■王勁松 關(guān) 峰 王學(xué)文 許 麗 劉佐民* 張 雷 董 玲

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧 沈陽 110036）

抗生素作為飼料添加劑的使用影響了我國畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因而調(diào)整飼料添加劑的研發(fā)方向，尋找無毒副作用、無殘留、安全的微生態(tài)制劑，成為近年來研究的熱點(diǎn)[1-2]。蠟樣芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，大多存在于土壤中，有的可以產(chǎn)生毒素，致人腹瀉[1-2]。無毒的蠟樣芽孢桿菌可以產(chǎn)生活性較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，因而在動物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)在動物日糧中添加蠟樣芽孢桿菌可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)免疫力，提高斷奶仔豬的日增重，降低腹瀉率和死亡率[3-4]。Castrejón等[5]研究發(fā)現(xiàn)在銀鯰魚日糧中添加含量為4×1011CFU/g 的蠟樣芽孢桿菌和4×1011CFU/g枯草芽孢桿菌合劑后，可以提高銀鯰魚的生產(chǎn)性能，促進(jìn)腸道絨毛的生長，加強(qiáng)黏液分泌細(xì)胞的活動。Hafner 等[6]在受T-2毒素污染的兔日糧中添加蠟樣芽孢桿菌（200 mg/kg）和甘露寡糖（2 g/kg）后發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌和甘露寡糖單獨(dú)或聯(lián)合使用，都可以緩解T-2 毒素對于兔淋巴細(xì)胞的損傷作用。而乳酸菌作為常見的動物微生態(tài)添加劑，在動物飼料中添加后，可以通過產(chǎn)生有機(jī)酸降低腸道內(nèi)pH，以及產(chǎn)生細(xì)菌素和降解氨基酸產(chǎn)生吡啶多胺衍生物等作用來抑制病原菌的增殖，增強(qiáng)動物腸道酶的活力和動物的免疫力，進(jìn)而提高動物的日增重[7-10]。Jin 等[11]研究發(fā)現(xiàn)飼喂乳酸桿菌制劑可以極顯著地增加肉雞的日增重。而Mountzouris等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在雞飼料中添加含有乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌的復(fù)合微生態(tài)制劑和鹽霉素鈉，6 周后乳酸菌組和抗生素組的生長性能差異不顯著，但是飼料轉(zhuǎn)化率明顯高于對照組（基礎(chǔ)日糧組），且益生菌組的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性提高。在動物生產(chǎn)中，動物微生態(tài)制劑必須達(dá)到一定的活菌數(shù)才能取得很好的應(yīng)用效果[13]。因而本試驗(yàn)通過對蠟樣芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的生長條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為大幅度提高發(fā)酵水平，提高有效活菌數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），購于黑龍江省微生物研究所。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)基

①液體培養(yǎng)基：酵母粉蛋白胨培養(yǎng)基（蛋白胨10 g、酵母粉5 g、葡萄糖5 g、NaCl 5 g、磷酸氫二鉀0.55 g、硫酸錳0.25 g、純化水1 000 mL，pH 7.0）。

②固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加1%的瓊脂。

1.1.2.2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基

①液體培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、檸檬酸銨2 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀2 g、乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.2 g、純化水1 000 mL，pH 6.5）。

②固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加2%的瓊脂。

③番茄汁的制備：將番茄洗凈，稱取500 g 在鍋中打碎，加水500 mL，煮沸30 min，定容至500 mL，過濾，115 ℃（0.1 MPa）高壓滅菌20 min后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.1.1 種子液的制備

①菌種活化：將保存的菌種轉(zhuǎn)接到酵母膏蛋白胨瓊脂液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，備用。

②一級菌種：將4 mL活化的菌種再次轉(zhuǎn)接在酵母膏蛋白胨瓊脂液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。

③二級菌種：取4 mL 一級種子液，接入盛有200 mL酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，置搖床中，轉(zhuǎn)速為200 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2 液體發(fā)酵原料配比的優(yōu)化

以酵母粉蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，按照L18（37）正交試驗(yàn)表，分配各因素及水平，具體設(shè)計(jì)見表1。接種2%菌液（體積比）于培養(yǎng)基，在30 ℃、200 r/min，搖瓶培養(yǎng)24 h。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平表

1.2.1.3 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

按照優(yōu)化得到的發(fā)酵原料配比，取4 mL 種子液加入裝有200 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于30 ℃，200 r/min，搖瓶培養(yǎng)，每2 h測定一次OD值，繪制生長曲線，找出蠟樣芽孢桿菌的最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過由正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的發(fā)酵原料最優(yōu)配比，結(jié)合生長曲線確定的最佳發(fā)酵時(shí)間，將蠟樣芽孢桿菌30 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，以酵母粉蛋白胨固體培養(yǎng)基為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)后的菌液稀釋到合適倍數(shù)，涂布到平板上，測定其活菌數(shù)從而驗(yàn)證蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵的最優(yōu)條件。

1.2.2 嗜酸乳桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.2.1 種子液的制備

①菌種活化：將保存的菌種轉(zhuǎn)接到MRS 瓊脂斜面培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，備用。

②一級菌種：將4 mL 活化的菌種再次轉(zhuǎn)接在MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。

③二級菌種：取4 mL 一級種子液，接入盛有200 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，置搖床中，轉(zhuǎn)速為200 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2 液體發(fā)酵原料配比的優(yōu)化

以MRS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)化嗜酸乳桿菌生長所需的N 源（添加量為1%）、C 源（添加量為2%）及營養(yǎng)促進(jìn)因子（番茄汁）的添加量。按照L9（34）正交試驗(yàn)表，分配各因素及水平，具體設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素及水平表

將發(fā)酵原料按L9（34）正交試驗(yàn)表配制好后，取200 mL 液體培養(yǎng)基于250 mL 錐形瓶中，用封口膜封口，115 ℃（0.1 MPa）高壓滅菌20 min。取4 mL 種子液加入裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)菌液在600 nm比色，以未接菌的MRS培養(yǎng)基為空白調(diào)零，測定吸光度。

1.2.2.3 嗜酸乳桿菌最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

按照1.2.2.2優(yōu)化得到的發(fā)酵原料配比，取4 mL種子液加入裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，37 ℃靜置培養(yǎng)。按上述方法每2 h測定一次吸光度，繪制生長曲線，找出適宜的培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過由正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的發(fā)酵原料最優(yōu)配比，結(jié)合生長曲線確定的最佳發(fā)酵時(shí)間，將嗜酸乳桿菌培養(yǎng)一定時(shí)間后，以MRS固體培養(yǎng)基為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)后的菌液稀釋到合適倍數(shù)，涂布到平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)，測定其活菌數(shù)從而驗(yàn)證嗜酸乳桿菌發(fā)酵的最優(yōu)條件。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0軟件的一般線性模型（GLM）進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s的極大復(fù)極差法（RRS）進(jìn)行各組間比較，數(shù)據(jù)取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過對各因素的極差分析，可以看出各因素對試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度按順序從大到小排列為F>A>E>G>B>C>D，即：酵母粉>葡萄糖>蛋白胨>硫酸銨>蔗糖>淀粉>牛肉粉。各因素選取水平為：A3B3C2D2E3F3G3，即葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、淀粉0.5%、牛肉粉0.5%、蛋白胨1.5%、酵母粉1%、硫酸銨0.5%（見表3）。

表3 L18（37)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

方差分析結(jié)果：F、A、B、E、G的P值分別為0.013、0.028、0.039、0.041、0.049，對試驗(yàn)影響顯著，C、D 的P值分別為0.085、0.137，都大于0.05對試驗(yàn)影響不顯著，顯著性順序?yàn)镕>A>B>E>G>C>D（見表4）。

表4 L18（37)正交試驗(yàn)方差分析

2.1.2 最佳發(fā)酵時(shí)間

每2 h 取樣測定蠟樣芽孢桿菌的OD 值，結(jié)果如圖1。由圖1可以看出接種蠟樣芽孢桿菌后，0～6 h菌數(shù)大量增長，這時(shí)的蠟樣芽孢桿菌處于對數(shù)增長期，18～20 h 時(shí)蠟樣芽孢桿菌處于生長的穩(wěn)定期，從22 h開始，蠟樣芽孢桿菌開始進(jìn)入生長的衰亡期，因此，發(fā)酵的時(shí)間可定為18～20 h。

圖1 蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵曲線

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、淀粉0.5%、牛肉粉0.5%、蛋白胨1.5%、酵母粉1%、硫酸銨0.5%，發(fā)酵8～20 h 進(jìn)行液體發(fā)酵，所得蠟樣芽孢桿菌液體發(fā)酵的活菌數(shù)為1.3×1012CFU/mL，優(yōu)化前的活菌數(shù)為8×1011CFU/mL，優(yōu)化后活菌數(shù)提高了62.5%。

2.2 嗜酸乳桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

通過各因素的極差分析，可以看出各因素對試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度按順序從大到小排列為：C>A>B，即：營養(yǎng)促進(jìn)因子>N源>C源。營養(yǎng)促進(jìn)因子（番茄汁）的R值高于其他因子，是影響嗜酸乳桿菌生長的主要因素，而因子葡萄糖的R值最低，說明葡萄糖對嗜酸乳桿菌菌液濃度的影響較小。發(fā)酵條件優(yōu)化最優(yōu)組合為A3B2C3，即大豆蛋白胨1%、葡萄糖2%、番茄汁20%（見表5）。

表5 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

方差分析結(jié)果：A、B、C 的P值分別為0.031 1、0.060 5、0.010 4。A，C 的P值都小于0.05，對試驗(yàn)影響顯著，顯著性順序?yàn)镃>A>B（見表6）。方差分析的結(jié)果與極差的結(jié)果一致。

表6 L9（34）正交試驗(yàn)方差分析

2.2.2 最佳發(fā)酵時(shí)間

每2 h 取樣測定產(chǎn)嗜酸乳桿菌的OD 值，結(jié)果如圖2。由圖2 可以看出接種后0～4 h 菌數(shù)的變化不明顯，4～12 h 菌數(shù)大量增長，此時(shí)嗜酸乳桿菌處于對數(shù)增長期，22 h時(shí)達(dá)到最大，之后有下降趨勢。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間確定為22 h。

圖2 嗜酸乳桿菌發(fā)酵曲線

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，按照大豆蛋白胨1%、葡萄糖2%、番茄汁20%，發(fā)酵22 h 進(jìn)行液體發(fā)酵，所得嗜酸乳桿菌液體發(fā)酵的活菌數(shù)為1.9×1011CFU/mL，比優(yōu)化前（1.3×1011CFU/mL）提高了46.15%。

3 討論

益生菌制劑作為當(dāng)前畜牧業(yè)養(yǎng)殖中替代抗生素的新型飼料添加劑，已廣泛應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中。較為常見的益生菌主要包括乳酸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母等菌種。王珍珊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，添加4.0%嗜酸乳桿菌微膠囊制劑可以提高肉羊生長性能、屠宰性能及肉品質(zhì)。王茜[15]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌能提高肉雞生長性能，促進(jìn)腸道益生菌定植，降低飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。獲得高產(chǎn)、高效的益生菌最關(guān)鍵的問題在于益生菌發(fā)酵條件的優(yōu)化。本試驗(yàn)通過調(diào)整蠟樣芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌液體培養(yǎng)基中各組分的比例，確定了最適合菌株的生長條件，使用優(yōu)化的條件進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的發(fā)酵，活菌數(shù)分別提高了62.5%和46.15%，從而有效降低生產(chǎn)成本，為蠟樣芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在動物生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

4 結(jié)論

①蠟樣芽孢桿菌最優(yōu)生長條件為：葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、淀粉0.5%、牛肉粉0.5%、蛋白胨1.5%、酵母粉1%、硫酸銨0.5%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），最大活菌數(shù)可達(dá)到1.3×1012CFU/mL。

②嗜酸乳桿菌最優(yōu)生長條件為：MRS 液體培養(yǎng)基中添加1%大豆蛋白胨、2%葡萄糖、20%營養(yǎng)促進(jìn)因子（番茄汁）、發(fā)酵22 h，此時(shí)最大活菌數(shù)可達(dá)到1.9×1011CFU/mL。