衡先培，王志塔，李 亮，黃蘇萍，楊柳清

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122）

糖尿病不僅是糖脂代謝病，也是氨基酸代謝病，無論糖尿病的發(fā)病、進展及預后，都與氨基酸代謝密切相關［1-2］。氨基酸代謝不但與糖脂代謝密切相關，也與基因和蛋白質代謝密不可分。由于氨基酸是蛋白質的基礎，蛋白質是構建人體組織器官、維護器官功能的基本要素，對人體生理、病理具有關鍵的影響，氨基酸代謝異常可導致患者生活質量與健康顯著下降?；瘜W藥物強化治療雖能有效改善血糖、血脂、血壓等客觀指標，但不能改善氨基酸代謝，甚至存在惡化氨基酸代謝的風險［3］。臨床研究表明，痰瘀同治丹瓜方可改善糖尿病患者的糖脂代謝，降低高危糖尿病患者冠心病發(fā)病和全因不良風險，同時也提高患者生活質量［4］。由于氨基酸代謝與蛋白質代謝之間存在著密切關系，提示痰瘀同治法的療效可能與改善氨基酸代謝有關。因此，本研究基于蛋白質及磷酸化代謝組學，探討丹瓜方對氨基酸代謝的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 7周齡SPF級雄性SD大鼠，體質量（311±11）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證編號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，自由攝食。動物實驗遵守倫理原則，符合國家及相關部門有關實驗動物保護與使用準則，善待動物。

1.2 實驗藥物 丹瓜方（國家發(fā)明專利號：2014 10599300.6）由丹參、栝蔞、赤芍、法半夏、僵蠶、薤白組成。

1.3 實驗試劑 鏈脲佐菌素（STZ）、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、三乙基碳酸氫銨（美國Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（Calbiochem公司）；胰酶（Promega公司）；乙腈（Fisher Chemical公司）；超純水、三氟乙酸（Sigma-Aldrich公司）；甲酸（Fluka公司）；EDTA、Ethidium Bromide、MOPS（華 美 生 物 工 程公司）。

1.4 實驗儀器 小型垂直電泳槽、電泳儀、IMARK酶標儀（美國Bio-Rad公司）；300 Extend C18色譜柱（美國Agilent公司）；分析柱和Acclaim?PepMap?100 C18液相色譜柱（164568）、SpeedVac濃縮器、Heraeus Multifuge X1R臺式高速冷凍離心機（美國ThermoFisher Scientific公司）；JY92-ⅡN高強度超聲波處理器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；High pH reverse-phase HPLC（L3000）（中國RIGOL Technologies）；TS-200脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；Velocity 18R臺式冷凍離心機（英國Dynamica公司）；timsTOF Pro質譜儀（德國Bruker公司）；CR2032微量血糖測試儀（德國BAYER公司）；光學顯微鏡（德國Leica公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后進行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），選取空腹血糖（FBG）＜6.1 mmol/L、2小時血糖（2 h PBG）＜7.8 mmol/L的大鼠。以空腹體質量分層，按PBG由高到低，以1∶2隨機分為對照組和造模組。對照組飼以普通飼料，造模組飼以高脂高糖飼料（配方：精煉豬油10%，膽固醇2%，豬膽鹽0.3%，蔗糖20%，常規(guī)飼料67.7%）。4周后，造模組再做OGTT，以空腹體質量分層，按PBG由高到低，以1∶1隨機分為模型組和丹瓜方組。丹瓜方組按20.5 g/（kg·d）以丹瓜方灌胃液灌胃，模型組用清潔自來水灌胃，每日1次。3組均繼續(xù)喂食各自原有飼料。根據(jù)既往實驗，用藥物干預10周后，禁食但不禁水12 h取標本。根據(jù)體質量與血糖，每組隨機取6只大鼠采血和取肝組織，用于本研究的指標測定。

2.2 口服葡萄糖負荷試驗 大鼠禁食不禁水8～10 h后，鼠尾尖取血，用微量血糖儀測FBG后，按葡萄糖2 g/kg以50%的葡萄糖注射液灌胃并記錄灌胃時間，2 h后再次測2 h PBG。

2.3 生化檢測 采用常規(guī)生化法檢測血漿膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）。

2.4 肝組織染色 分別采用HE染色、油紅O脂肪染色和Masson染色觀察各組大鼠肝組織。HE染色：組織洗滌，石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木素浸染，1%鹽酸酒精分藍，自來水浸泡返藍，伊紅浸染，浸洗，樹脂封片。Masson染色：石蠟切片，脫蠟，切片鉻化處理，自來水浸洗至黃色消失后，再用蒸餾水滴注洗滌，加入Regaud蘇木精染液，充分水洗，加入Masson麗春紅酸性復紅液，洗滌，1%磷鉬酸水溶液分化，苯胺藍染色，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，脫水透明，中性樹膠封片。油紅O染色：冰凍切片，厚度10μm，70%乙醇固定，蒸餾水洗滌，油紅稀釋液染，避光，密封，加入60%乙醇，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，蒸餾水洗滌，甘油明膠封片。

2.5 LC-MS/MS分析 取每只大鼠的肝標本50 mg，將同一組的2個標本放入研磨器中用液氮研磨。每組的3個樣品含有6個大鼠的肝組織樣本，用于蛋白質提取和磷酸化修飾的非標記定量組學分析。胰蛋白酶消化后，根據(jù)商家提供的說明書進行機上檢測。技術路線：蛋白質提取→胰蛋白酶消化→親和富集→LC-MS/MS分析→數(shù)據(jù)庫搜索→生物信息學分析。亞細胞定位用Wolfpsort庫（v.0.2，http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html），富集分析用Perl module庫（v.1.31，https：//metacpan.org/pod/Text：：NSP：：Measures：：2D：：Fisher），GO注釋用InterProScan庫（v.5.14-53.0，http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料屬正態(tài)分布者用（±s）表示，多樣本兩兩比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 3組大鼠血糖、血脂指標比較 模型組2 h PBG、TG和TC均明顯高于對照組（P＜0.01）；丹瓜方組2 h PBG、TG、TC均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 3組大鼠血糖、血脂指標比較（±s） mmol/L

表1 3組大鼠血糖、血脂指標比較（±s） mmol/L

注：與對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

TC 2.35±0.32 5.99±0.681）5.06±0.413）組別對照組模型組丹瓜方組n6 6 6 FBG 6.05±0.30 6.26±0.43 6.06±0.56 2 h PBG 6.58±0.43 8.00±0.801）7.38±0.192）TG 1.07±0.22 1.80±0.201）1.49±0.192）

3.2 3組大鼠肝組織病理形態(tài) 正常組肝臟呈暗褐色，肝細胞結構正常，胞核分布均勻，僅在匯管區(qū)有少量藍色纖維組織染色和細粒狀脂肪染色。模型組肝臟呈嫩白色，肝細胞空泡狀且分布不均，胞核邊移，藍色纖維組織呈網(wǎng)狀，紅色大脂滴滿布。丹瓜方組肝臟呈褐紅色，肝細胞結構清楚，胞核分布均勻，匯管區(qū)呈蟹足樣纖維染色，中小脂滴較多。見圖1。

圖1 3組大鼠肝組織病理形態(tài)圖

3.3 丹瓜方對差異表達蛋白亞細胞結構定位的影響 如圖2A所示，模型組與對照組的差異表達顯著性蛋白涉及細胞質、線粒體、細胞核、質膜及內質網(wǎng)等。如圖2B所示，丹瓜方組與模型組的差異表達蛋白出現(xiàn)在細胞核、細胞質，尤其是線粒體和質膜。這些膜結構及其功能，都與氨基酸與蛋白質代謝密切相關。此外，丹瓜方組還能影響細胞骨架蛋白（cytoskeleton）的表達。由于蛋白質由氨基酸構成，表明丹瓜方可能影響糖脂代謝異常大鼠的氨基酸代謝，并可能由此改善蛋白質代謝。

圖2 LC-MS/MS分析亞細胞定位餅圖

3.4 丹瓜方對生物學進程的影響 如圖3A所示，丹瓜方不但可顯著影響肝組織甘油脂生物合成過程（glycerolipid biosynthetic process）、磷脂生物合成過程（phospholipid biosynthetic process）、甘油磷脂代謝過程（glycerophospholipid metabolic process）、磷脂代謝過程（phospholipid metabolic process）、甘油脂代謝過程（glycerolipid metabolic process）等糖脂的代謝進程，而且也能調節(jié)包括細胞生長（regulation of cell growth）、細胞形態(tài)發(fā)生（regulation of cell morphogenesis）、心臟發(fā)育（heart development）、超分子纖維組織（regulation of supramolecular fiber organization）、骨骼發(fā)育（bone development）等。尤其是正調控細胞發(fā)育（positive regulation of cell development）、促進蛋白質寡聚化（protein oligomerization）和正調控轉移酶活性（positive regulation of transferase activity），都表明丹瓜方能加強蛋白質的功能，促進細胞發(fā)展，這些都離不開充分合理的氨基酸代謝，進一步提示丹瓜方可能通過改善氨基酸代謝，以改善蛋白質代謝及細胞功能。在圖3B的磷酸化組學中，丹瓜方顯著調控組織再生（tissue regeneration）、肽轉運（peptide transport）、酰胺轉運（amide transport），都與氨基酸代謝密切關聯(lián)，表明此觀點與事實相符。

圖3 生物學進程功能富集圖

3.5 丹瓜方對氨基酸代謝調控分析 從表2的COG功能條目中可以看出，涉及能量產生與轉化、碳水化合物的運輸與代謝、核苷酸轉運與代謝、酶轉運與代謝、脂肪轉運與代謝、無機離子轉運與代謝、次生代謝物的生物合成、轉運和分解代謝以及氨基酸的轉運與代謝，模型組都有多個功能蛋白發(fā)生顯著性差異表達和差異磷酸化。經過丹瓜方干預后，其中大部分條目都有不同數(shù)量功能蛋白對模型組發(fā)生差異化表達。其中涉及氨基酸轉運與代謝的差異表達蛋白有4個（D3ZPY2、Q68FT5、P10860、D4A904），差異磷酸化蛋白有2個（P10860、D4A904），見表3。

表2 COG分類功能條目在丹瓜方干預后的差異表達蛋白個數(shù)

表3 氨基酸轉運與代謝差顯調節(jié)蛋白

4 討論

氨基酸是蛋白質的基本構成單位，蛋白質是生命活動的基本要素。人體組織器官的基本構架都以蛋白質為主體，人體的功能活動本質上是蛋白質功能的宏觀體現(xiàn)。糖尿病患者氨基酸代謝異常，必然伴隨著不同程度的組織蛋白質合成障礙，同時也導致功能蛋白質的異常。這些功能蛋白質包括各種酶、激素、抗體與受體、神經遞質等，調控人體的各種功能及代謝，是影響患者生活質量的關鍵因素。

大量研究表明，糖尿病伴隨氨基酸代謝異常，并且是影響糖尿病心血管事件及全因終點的獨立危險因素［2］。研究表明，2型糖尿病患者尿氨基酸排泄水平顯著升高，其中尿苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的排泄顯著高于健康對照［5］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者循環(huán)血液中的γ-氨基丁酸（GABA）（可由谷氨酸轉化而來）、精氨酸、谷氨酰胺和磷酸乙醇胺濃度顯著降低，而纈氨酸水平高于對照組。IGT組GABA水平降低，酪氨酸濃度升高。血漿必需氨基酸水平與空腹及激發(fā)后血糖、空腹C肽、HOMA胰島素抵抗、空腹胰高血糖素水平呈正相關［6］。2型糖尿病患者標準餐后150 min外周血中絲氨酸、鳥氨酸水平顯著低于健康對照組，而苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸水平高于正常對照組［7］。

在2019年，有研究者對475例2型糖尿病患者進行了為期6年的隊列研究，發(fā)現(xiàn)甘氨酸水平位于最高分位的人群，5年新發(fā)為糖尿病的風險比最低分位的人群降低了76%。支鏈氨基酸、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）水平較高的研究對象5年新發(fā)糖尿病的風險明顯較高，而甘氨酸水平較高的研究對象5年新發(fā)糖尿病的風險明顯較低［1］。另一項臨床研究結果也顯示，血漿多種氨基酸水平的變化與糖尿病發(fā)病風險相關［8］。因此，調節(jié)氨基酸代謝，對于防治糖尿病及提高糖尿病的治療效果，是關鍵的一環(huán)。

本研究從系統(tǒng)生物學角度，利用組學技術研究了中藥復方制劑丹瓜方對糖脂代謝紊亂模型氨基酸代謝的影響?；诒?分析可以看出，D3ZPY2蛋白的基因是Hsd3b7，主要涉及代謝途徑包括膽汁酸和膽鹽的合成與代謝，在肝臟生物化學與生物物理兩大屏障方面與氨基酸代謝密切相關，同時還與氨基酸交換和相關酶活性有關［9］。國外在肥胖兒童中發(fā)現(xiàn)參與脂質與氨基酸代謝的基因CES1、NPRR3和BHMT2發(fā)生顯著性差異表達［10］。Q68FT5蛋白的基因是Bhmt2，即甜菜堿-高半胱氨酸S-甲基轉移酶，主要影響含硫氨酸（包括結構氨基酸蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸和非結構氨基酸高半胱氨酸），促進這些氨基酸的合成或轉化［11］。D4A904蛋白的基因是Nags，催化谷氨酸與乙酰輔酶A進行乙?；磻蒒-乙酰谷氨酸的酶。N-乙酰谷氨酸（N-acetyl glutamic acid，NAG）是精氨酸內源合成途徑的第一個合成酶，即氨基甲酰磷酸合成酶I（carbamyl phosphate synthase I，CPSI）的變構激活劑［1］，還可催化氨甲酰磷酸合成酶以調節(jié)氨基酸代謝的最后環(huán)節(jié)，即尿素循環(huán)。

P10860蛋白的基因是Glud1或GDH1，即谷氨酸脫氫酶1，是一種線粒體酶，催化氨還原性固定到α-酮戊二酸上，形成谷氨酸（α-酮戊二酸＋NH3＋NADH+＋H+→谷氨酸＋NAD+）。此外，GDH1還調節(jié)纈氨酸、氨基丁酸、亮氨酸代謝。在慢性疲勞綜合征中，發(fā)現(xiàn)谷氨酸/谷氨酰胺、支鏈氨基酸和一些必需氨基酸都顯著下調［12］。表2示，丹瓜方不但顯著恢復性上調GDH1的表達，還顯著上調其磷酸化水平，上調其功能，可以促進更多的糖脂代謝中間產物轉化為谷氨酸。在組學數(shù)據(jù)中還發(fā)現(xiàn)，與谷氨酸代謝或轉化相關的多種酶蛋白都有上調，包括谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamatecysteine ligase catalytic subunit）、蛋白質谷氨酸O-甲基轉移酶（protein-glutamate O-methyltransferase）、谷氨酸-半胱氨酸調節(jié)亞基（glutamate-cysteine regulatory subunit）、線粒體谷氨酸載體1樣蛋白（A0A0G2K5L2）、富含谷氨酸的WD重復序列蛋白1（基因為Grwd1）、D-谷氨酸環(huán)化酶（D-glutamate cyclase）、谷氨酸受體2（glutamate receptor 2）、葉酰聚谷氨酸合酶（folylpolyglutamate synthase）；谷氨酸代謝磷酸化上調蛋白包括谷氨酸-半胱氨酸調節(jié)亞基（glutamate-cysteine regulatory subunit）、精氨酸-谷氨酸富集蛋白（arginine and glutamate-rich protein 1）。這表明，丹瓜方可顯著上調谷氨酸的代謝。由于谷氨酸是各種氨基酸代謝或轉化的樞紐和中間環(huán)節(jié)，通過谷氨酸代謝的上調，進而可影響其他多種氨基酸的代謝。

研究結果顯示，丹瓜方干預糖脂代謝異常，可直接調節(jié)蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、精氨酸、N-乙酰谷氨酸、氨甲酰磷酸、谷氨酸的合成，尤其是通過多途徑上調谷氨酸的合成，并通過調節(jié)膽汁酸代謝和尿素循環(huán)，最終影響各種氨基酸的代謝，其機制與調節(jié)D3ZPY2、Q68FT5、P10860、D4A904蛋白表達及P10860、D4A904蛋白的磷酸化有關。綜上，痰瘀同治丹瓜方顯著改善糖脂代謝紊亂模型的氨基酸代謝，這一作用有助于理解丹瓜方顯著改善糖尿病患者生活質量和預后的機制。