■袁澤琿 楊紅玲 張姣錦 孫云章

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門市飼料檢測與安全評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021）

魚粉由于蛋白含量高、氨基酸組成平衡及抗?fàn)I養(yǎng)因子較少等眾多優(yōu)點(diǎn)一直是水產(chǎn)飼料重要的蛋白來源，在肉食性魚類飼料中約占30%～50%[1]。根據(jù)FAO統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，由于全球魚粉的供求關(guān)系不平衡，致使魚粉價格居高不下[2]。利用大豆蛋白替代魚粉是近十幾年來水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。但是，大豆蛋白中抗原蛋白占比為65%～80%，難以通過熱處理或飼料加工去除，顯著影響魚類腸道的微生態(tài)結(jié)構(gòu)、破壞腸道黏膜結(jié)構(gòu)完整性、影響機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、降低飼料蛋白質(zhì)利用率等[4]。

近年來，生物發(fā)酵技術(shù)被廣泛用于飼料原料的改造，豆粕經(jīng)微生物發(fā)酵后，其抗?fàn)I養(yǎng)因子含量顯著下降，而且，微生物菌活動過程中能夠?qū)⒁恍╇y以吸收的有機(jī)物分解轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)飼料，增加了飼料的營養(yǎng)價值。另外，生物發(fā)酵飼料中所含的益生菌能夠調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物免疫功能，頡頏病原菌，提高動物的生產(chǎn)性能[5]。當(dāng)前，用于制作水產(chǎn)用發(fā)酵豆粕的菌株多分離于環(huán)境和恒溫動物中，很多菌株雖然具有降解抗?fàn)I養(yǎng)因子等作用，但是難以發(fā)揮調(diào)控宿主免疫機(jī)能的作用，難以在動物消化道內(nèi)定植或者是存活時間短、穩(wěn)定性差、對腸道菌群調(diào)控能力弱[4]。因此，一些學(xué)者認(rèn)為理想的發(fā)酵菌株應(yīng)來自水產(chǎn)動物自身消化道[6-7]。目前對于水產(chǎn)動物而言，土著菌株資源的開發(fā)仍然嚴(yán)重不足[8]。另外，大量研究顯示，與單菌發(fā)酵相比，復(fù)合菌發(fā)酵更有利于發(fā)揮微生物之間的互利共生作用，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[9]。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期篩選出3 株優(yōu)良功能菌株（短小芽孢桿菌SE5、釀酒酵母菌Sa 以及乳酸乳球菌17）協(xié)同發(fā)酵豆粕，以抗原蛋白降解效果為評價指標(biāo)，優(yōu)化菌株比例、接種順序、料液比、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等參數(shù)，再應(yīng)用正交設(shè)計試驗(yàn)對上述參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，明確復(fù)合菌最佳發(fā)酵條件，建立一種生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)功能性發(fā)酵豆粕的工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

短小芽孢桿菌SE5（Bacillus pumilusSE5）分離自斜帶石斑魚腸道，菌落為乳白色、半透明、隆起、邊緣整齊、菌落較小(直徑0.5 mm)、革蘭氏陽性菌、好氧。菌株以25%甘油為保護(hù)劑保存于-80 ℃冰箱。

乳酸乳球菌17（Lactococcus lactis17）分離自小丑魚腸道，菌落為白色、濕潤、極小、革蘭氏陽性菌、兼性厭氧。菌株以25%甘油為保護(hù)劑保存于-80 ℃冰箱。

釀酒酵母菌Sa（Saccharomyces cereusSa）分離自酒曲。菌落為乳白色、濕潤、隆起、菌落整體黏稠、表面較光滑、容易挑起、質(zhì)地較均勻、直徑在0.5～0.6 cm，兼性厭氧。菌株以25%甘油為保護(hù)劑保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS 肉湯培養(yǎng)基：用作乳酸菌培養(yǎng)，購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

YPD 液體培養(yǎng)基：用作酵母菌培養(yǎng)，購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

2216E 液體培養(yǎng)基：用作短小芽孢桿菌培養(yǎng)，購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵種子液的制備

短小芽孢桿菌SE5發(fā)酵種子液制備：取保藏的菌液200 μL 接至50 mL 2216E 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min，活化24 h?；罨笠?%的接種量進(jìn)行傳代2 次，根據(jù)菌株的生長曲線，取第二次傳代的最佳生長期菌液[10]作為發(fā)酵種子液，待接種豆粕。

乳酸乳球菌17 發(fā)酵種子液的制備：取保藏的乳酸菌菌液200 μL 接至50 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min，活化24 h。活化后以5%的接種量進(jìn)行傳代兩次，根據(jù)菌株的生長曲線，取第二次傳代的最佳生長期菌液作為發(fā)酵種子液。

釀酒酵母菌Sa 發(fā)酵種子液的制備：酵母菌菌液200 μL 接至50 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min，活化24 h?；罨笠?%的接種量進(jìn)行傳代兩次，根據(jù)菌株的生長曲線，取第二次傳代的最佳生長期菌液作為發(fā)酵種子液。

1.2.2 復(fù)合菌株配伍

復(fù)合菌株的比例是影響豆粕發(fā)酵效果的重要因素。試驗(yàn)設(shè)定的控制因素是料液比1∶1、總接種量10%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間48 h，變量是菌株比例，考察菌株比例對發(fā)酵豆粕抗原蛋白降解程度的影響。菌株比例的試驗(yàn)設(shè)計見表1。

表1 菌株比例試驗(yàn)設(shè)計

1.2.3 復(fù)合菌株接種順序

考慮到試驗(yàn)中復(fù)合菌各菌株的生長特性，芽孢桿菌是好氧型菌，酵母菌是兼性厭氧型菌，乳酸菌是厭氧型菌。為了使各菌株有更好的生長繁殖條件，試驗(yàn)在得到最佳菌株比例的基礎(chǔ)上，設(shè)定的控制因素是料液比1∶1，總接種量10%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間48 h，變量是菌株接入順序，考察復(fù)合菌株接種順序?qū)Πl(fā)酵豆粕抗原蛋白降解程度的影響。菌株接種順序的試驗(yàn)設(shè)計見表2。

表2 菌株接種順序試驗(yàn)設(shè)計

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計

為提高豆粕的利用效率，在得到復(fù)合菌最佳配伍比例、最佳接種順序以及單因素優(yōu)化的水平基礎(chǔ)上，研究復(fù)合菌發(fā)酵豆粕的工藝最大程度化降解大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，采用Minitab軟件設(shè)計的L9（34）正交表，通過正交試驗(yàn)來尋找降解大豆抗原蛋白的最佳工藝條件。因素水平設(shè)計見表3，正交試驗(yàn)設(shè)計見表4。

表3 因素水平表

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計

1.2.5 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的測定

大豆球蛋白（Glycinin）（酶聯(lián)免疫法）和β-伴大豆球蛋白含量（β-Conglycinin）（酶聯(lián)免疫法）的測定采用北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司提供的試劑盒進(jìn)行，具體操作參考彭翔等[11]。

1.2.6 統(tǒng)計方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013作初步處理，用SPSS 22.0軟件分析處理各組試驗(yàn)的差異作數(shù)據(jù)描述性分析。正交試驗(yàn)設(shè)計表用Minitab設(shè)計，方差結(jié)果分析用SPSS 22.0作一般線性模型多變量方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配伍比例對大豆抗原蛋白含量的影響（見圖1）

圖1 不同配伍比例條件下發(fā)酵豆粕中大豆抗原蛋白含量

由圖1 可知，短小芽孢桿菌SE5∶釀酒酵母菌Sa∶乳酸乳球菌17以2∶2∶1的比例接種發(fā)酵后，發(fā)酵豆粕中殘留大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量相對少，其次是1∶2∶1和1∶1∶2的菌株比例。

2.2 不同接種順序?qū)Υ蠖箍乖鞍缀康挠绊懀ㄒ妶D2）

由圖2可知，按照先接入短小芽孢桿菌SE5，12 h后接入釀酒酵母菌Sa，24 h后接入乳酸乳球菌17的接種順序，抗原蛋白的降解效果最佳，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量分別是59.22 mg/g和24.83 mg/g。

圖2 不同接種順序條件下發(fā)酵豆粕中大豆抗原蛋白含量

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)極差分析

正交試驗(yàn)的極差結(jié)果如表5所示，從每個因素對應(yīng)的極差值R的大小可以判斷各個因素對試驗(yàn)指標(biāo)影響程度，得到因素的主次影響順序。極差值R越大，該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響程度越大，該因素越重要。比較β-伴大豆球蛋白含量指標(biāo)的極差值R的結(jié)果，可知B>D>C>A，因此因素B是主要因素，A是不重要因素。每個因素對應(yīng)的k1、k2和k3表示該因素不同水平的平均值，優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白含量理應(yīng)是少量的，因此試驗(yàn)結(jié)果中的k值最小，意味著該因素相應(yīng)的水平是優(yōu)水平。比較各因素的對應(yīng)的k值，可知kA1C>A>D，B是主要因素，D是不重要因素。這與β-伴大豆球蛋白含量指標(biāo)下的最優(yōu)工藝條件略有差異，考慮到A是較不重要因素，kA1和kA3值相差不大，且在生產(chǎn)中，發(fā)酵時間越長，生產(chǎn)成本越高，因此選用kA1作為A因素的最優(yōu)水平。結(jié)合大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量結(jié)果，綜合分析得到復(fù)合菌發(fā)酵降解抗原蛋白的最優(yōu)工藝條件是發(fā)酵溫度30 ℃，總接種量10%，料液比1∶1，發(fā)酵時間為48 h。但是極差值僅僅反映了各因素影響試驗(yàn)指標(biāo)的主次關(guān)系，不能反映各因素影響試驗(yàn)指標(biāo)的顯著程度，且無法準(zhǔn)確地說明極差值差異產(chǎn)生的原因。因此，需要采用方差分析作為補(bǔ)充。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 正交試驗(yàn)方差分析

正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析采用SPSS 22.0分析中的一般線性模型單變量分析。大豆球蛋白含量方差分析和β-伴大豆球蛋白含量方差分析結(jié)果如表6 和表7所示。R-sq能用回歸平方和解釋比例，一般認(rèn)為R-sq 超過0.8 的模型擬合度比較高。同時對比表6、表7注中R-調(diào)整和R-sq的值，二者的值越接近，表示模型越優(yōu)。本試驗(yàn)中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量指標(biāo)下的R2數(shù)據(jù)均大于0.8，表明模型擬合度比較高。P值反映各因素對試驗(yàn)結(jié)果的顯著性影響，從大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的方差結(jié)果分析中，得到各因素均對試驗(yàn)結(jié)果有著顯著性的影響。方差分析中的F值是效應(yīng)項(xiàng)/誤差項(xiàng)的比值，F(xiàn)值越大，說明處理之間差異越明顯。由表6和表7可知，在大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的方差分析中，B因素（料液比）中的F值最大，表明B因素對發(fā)酵豆粕抗原蛋白降解的影響程度最大，A因素（發(fā)酵時間）影響程度最小。

表6 大豆球蛋白含量方差分析

表7 β-伴大豆球蛋白含量方差分析

綜合正交試驗(yàn)極差分析和方差分析結(jié)果得到，A1B2C2D2發(fā)酵條件對大豆抗原蛋白降解程度高，且結(jié)合生產(chǎn)中經(jīng)濟(jì)效益考慮，即發(fā)酵48 h，料液比1∶1，接種量10%，發(fā)酵溫度30 ℃為復(fù)合菌最佳發(fā)酵條件。

3 討論

發(fā)酵豆粕因具有抗?fàn)I養(yǎng)因子少、小肽豐富及易于動物消化吸收等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料。研究表明，不同菌株對發(fā)酵豆粕產(chǎn)品品質(zhì)影響很大[12]。劉劍飛[13]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用枯草芽孢桿菌NCU646 制作的發(fā)酵豆粕小肽占豆粕質(zhì)量為15%，枯草芽孢桿菌NCU655發(fā)酵豆粕中小肽占比為6%，而未發(fā)酵豆粕小肽占比僅為2%。王騰浩等[14]研究發(fā)現(xiàn)，利用地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌制作的發(fā)酵豆粕酸溶蛋白含量分別為12.98%和13.49%，而利用假絲酵母和糞腸球菌制作的發(fā)酵豆粕酸溶蛋白含量僅分別為3.57%和3.89%。此外，工藝參數(shù)對發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的質(zhì)量有很大的影響，如菌株比例、接種順序、料液比、發(fā)酵時間、接種量和發(fā)酵溫度等[15]。因此，本研究擬利用前期篩選的3株優(yōu)秀功能微生物——短小芽孢桿菌SE5（分離自斜帶石斑魚腸道）、乳酸乳球菌17（分離自小丑魚腸道）和釀酒酵母菌Sa（分離自酒曲），優(yōu)化菌株配伍和發(fā)酵工藝，開發(fā)一種水產(chǎn)功能性發(fā)酵豆粕。

3.1 菌株比例對發(fā)酵效果的影響

復(fù)合菌發(fā)酵系統(tǒng)通常會優(yōu)于單菌發(fā)酵系統(tǒng)，因?yàn)榫曛g多存在互惠共生關(guān)系[16]。本試驗(yàn)中當(dāng)復(fù)合菌株短小芽孢桿菌、釀酒酵母和乳酸乳球菌的比例為2∶2∶1 時，發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白含量最少，為86.30 mg/g，降解率達(dá)41.04%。Yuan 等[17]研究中，枯草芽孢桿菌、異常漢遜酵母和干酪乳桿菌的最佳比例為2∶1∶2，發(fā)酵后的大豆多肽的含量由2.16%提高到14.36%，同時胰蛋白酶抑制因子含量由35.34 mg/g降解到9.75 mg/g。程友飛[18]報道枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和酵母菌混菌固態(tài)發(fā)酵豆粕過敏原蛋白被部分降解，致敏性隨之降低。劉向敏等[19]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母菌和枯草芽孢桿菌比例為7∶3時，兩菌達(dá)到了良好的共生關(guān)系，中性蛋白酶產(chǎn)率和淀粉酶產(chǎn)率得到提高。發(fā)酵過程實(shí)質(zhì)上是由簡單或復(fù)雜的微生物群落驅(qū)動的，顯然，這些微生物不僅可以與底物相互作用，而且彼此間也能互相作用。微生物與微生物之間作用的機(jī)制是復(fù)雜的，復(fù)合菌接種發(fā)酵通常會產(chǎn)生優(yōu)于單菌發(fā)酵效果[20]，但也可能由于不同菌株間存在制約作用，發(fā)酵效果與單菌發(fā)酵效果無異甚至不如單菌發(fā)酵效果。

3.2 菌株接種順序?qū)Πl(fā)酵效果的影響

芽孢桿菌屬于好氧型菌株，但能源物質(zhì)耗損高；酵母菌屬于兼性厭氧型菌株，能適應(yīng)廣泛的氧濃度區(qū)域；乳酸菌屬于厭氧型菌株，但發(fā)酵周期長。因此，應(yīng)當(dāng)充分考慮微生物自身特性，分步接入不同菌株進(jìn)行發(fā)酵。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)酵48 h 時間里，隔12 h分步接種短小芽孢桿菌SE5、釀酒酵母菌Sa和乳酸乳球菌17 發(fā)酵效果比同時接入3 株益生菌的發(fā)酵效果好，大豆抗原蛋白降解程度高，發(fā)酵后豆粕的大豆球蛋白含量和β-伴大豆球蛋白含量分別為59.22 mg/g，24.83 mg/g。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似，石慧等[21]用好氧型枯草芽孢桿菌作為前發(fā)酵，兼性厭氧型酵母菌和厭氧型乳酸菌作為后發(fā)酵的分步發(fā)酵形式發(fā)酵生豆粕，抗原蛋白幾乎完全降解。楊文宇等[22]在研究中將豆粕發(fā)酵分為兩個階段，前期發(fā)酵是以枯草芽孢桿菌和黑曲霉好氧發(fā)酵，后期發(fā)酵是以釀酒酵母及保加利亞乳酸桿菌厭氧發(fā)酵，以肽的轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)評價發(fā)酵效果得到兩步發(fā)酵優(yōu)于一步發(fā)酵。

3.3 發(fā)酵工藝對發(fā)酵效果的影響

眾多研究表明，料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量是影響發(fā)酵成敗的重要因素。適宜的料液比能滿足培養(yǎng)系統(tǒng)的氣體流動，讓微生物呈現(xiàn)良好的生長狀態(tài)和最大程度發(fā)揮自身降解能力，水分偏高會導(dǎo)致基質(zhì)透氣性差，不利于散熱和氧的傳遞，影響菌株的生長和繁殖[23]。分離于自然界的微生物，他們的最適生長溫度一般會與其原本的生長環(huán)境相近[24]，溫度過高或過低都不利于微生物生長、繁殖和代謝[25]。在發(fā)酵生產(chǎn)上，發(fā)酵時間越長，發(fā)酵料被外界環(huán)境的腐敗菌污染的風(fēng)險越高，導(dǎo)致發(fā)酵豆粕氨基酸損失和腐敗，散發(fā)較刺鼻氨氮味[26]；但發(fā)酵時間太短，豆粕被發(fā)酵利用程度尚未達(dá)到預(yù)期的效果。合適的接種量有利于復(fù)合菌各菌株的生長繁殖，各酶系之間發(fā)揮最佳的協(xié)同作用，最大程度利用發(fā)酵基質(zhì)[27]。當(dāng)接種量過低，意味著并沒有足夠的生物量充分降解豆粕中的大分子物質(zhì)；接種量過高，豆粕中的營養(yǎng)成分大部分被微生物生長利用，使得豆粕中營養(yǎng)成分減少，不利于提高經(jīng)濟(jì)效益。因此在預(yù)試驗(yàn)中，以大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白為指標(biāo)，對以上4個因素進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示最佳單因素水平是發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度30 ℃，料液比1∶1，總接種量10%。朱平軍[28]研究發(fā)現(xiàn)，在前48 h 用黑曲霉、枯草芽孢桿菌和酵母菌30 ℃好氧發(fā)酵，后48 h 用植物乳桿菌和瘤胃微生物37 ℃厭氧發(fā)酵，好氧發(fā)酵階段料液比為1∶0.9，厭氧仿生發(fā)酵階段料液比為1∶1.2，發(fā)酵后酸溶蛋白含量可達(dá)20.06%，粗蛋白含量可達(dá)52.03%。劉曉艷等[29]發(fā)現(xiàn)在料液比1∶1.2，接種量為25%，發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵時間為96 h 的條件下，最終發(fā)酵物中多肽得率達(dá)54.89%，發(fā)酵產(chǎn)物中大豆多肽產(chǎn)率最高，含量為21.47%。

正交試驗(yàn)是利用規(guī)格化的正交表，對多因素及因素的多個水平進(jìn)行考察，因其簡便高效在科學(xué)試驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用[30]。極差分析方法和方差分析方法可以對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，且能驗(yàn)證結(jié)論可靠性[31]。正交試驗(yàn)在發(fā)酵工藝優(yōu)化中被廣泛應(yīng)用。程友飛[18]使用正交設(shè)計優(yōu)化了枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和酵母菌混菌種固態(tài)發(fā)酵豆粕的工藝，楊柳等[32]利用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化飼用納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆粕工藝條件，吝常華等[33]以小肽含量為指標(biāo)，對解淀粉芽孢桿菌單菌固態(tài)發(fā)酵豆粕以及解淀粉芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌3個菌種混菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)以大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量為試驗(yàn)指標(biāo)，依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，使用Minitab軟件設(shè)計四因素三水平的正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：短小芽孢桿菌SE5∶釀酒酵母菌Sa∶乳酸乳球菌17 的配伍比例為2∶2∶1；發(fā)酵初始接入短小芽孢桿菌SE5，發(fā)酵12 h后接入釀酒酵母菌，發(fā)酵24 h后接入乳酸乳球菌17的分步接種順序進(jìn)行發(fā)酵，最優(yōu)的發(fā)酵條件是發(fā)酵溫度30 ℃，總接種量為10%，料液比為1∶1，發(fā)酵時間是48 h，此工藝下的發(fā)酵豆粕大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量分別下降到41.75 mg/g 和32.23 mg/g。接下來，我們還將對發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)成分進(jìn)行分析，并通過飼養(yǎng)試驗(yàn)評價發(fā)酵豆粕在水產(chǎn)動物上的應(yīng)用效果。

4 結(jié)論

短小芽孢桿菌SE5∶釀酒酵母菌Sa∶乳酸乳球菌17的配伍比例為2∶2∶1；發(fā)酵初始接入短小芽孢桿菌SE5，發(fā)酵12 h后接入釀酒酵母菌，發(fā)酵24 h后接入乳酸乳球菌17的分步接種順序進(jìn)行發(fā)酵，最佳發(fā)酵條件是：發(fā)酵溫度30 ℃，總接種量10%，料液比1∶1，發(fā)酵時間為48 h。獲得的發(fā)酵豆粕大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量分別為41.75 mg/g 和32.23 mg/g，降解率分別為71.48%和73.29%。