賈可可， 陳閃閃,2， 許美娟， 楊欣怡,2， 鄒建東， 居文政*

[1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029]

經(jīng)典方劑四逆散最早記載于《傷寒論》，由甘草、白芍、枳實(shí)、柴胡組成，具有調(diào)和肝脾、透邪解郁、疏肝理脾之功效，可用于治療抑郁癥[1]。為了最大程度保留經(jīng)方特色，關(guān)于四逆散的體內(nèi)外成分分析和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)大多在遵循傳統(tǒng)的基礎(chǔ)上選擇水煎煮提取，前期研究結(jié)果也表明該方水煎液具有抗抑郁作用[2-3]。目前，對(duì)四逆散的成分研究集中在定性分析[4-5]和少量成分的定量分析上[6-8]，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未完全制定，缺乏多指標(biāo)成分含量的同時(shí)測(cè)定。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定四逆散中沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、檸檬苦素、川陳皮素的含量，以期完善該方質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并為后續(xù)抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent HP1100型高效液相色譜系統(tǒng)，配置紫外檢測(cè)器(可變波長(zhǎng)型)、色譜儀專用工作站等；Millipore Q-A10型超純水儀；CPA225D型電子天平；Thermo micro 17R型高速冷凍離心機(jī)；KH5200E型超聲波清洗器。

1.2 試劑與藥物 柴胡、白芍(炒)、枳實(shí)(麩炒)、甘草(炙)均購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院，經(jīng)江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部副主任藥師張倩鑒定為正品。沒食子酸(批號(hào)MUST-17022801，純度99.04%)、芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào)MUST-18041601，純度99.14%)、芍藥苷(批號(hào)MUST-18032901，純度99.30%)、橙皮苷(批號(hào)MUST-16041806，純度99.70%)、槲皮素(批號(hào)MUST-19101104，純度99.35%)、甘草酸(批號(hào)MUST-16070805，純度98.36%)對(duì)照品均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；檸檬苦素(批號(hào)110800，純度99.91%)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；川陳皮素(批號(hào)BWB50625，純度98%)對(duì)照品購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。色譜純甲醇、乙腈購(gòu)于德國(guó)默克公司；分析純磷酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 準(zhǔn)確稱取各對(duì)照品適量，甲醇超聲溶解后定容，制成沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、檸檬苦素、川陳皮素質(zhì)量濃度分別為500、500、1 000、400、50、500、250、50 μg/mL的貯備液，分別精密吸取91.1、91.1、153.8、170.9、68.3、91.1、121.5、68.3 μL，溶解定容至1 mL，即得(各成分質(zhì)量濃度分別為45.55、45.55、153.80、68.36、3.42、45.55、30.38、3.42 μg/mL)。

2.1.2 供試品溶液 稱取相應(yīng)量柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草(比例1∶1∶1∶1)，加入8倍量蒸餾水浸泡0.5 h后煎煮0.5 h，8層紗布粗濾得水煎液，殘余藥渣再加入6倍量蒸餾水煎煮0.5 h，8層紗布粗濾得水煎液，合并水煎液，紗布過(guò)濾，續(xù)濾液濃縮蒸發(fā)至浸膏狀，即得四逆散浸膏(得率29%)，低溫保存?zhèn)溆?。稱取1 g，溶于25 mL 20%甲醇中，混合均勻，超聲提取30 min至完全溶解，12 000×g離心2次，每次5 min，取上清，制成40.0 mg/mL溶液(以浸膏計(jì))，即得(生藥量137.9 mg/mL)。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脫(0～6 min，2%～15%A；6～13 min，15%～17%A；13～22 min，17%～25%A；22～28 min，25%～33%A；28～38 min，33%～50%A；38～41 min，50%A；41～42 min，50%～2%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm(0～36 min，沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸)、210 nm(36～42 min，檸檬苦素、川陳皮素)。取供試品(稀釋5倍)、對(duì)照品(稀釋2.25倍)溶液適量，在上述色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖1，可知各成分與相鄰峰均能有效分離。

1.沒食子酸 2.芍藥內(nèi)酯苷 3.芍藥苷 4.橙皮苷 5.槲皮素 6.甘草酸 7.檸檬苦素 8.川陳皮素1.gallic acid 2.albiflorin 3.paeoniflorin 4.hesperidin5.quercetin 6.glycyrrhizic acid 7.limonin 8. nobiletin圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液適量，20%甲醇梯度稀釋成7個(gè)質(zhì)量濃度(稀釋因子1.5)，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，其峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、檸檬苦素、川陳皮素峰面積RSD分別為0.71%、0.27%、0.67%、0.56%、0.89%、0.47%、0.78%、0.60%，保留時(shí)間RSD分別為0.28%、0.57%、0.66%、0.33%、0.13%、0.08%、0.06%、0.06%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，置于棕色進(jìn)樣小瓶中，于0、2、4、6、8、12、24、48 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、檸檬苦素、川陳皮素峰面積RSD分別為2.12%、2.09%、0.94%、2.25%、2.35%、1.18%、1.34%、1.29%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材適量，制成浸膏后按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、檸檬苦素、川陳皮素含量RSD分別為1.95%、0.71%、0.88%、1.16%、1.49%、0.18%、0.28%、0.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的浸膏，精密加入對(duì)照品(加入量與浸膏中相應(yīng)成分含量的比值約為1∶1)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備3份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、檸檬苦素、川陳皮素平均加樣回收率分別為100.12%、94.78%、98.04%、99.32%、94.21%、96.62%、95.74%、95.96%，RSD分別為2.41%、0.56%、1.61%、0.76%、1.21%、1.37%、0.61%、2.14%。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 取同一批藥材適量，制成浸膏后按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。由此可知，芍藥苷、甘草酸含量符合2020年版《中國(guó)藥典》[9]規(guī)定(分別不低于1.2%、1.0%)。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/g生藥，n=6)

3 討論

結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)首先考察流動(dòng)相甲醇-水(含0.05%磷酸)、[甲醇-乙腈(1∶1)]-水(含0.05%磷酸)、乙腈-水(含0.05%磷酸)、乙腈-水(含0.1%磷酸)，發(fā)現(xiàn)以乙腈-水(含0.1%磷酸)洗脫時(shí)色譜效果最優(yōu)。再考察柱溫35、40 ℃，發(fā)現(xiàn)在35 ℃下各成分色譜峰峰形較好，與相鄰峰之間幾乎無(wú)干擾。然后考察檢測(cè)波長(zhǎng)210、240、280、320 nm，發(fā)現(xiàn)在240 nm處各成分色譜峰峰形、分離度、響應(yīng)值較好，基線平穩(wěn)，故確定為“2.2”項(xiàng)下色譜條件。

在2020年《中國(guó)藥典》中，枳實(shí)、甘草、柴胡質(zhì)控成分分別為辛弗林、甘草苷和甘草酸、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D[9]。文獻(xiàn)[12]報(bào)道，柴胡皂苷A、柴胡皂苷D在煎煮提取過(guò)程中易發(fā)生開環(huán)轉(zhuǎn)化，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者含量很低，難以定量。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還分別用辛弗林、甘草苷、柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品與供試品比較，發(fā)現(xiàn)供試品中含有辛弗林，但其極性較大，難以保留；含有甘草苷，但甘草苷、蘆丁難以分離；在檢測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)柚皮苷；新橙皮苷含量較低，難以定量；文獻(xiàn)[13]也證實(shí)，柚皮苷、新橙皮苷在283 nm波長(zhǎng)處吸收較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)為了兼顧其他成分，未同步檢測(cè)以上化合物，還有待于后續(xù)進(jìn)一步完善。

有學(xué)者采用UHPLC-QqQ-MS法測(cè)定四逆散中16種成分含量[14]，而本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的HPLC法測(cè)定8種成分含量，相比前期報(bào)道的4種[6-8]和課題組之前測(cè)定的6種[10]，在數(shù)量上有了一定突破。研究表明，沒食子酸[15]、芍藥內(nèi)酯苷[16]、芍藥苷[17]、橙皮苷[18]、槲皮素[19]、甘草酸[20]、檸檬苦素[21]、川陳皮素[22]均有抗抑郁活性，故本實(shí)驗(yàn)選擇上述成分作為含量測(cè)定指標(biāo)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定四逆散中沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、槲皮素、甘草酸、檸檬苦素、川陳皮素的含量，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為全面評(píng)價(jià)該方質(zhì)量提供依據(jù)，也為研究其抗抑郁藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。