(xiàn)在510 nm處存在最大吸收，故選擇其作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.3 供試品溶液制備 將藥材粉碎后過(guò)40目篩，封裝于塑料袋中，置于陰涼干燥處，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量粉末，用一定體積分?jǐn)?shù)乙醇在一定超聲功率下提取，抽濾，抽濾液置于100 mL量瓶中，一定體積分?jǐn)?shù)乙醇定容至100 mL，即得。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下5種質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各2 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為A=11.938X+0.038 1(R2=0.997 5)，在0.008～0.04 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.2 mg/mL對(duì)照品溶液2 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度6次，測(cè)得其RSD為0.64%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取藥材粉末適量，在超聲功率180 W、提取溫度30 ℃條件下用5倍量70%乙醇提取2次，每次15 min，提取液抽濾后定容至1010 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，每隔30 min測(cè)定1次，持續(xù)3 h，測(cè)得其RSD為1.44%，表明溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批藥材粉末4.0 g，平行5份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD為2.13%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取藥材粉末2.0 g，平行6份，分別精密加入1.02 mg/mL對(duì)照品溶液15 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其平均加樣回收率為97.70%，RSD為2.52%。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱(chēng)取4.0 g藥材，平行5份，固定液料比5∶1，提取時(shí)間15 min，提取次數(shù)2次，超聲功率180 W，提取溫度30 ℃，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%條件下進(jìn)行提取，提取液過(guò)濾后定容，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，平行3次，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，總黃酮含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈先升后降的趨勢(shì)，在70%、80%時(shí)無(wú)明顯差異，但在90%時(shí)反而有所降低，其原因可能是大量醇溶性雜質(zhì)浸出，從而影響黃酮在細(xì)胞中的滲透。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the content of total flavonoids

2.2.2 液料比 精密稱(chēng)取4.0 g藥材，平行5份，固定提取時(shí)間15 min，提取次數(shù)2次，超聲功率180 W，超聲溫度30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在液料比2.5∶1、5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1條件下進(jìn)行提取，提取液過(guò)濾后定容，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，平行3次，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，總黃酮含量隨著液料比增加呈先升后降的趨勢(shì)，在5∶1時(shí)最高。

圖2 液料比對(duì)總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the content of total flavonoids

2.2.3 超聲功率 精密稱(chēng)取4.0 g藥材，平行6份，固定液料比5∶1，提取時(shí)間15 min，提取次數(shù)2次，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度30 ℃，在超聲功率90、120、150、180、210、240 W條件下進(jìn)行提取，提取液過(guò)濾后定容，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，平行3次，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，總黃酮含量隨著超聲功率增加逐漸升高，在150～210 W時(shí)更明顯，在210 W時(shí)最高，但在210～240 W時(shí)反而逐漸降低，這可能是由于能量提高后被提取成分及其他雜質(zhì)發(fā)生了復(fù)雜的物理和化學(xué)變化所致。

圖3 超聲功率對(duì)總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the content of total flavonoids

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、液料比(X2)、超聲功率(X3)作為影響因素，總黃酮含量(Y)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，含有5個(gè)中心點(diǎn)、17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)[13]，因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖4。由圖4A可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)恒定時(shí)，總黃酮含量隨著液料比增加而升高，但趨勢(shì)相對(duì)平坦；液料比不變時(shí)，總黃酮含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加也呈升高趨勢(shì)，但達(dá)到一定程度后反而降低，在75%～82%時(shí)更明顯，并有最高值。由圖4B可知，當(dāng)液料比恒定時(shí)，總黃酮含量隨著超聲功率增加呈升高趨勢(shì)；當(dāng)功率不變時(shí)，總黃酮含量隨著液料比增加而升高，但達(dá)到一定程度后反而有所降低。由圖4C可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)恒定時(shí)，總黃酮含量隨著超聲功率增加先升后降，并且趨勢(shì)相對(duì)緩慢；超聲功率不變時(shí)，總黃酮含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加先升后降，曲面平坦，響應(yīng)值變化較小。

圖4 各因素響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for various factors

最終確定，最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)81.96%，液料比4.89∶1，超聲功率203.78 W。考慮到實(shí)際操作可行性，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)82%，液料比5∶1，超聲功率200 W，總黃酮含量為7.94 mg/g。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 取藥材3份，按照優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果，總黃酮含量分別為7.63、7.82、7.76 mg/g，平均7.74 mg/g，與預(yù)測(cè)值7.94 mg/g接近。

3 討論

西藏凹乳芹可增長(zhǎng)七精，加強(qiáng)體力，并具有開(kāi)胃、助消化、抗疲勞、增強(qiáng)免疫、抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶等藥理作用[14]，開(kāi)發(fā)前景廣闊。但對(duì)該藥材藥學(xué)方面的研究仍較薄弱, 導(dǎo)致其深度開(kāi)發(fā)利用受到限制。

正交試驗(yàn)等線(xiàn)性模型的不足之處在于只能分析1個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)，不能給出區(qū)域上因素最佳組合和響應(yīng)最優(yōu)值；Box-Behnken響應(yīng)面法可通過(guò)多元二次回歸方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，連續(xù)進(jìn)行各水平分析，故其預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較高[15-16]。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲功率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化西藏凹乳芹總黃酮超聲輔助提取工藝，驗(yàn)證試驗(yàn)表明該工藝穩(wěn)定可行，對(duì)今后合理開(kāi)發(fā)利用該藥材具有指導(dǎo)意義。