劉廣寧, 門 煒

劉廣寧, 南開大學(xué)附屬醫(yī)院(天津市第四醫(yī)院)消化科 天津市 300000

門煒, 天津大學(xué)北洋門診部 天津市 300000

劉廣寧, 主治醫(yī)師, 研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合消化疾病的診療.

0 引言

胃潰瘍(gastric ulcer, GU)是常見的慢性消化系統(tǒng)疾病, 由于胃黏膜被消化液消化引起的黏膜肌層組織損傷現(xiàn)象. 過量飲酒會(huì)引起腹部燒灼樣疼痛, 嘔吐及嘔血等急性胃潰瘍臨床癥狀. 幾年來隨著生活水平的提高, 飲酒人數(shù)逐年增加, 導(dǎo)致胃潰瘍患者的新發(fā)病例也明顯上升. 目前研究結(jié)果表明, 胃潰瘍患者的胃黏膜的防御系統(tǒng)遭到破壞后會(huì)引發(fā)機(jī)體內(nèi)發(fā)生潰瘍相關(guān)的炎癥反應(yīng), 使得核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)量明顯升高, 同時(shí)血清中會(huì)釋放大量促炎性細(xì)胞因子. 胃潰瘍的發(fā)生主要與MAPK通路、ERK通路、EGFR/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及bFGF因子活化等有關(guān). NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分, 在機(jī)體發(fā)生病變或應(yīng)激刺激后在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮著重要的作用. NLRP3炎癥體復(fù)合物主要由NOD樣受體(NOD-like receptor, NLRs)家族成員NLRP3、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白半胱氨酸蛋白酶-1 (Caspase-1)組成, 當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí), CARD(caspase- activating and recruitment domain)感受器信號(hào)傳遞給ASC蛋白, 激活Caspase-1, 進(jìn)而活化的IL-1β, 最終使上皮細(xì)胞釋放大量炎癥因子. 有研究指出, NLRP3相關(guān)通路在腸道菌群平衡, 腸炎及腸道腫瘤等腸道疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用. 但目前關(guān)于NLRP3相關(guān)通路在胃潰瘍中的相關(guān)作用及其機(jī)制研究較少.

目前主要采用藥物對(duì)胃潰瘍患者進(jìn)行治療, 常用的藥物有奧美拉唑和蘭索拉唑等質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、幽門螺旋桿菌抗生素等. 但這些藥物對(duì)胃潰瘍的治療效果有限, 還存在明顯的副作用. 白果內(nèi)酯(bilobalide, BI)是提取自銀杏葉的萜內(nèi)酯類化合物, 白果內(nèi)酯對(duì)精神病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有顯著的作用, 同時(shí)還可降低腦出血及腦水腫發(fā)生的概率. 同時(shí)有研究指出, 白果內(nèi)酯通過抑制活性氧和含氮物質(zhì)的表達(dá)量使得結(jié)腸炎大鼠血清中的TNF-α明顯降低, 最終使炎癥反應(yīng)受到抑制, 對(duì)結(jié)腸黏膜具有一定的保護(hù)作用. 胃潰瘍胃黏膜損傷主要是通過炎癥因子及氧化應(yīng)激途徑進(jìn)行調(diào)控的, 白果內(nèi)酯對(duì)胃潰瘍胃黏膜損傷有一定的保護(hù)作用, 但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

綜上所述, 我們推測(cè)在腸道疾病中發(fā)揮重要作用的NLRP3相關(guān)通路在胃潰瘍中發(fā)揮著重要的作用, 且白果內(nèi)酯對(duì)炎癥因子的調(diào)控可能與胃潰瘍的保護(hù)作用具有一定的相關(guān)性. 基于這種推測(cè), 本文以60只SD大鼠為研究對(duì)象, 構(gòu)建了乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型, 研究白果內(nèi)脂通過NLRP3相關(guān)通路對(duì)乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍的作用及其具體的分子機(jī)制, 以為胃潰瘍的治療提供可參考的理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組: 選擇60只6-7周齡的健康SD大鼠, 體重208-254 g, 雌雄各半; 每籠5只飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房, 室溫25 ℃±2 ℃, 相對(duì)濕度55%左右, 12晝夜交替, 自由飲水和飲食. 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 wk后進(jìn)行試驗(yàn). 隨機(jī)分為六組: 空白組(A組), 模型組(B組), 對(duì)照組(C組), 低劑量組(D組)、中劑量組(E組)和高劑量組(F組), 每組10只, A組大鼠不作任何處理, B組建立乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型, C組大鼠造模后采用奧美拉唑進(jìn)行治療, D組、E組和F組大鼠均在造模后采用不同劑量的白果內(nèi)酯進(jìn)行治療. 本試驗(yàn)所有動(dòng)物程序均經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn), 實(shí)驗(yàn)方法均按照批準(zhǔn)指南進(jìn)行.

1.2 方法 乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型建立及試驗(yàn)動(dòng)物處理方法: 實(shí)驗(yàn)前對(duì)所有大鼠禁食24 h, 禁水4 h. 以0.2 mL/kg的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃, 灌胃成功5 min內(nèi)可見大鼠出現(xiàn)全身癱軟、精神緊張、呼吸心跳加速等癥狀. 灌胃4 h內(nèi)禁食禁水, 4 h后可見大鼠出現(xiàn)身體癱軟癥狀, 則表明急性胃潰瘍模型構(gòu)建成功.

術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)1 d后開始給藥, C組以灌胃的方式給予濃度為20 mg/mL 的奧美拉唑(omeprazole, OME)進(jìn)行治療. BI注射液臨床成人用量為 30-50 mg/(人d), 按50 mg/(人d)計(jì)算, 分別對(duì)大鼠給與臨床成人用量的2倍(1 mg/mL), 5倍(2.5 mg/mL)和10倍(5 mg/mL)進(jìn)行試驗(yàn). D組給予濃度為1 mg/mL的BI進(jìn)行治療, E組給予濃度為2.5 mg/mL的BI進(jìn)行治療; F組給予濃度為5 mg/mL的BI進(jìn)行治療. 所有動(dòng)物均為每日給藥1次, 連續(xù)給藥14 d.

潰瘍指數(shù)計(jì)算及生化指標(biāo)檢測(cè): 造模成功3 h后, 用3%的戊巴比妥以1 g/kg劑量經(jīng)腹腔注射麻醉處死大鼠, 腹正中切口進(jìn)入腹腔分離胃, 用注射器將胃液吸出, 采用0.5-5.0的精密pH試紙測(cè)定胃酸pH值. 以放射免疫分析法采用胃泌素檢測(cè)試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)對(duì)不同組別大鼠胃泌素進(jìn)行檢測(cè). 采用胃蛋白酶檢測(cè)試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)檢測(cè)胃蛋白酶活性.

造模成功后4 h, 采用眼眶取血的方法收集標(biāo)本, 于4 ℃, 于4攝氏度, 3500 rpm條件下離心20 min, 收集上清, 分別采用不同的試劑盒根據(jù)具體操作步驟檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(monochrome display adapter, MDA)和還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量. SOD、MDA和GSH檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所. 采用無菌釆血管取不同組別大鼠腹主動(dòng)脈血約5 mL, 于室溫條件下放置20 min使血液自然凝固, 于3000 rpm/min條件下20 min取血清, 依據(jù)Elisa檢測(cè)試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)于450 nm波長(zhǎng)下分別檢測(cè)血清中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表達(dá)量.

分離胃后用生理鹽水沖洗胃腔內(nèi)及粘膜上的血跡, 將胃平鋪于濾紙上, 觀察胃黏膜潰瘍、糜爛及出血點(diǎn)發(fā)生的部位. 參考Wang等(2020)方法按照潰瘍或糜爛面積大小計(jì)算潰瘍指數(shù)(ulcer index, UI), 3個(gè)點(diǎn)狀潰瘍(粘膜缺損小于1 mm)計(jì)1分; 游標(biāo)卡尺測(cè)量條狀出血潰瘍面寬為1 mm者計(jì)1分, 2 mm者計(jì)2分, 3 mm者計(jì)3分. 點(diǎn)狀潰瘍和條狀出血潰瘍面之和即為UI.

大鼠胃組織病理學(xué)觀察: 收集部分胃組織采用HE染色法其進(jìn)行形態(tài)觀察. 將胃組織采用福爾馬林進(jìn)行固定, 石蠟包埋, 連續(xù)切片4 um, 置于二甲苯30 min脫蠟-不同梯度酒精水化50 min-蘇木精沖洗20 min-水洗后伊紅染色2 min-梯度酒精脫水30 min-二甲苯透明20 min后, 采用中性樹膠封片, 在光鏡下觀察衛(wèi)組織病理改變. 采用經(jīng)典的病理炎癥細(xì)胞評(píng)分對(duì)胃組織白細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)價(jià), 白細(xì)胞浸潤(rùn)程度分為5個(gè)等級(jí), 0-1為無細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞, 2為一環(huán)1個(gè)細(xì)胞, 3為一環(huán)2-4個(gè)細(xì)胞, 4為一圈細(xì)胞超過4個(gè)細(xì)胞層.

NLRP3相關(guān)通路因子實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè): 取約20 g的胃組織, 放入勻漿器中, 盡量剪碎, 采用TRIzol法提取胃組織中的總RNA, 對(duì)提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 采用HifairⅢ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄. 依據(jù)NCBI中各基因的mRNA序列合成不同因子的引物序列. NLRP3基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物: NL-F: 5’-CTGCATGCCGTATCTGGTTG-3’; NL-R: 5’-GGTACCCCATAGACTGGCAC-3’. IL-1β基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物. IL-F: 5’-AGGCTGACAGACCCCAAAAG-3’; ILR: 5’-CTCCACGGGCAAGACATAGG-3’. 以β-actin作為內(nèi)參, β-actin基因的引物Fa: 5’-ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3’; Ra: 5’-CTGACCCATACCCACCATCAC-3’. 每個(gè)樣品作三個(gè)復(fù)孔, 退火溫度為60 ℃, 退火時(shí)間15 s, 30個(gè)循環(huán). 采用2法計(jì)算各因子的相對(duì)表達(dá)量.

免疫印跡(western blot, WB)法檢測(cè)NLRP3相關(guān)通路因子表達(dá)量: 取收集的胃組織放入勻漿器中, 盡量剪碎, 加入1 mL提前配置好的裂解液(RIPA蛋白裂解液:蛋白酶抑制劑PMSF = 1:100)進(jìn)行研磨, 使組織充分裂解以提取總蛋白. 提取的總蛋白采用比辛尼酸法測(cè)定蛋白含量. 采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白, 采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上, 然后用5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉. 分別加入以1:1000比例稀釋好的NLRP3、白介素-18(IL-1β)、Caspase-1、調(diào)亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)和β-actin的抗體, 于4 ℃孵育過夜. 用TBST徹底洗滌3次, 10 min/次, 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下孵育2 h; 用TBST徹底洗滌3次, 10 min/次, 加入顯色液, 在顯影儀上自動(dòng)曝光, 拍照進(jìn)行灰度掃描. 根據(jù)灰度值分析蛋白表達(dá)量.

免疫熒光法檢測(cè)NLRP3蛋白表達(dá)量: 將不同組別大鼠胃組織, 依次用預(yù)冷的PBS和預(yù)冷的4%多聚甲醛進(jìn)行灌注, 固定胃組織脫水并切片(約5-7 μm). 室溫下干燥30 min, 用PBS洗滌3次后用5%牛血清(含0.3%Triton X-100)進(jìn)行1 h封閉. 加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠抗IgG熒光抗體, 低溫孵育過夜. 用PBS洗滌3次, 加入熒光標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h. Iba-1染色10 min, 封片. 采用激光掃描共焦顯微鏡拍照.

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析, 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用單因素方差分析法(ANOVA), 差齊時(shí)兩組間比較采用LSD法, 方差不齊則采用Dunnett T3法檢驗(yàn); 不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn). 計(jì)數(shù)資料采用百分率表示,＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 不同組別大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)和胃液指標(biāo)比較 對(duì)不同組別大鼠UI進(jìn)行比較分析(圖1A), B組UI與A組相比具有極顯著性差異(＜0.001), C組, D組, E組和F組的UI與A組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05), 與B組相比具有顯著性差異(＜0.01). B組, C組, D組, E組和F組大鼠的胃液pH值與A組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05).

進(jìn)一步對(duì)不同組別大鼠的胃泌素、總酸度以及胃蛋白酶活性進(jìn)行檢測(cè)與分析(圖1B), A組胃泌素高于B組異(＜0.05). C組, D組, E組和F組大鼠的胃泌素明顯低于B組, 組間相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05). B組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性均明顯高于A組, 二者相比均具有顯著性差異(＜0.01). C組和E組和F組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性與B組相比均具有顯著性差異(＜0.01). D組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性與B組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05).

圖1 不同組別大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)和胃液指標(biāo)比較. A: 不同組別大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)及胃液pH值比較; B: 不同組別大鼠胃泌素、總酸度以及胃蛋白酶活性比較. (aP＜0.05; bP＜0.01; dP＜0.05; eP＜0.01). UI: 潰瘍指數(shù).

2.2 不同組別大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析 對(duì)不同組大鼠血清中SOD、MDA和GSH含量進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果如圖2所示, A組的SOD值明顯高于B組, 二者相比具有顯著性差異(＜0.01), 經(jīng)給藥治療后, C組, D組, E組和F組大鼠血清中SOD值較B組明顯升高(＜0.01). A組的GSH值明顯高于B組, 二者相比具有顯著性差異(＜0.01), 經(jīng)給藥治療后的C組, D組, E組和F組大鼠血清中GSH值較B組明顯升高, 組間相比均具有顯著性差異(＜0.01). B組大鼠MDA值明顯高于A組, 二者相比具有顯著性差異(＜0.01), C組, D組, E組和F組大鼠血清中MDA與B組相比明顯降低(＜0.01).

圖2 不同組別大鼠血清中超氧化物歧化酶、丙二醛和還原型谷胱甘肽含量比較. bP＜0.01; eP＜0.01. SOD: 超氧化物歧化酶; MDA: 丙二醛; GSH: 還原型谷胱甘肽.

2.3 血清中NLRP3相關(guān)通路因子表達(dá)量分析 對(duì)不同組大鼠血清中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β含量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析(圖3), B組大鼠血清中NLRP3的含量明顯高于A組, 二者相比具有極顯著性差異(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠血清中NLRP3含量均低于B組相比均明顯降低(＜0.01). D組和E組大鼠血清中NLRP3含量與C組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05). B組大鼠血清中Caspase-1的含量明顯高于A組(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠血清中Caspase-1含量均低于B組相比均明顯降低(＜0.01). D組, E組大鼠血清中Caspase-1含量與F組和C組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05), C組和F組大鼠血清中Caspase-1含量相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. B組大鼠血清中IL-18及IL-1β含量均高于A組(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠血清中IL-18及IL-1β含量均低于B組(＜0.01). D組, E組大鼠血清中IL-18及IL-1β含量與F組和C組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05), C組和F組大鼠血清中IL-18及IL-1β含量相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

圖3 不同組別大鼠血清中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3、Caspase-1、IL-18及IL-1β含量比較. cP＜0.001; eP＜0.01; fP＜0.05.

2.4 大鼠胃黏膜組織形態(tài)觀察 對(duì)不同組大鼠的胃黏膜組織形態(tài)進(jìn)行觀察(圖4), A組大鼠胃壁完整、未見明顯損傷, B組大鼠胃部可見明顯的充血腫脹, C組, D組, E組和F組大鼠損傷程度明顯較B組減輕.

圖4 不同組別大鼠胃黏膜組織形態(tài). A: A組胃黏膜組織形態(tài); B: B組胃黏膜組織形態(tài); C: C組胃黏膜組織形態(tài); D: D組胃黏膜組織形態(tài); E: E組胃黏膜組織形態(tài); F: F組胃黏膜組織形態(tài).

對(duì)不同組大鼠胃組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析(圖5), A組大鼠胃組織HE染色后可見胃黏膜結(jié)構(gòu)整齊, 未見炎細(xì)胞浸潤(rùn); B組大鼠胃組織HE染色可見胃黏膜上皮層缺失, 部分胃上皮細(xì)胞脫落, 出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象, C組, D組, E組和F組大鼠經(jīng)治療后胃上皮細(xì)胞脫落數(shù)量及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均減少. 對(duì)不同組別大鼠炎癥細(xì)胞評(píng)分結(jié)果進(jìn)行分析, B組大鼠炎癥細(xì)胞評(píng)分值明顯高于A組, 二者相比具有極顯著性差異(＜0.001), C組, D組, E組和F組大鼠炎癥細(xì)胞評(píng)分值明顯低于B組, 組間相比均具有顯著性差異(＜0.01).

2.5 NLRP3相關(guān)通路因子RT-PCR檢測(cè)結(jié)果分析 對(duì)提取的RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)與分析(圖6A), 提取的RNA均有明顯的28S和18S RNA條帶, 條帶清晰可見未見明顯的降解, 表明提取的RNA完整, 進(jìn)一步對(duì)不同組別大鼠組織中NLRP3和IL-1β的表達(dá)量進(jìn)行比較分析(圖5B), B組大鼠胃組織中NLRP3的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于A組(＜0.01). C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中NLRP3的mRNA相對(duì)表達(dá)量與B組相比均明顯降低(＜0.01). B組大鼠胃組織中IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于A組(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量與B組相比均明顯降低(＜0.01), D組, E組和F組大鼠胃組織中IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量與C組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05).

圖5 不同組別大鼠胃黏膜組織形態(tài). A: A組胃黏膜組織HE染色; B: B組胃黏膜組織HE染色; C: C組胃黏膜組織HE染色; D: D組胃黏膜組織HE染色; E: E組胃黏膜組織HE染色; F: F組胃黏膜組織HE染色; G: 不同組別大鼠胃黏膜組織炎癥細(xì)胞評(píng)分結(jié)果比較. (cP＜0.001; eP＜0.01).

圖6 不同組別大鼠胃組織中NLRP3和IL-1β的表達(dá)量比較. A: 胃組織RNA電泳圖; B: 不同組別大鼠胃組織中NLRP3和IL-1β的表達(dá)量比較. (cP＜0.001; eP＜0.01; fP＜0.05). NLRP3: NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3.

2.6 NLRP3相關(guān)通路因子表達(dá)量分析 采用WB對(duì)不同組別大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達(dá)量進(jìn)行分析(圖7), A組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達(dá)量均明顯低于B組(＜0.001). 經(jīng)治療后C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達(dá)量均明顯低于B組(＜0.01). D組, E組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達(dá)量與F組和C組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05), F組和C組胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達(dá)量與F組和C組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＞0.05).

圖7 不同組別大鼠胃組織中NLRP3相關(guān)通路蛋白表達(dá)量比較. A:不同蛋白免疫印跡電泳圖; B: 不同組別大鼠胃組織中NLRP3相關(guān)通路蛋白表達(dá)量比較. (cP＜0.001; eP＜0.01; fP＜0.05). NLRP3: NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3; ASC: 調(diào)亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白. NLRP3: NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3.

2.7 免疫熒光檢測(cè)胃組織中NLRP3表達(dá)量 采用免疫熒光染色法對(duì)不同組別大鼠胃組織中NLRP3表達(dá)量進(jìn)行分析(圖8), A組大鼠胃組織中幾乎沒有NLRP3表達(dá), B組大鼠胃組織可見大量NLRP3表達(dá), 經(jīng)給藥后的D組和E組大鼠胃組織中NLRP3表達(dá)量明顯降低, C組和F組大鼠胃組織中NLRP3表達(dá)量與A組相似, 表達(dá)量較低.

圖8 不同組別大鼠胃組織中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3表達(dá)免疫熒光圖.

2.8 NLRP3 相關(guān)通路因子間相關(guān)性分析 不同組別大鼠的NLRP3 相關(guān)通路因子間相關(guān)性進(jìn)行分析(圖9), Caspase-1表達(dá)量對(duì)著NLRP3表達(dá)量的增加而增加, 即Caspase-1表達(dá)量與NLRP3表達(dá)量呈明顯正相關(guān)(R = 0.845,＜0.01); IL-1β表達(dá)量隨著 Caspase-1 表達(dá)量的增加而增加, 即IL-1β表達(dá)量與Caspase-1表達(dá)量呈明顯正相關(guān)(R = 0.903,＜0.01).

圖9 NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3相關(guān)通路因子間相關(guān)性分析. A: Caspase-1與NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3表達(dá)量相關(guān)性分析; B: IL-1β和Caspase-1表達(dá)量相關(guān)性分析. NLRP3: NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3.

3 討論

胃潰瘍是由氧自由基等多種因素引發(fā)的一種常見胃腸道疾病. 大量乙醇攝入是引發(fā)胃潰瘍的原因之一, 乙醇對(duì)胃黏膜的損傷是一個(gè)復(fù)雜的過程, 大量攝入乙醇會(huì)使胃黏膜上皮細(xì)胞和粘液層受損, 胃黏膜血流動(dòng)力學(xué)的改變, 同時(shí)還可誘導(dǎo)胃黏膜合成和分泌多種炎癥及氧化應(yīng)激等細(xì)胞因子, 進(jìn)一步加劇胃黏膜的損傷. 本文采用白果內(nèi)脂對(duì)乙醇有道的大鼠胃潰瘍進(jìn)行治療, 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), B組UI與A組相比具有極顯著性差異(＜0.001), C組, D組, E組和F組的UI與B組相比具有顯著性差異＜0.01). B組, C組, D組, E組和F組大鼠的胃液pH值與A組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05). A組胃泌素明顯低于B組(＜0.05). B組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性均明顯高于A組(＜0.01). C組和E組和F組大鼠的總酸度和胃蛋白酶總活性與B組相比均具有顯著性差異(＜0.01). 這些結(jié)果表明, 經(jīng)乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠胃黏膜指數(shù)、總酸度以及胃蛋白酶活性明顯升高, 胃液pH值和胃泌素明顯降低. 表明灌入的乙醇直接破壞了大鼠胃表面的保護(hù)屏障, 導(dǎo)致胃黏膜損傷. 乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍粘膜損傷病理特點(diǎn)與人體大量攝入酒精導(dǎo)致的胃黏膜損傷相似, 且這種造模方法簡(jiǎn)便, 速度快, 重復(fù)性好. 同時(shí)可以看出, C組, D組, E組和F組的UI和胃液pH值與B組相比均有明顯的改善, 表明采用不同的藥物治療后可改善乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍引發(fā)的胃黏膜指數(shù)、總酸度以及胃蛋白酶活性升高, 胃液pH值和胃泌素降低現(xiàn)象.

NLRP3炎癥體復(fù)合體由NLRP3、ASC和Caspase-1組成, NLRP3主要作為感受器發(fā)揮作用, 將信號(hào)傳遞給效應(yīng)蛋白Caspase-1, 活化的IL-1β和IL-18, 進(jìn)而調(diào)控慢性炎癥. ASC接頭蛋白促進(jìn)NLRP3炎癥體的激活. 而且IL-1β和IL-18的表達(dá)與免疫調(diào)節(jié)具有相關(guān)性, IL-1β和IL-18等炎癥因子的過量表達(dá), 會(huì)引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂. 文中進(jìn)一步對(duì)BI對(duì)問潰瘍的治療效果及其對(duì)應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行探討, 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), B組大鼠血清中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β含量均高于A組(＜0.01). D組, E組大鼠血清中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β含量與F組和C組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＜0.05). B組大鼠胃組織中NLRP3和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于A組(＜0.01). C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中NLRP和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量與B組相比均明顯降低(＜0.01). 這些結(jié)果表明乙醇的攝入使大鼠血清及胃組織中的NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β表達(dá)均明顯升高, 經(jīng)白果內(nèi)脂治療后, 大鼠血清及胃組織中的NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β表達(dá)量下調(diào). 說明白果內(nèi)脂通過調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)分子NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表達(dá)量對(duì)對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍發(fā)揮了保護(hù)作用. Abdellatif等(2019)研究指出, 羅格列酮通過炎癥因子的調(diào)控參與了乙醇引發(fā)的胃潰瘍的調(diào)控過程, 本文研究結(jié)果與其相似. Caspase-1蛋白是NLRP3相關(guān)通路中促炎性細(xì)胞因子的調(diào)控因子. 同時(shí)有研究指出炎癥因子的表達(dá)量與潰瘍的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性. 文中結(jié)果發(fā)現(xiàn), 乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠胃黏膜指數(shù)升高, 炎癥因子NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表達(dá)量升高, 而經(jīng)BI和OME治療的大鼠胃黏膜指數(shù)下降, 且其NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β表達(dá)量較B組明顯下降, 這與目前炎癥因子的表達(dá)量與潰瘍的相關(guān)性結(jié)果一致. A組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達(dá)量均明顯低于B組(＜0.001). C組, D組, E組和F組大鼠胃組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和ASC表達(dá)量均明顯低于B組(＜0.01). 可以看出, 在檢測(cè)的所有指標(biāo)中F組明顯優(yōu)于陽性對(duì)照C組, 具有潛在的應(yīng)用價(jià)值. NLRP3相關(guān)通路因子參與了白果內(nèi)脂對(duì)胃潰瘍的保護(hù), 通過抗炎作用達(dá)到改善胃潰瘍的作用.

4 結(jié)論

本文通過構(gòu)建乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型, 并采用不同劑量的白果內(nèi)脂進(jìn)行治療, 探討白果內(nèi)脂改善胃潰瘍的分子機(jī)制. 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 給藥白果內(nèi)脂后, 乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍大鼠血清及胃組織中的NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β及ASC因子及蛋白的表達(dá)量明顯降低, 有效改善了胃潰瘍. 但是本文還存在一些不足之處, 本文僅對(duì)白果內(nèi)脂對(duì)乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍保護(hù)的NLRP3相關(guān)通路因子進(jìn)行了研究, 未對(duì)其它通路進(jìn)行分析, 尚不明確白果內(nèi)脂是否通過其它通路對(duì)乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍產(chǎn)生了相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制, 在今后的工作中將進(jìn)一步對(duì)胃潰瘍保護(hù)相關(guān)通路進(jìn)行研究, 以完善白果內(nèi)脂的作用機(jī)制. 綜上所述, NLRP3相關(guān)通路因子參與了白果內(nèi)脂對(duì)胃潰瘍的保護(hù), NLRP3相關(guān)通路通過抗炎作用達(dá)到改善胃潰瘍的作用.

目前研究發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)脂可能對(duì)胃潰瘍具有一定的保護(hù)作用, 但其作用機(jī)制尚不明確, NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)相關(guān)通路在腸炎及腸道腫瘤等腸道疾病中具有重要的作用, 但其在胃潰瘍中的相關(guān)作用研究較少.

基于目前研究我們推測(cè)在腸道疾病中發(fā)揮重要作用的NLRP3相關(guān)通路可能在胃潰瘍發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用, 且白果內(nèi)酯對(duì)炎癥因子的調(diào)控可能與胃潰瘍的保護(hù)作用具有一定的相關(guān)性.

研究白果內(nèi)脂通過NLRP3相關(guān)通路對(duì)乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍的作用及其具體的分子機(jī)制, 以為胃潰瘍的治療提供可參考的理論依據(jù).

本文以60只SD大鼠為研究對(duì)象, 構(gòu)建了乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型, 以奧美拉唑作為陽性對(duì)照, 分析不同劑量白果內(nèi)酯對(duì)急性胃潰瘍的胃液pH值、胃泌素、胃蛋白酶、潰瘍指數(shù)(ulcer index, UI)、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、超氧化物歧化酶、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和還原型谷胱甘肽等因子含量的影響.

醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型大鼠UI、胃泌素、總酸度和胃蛋白酶總活性、MDA值、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白的mRNA水平和蛋白表達(dá)量均明顯升高. 經(jīng)奧美拉唑和不同劑量白果內(nèi)酯治療后的乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠胃泌素、總酸度、胃蛋白酶總活性、MDA值、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β、Caspase-1和ASC蛋白的mRNA水平和蛋白表達(dá)量均明顯較未治療模型組降低.

白果內(nèi)脂可通過NLRP3通路抗炎機(jī)制達(dá)到胃潰瘍的保護(hù)作用.

本文為胃潰瘍的治療提供了新思路, 在今后的工作中將進(jìn)一步分析白果內(nèi)脂對(duì)乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍保護(hù)作用除了NLRP3通路是否還有其他通路參與.