■沈 城 馬 升 黃蔭鴻 徐建雄

（上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240）

菌糠是菌菇收獲后所剩的培養(yǎng)基，多以玉米芯、鋸木屑、秸稈、甘蔗渣、棉籽殼等以及各種糟渣類的工業(yè)下腳料（如酒糟、醋糟、造紙廠廢液等）為原料，也稱之為“菌渣”。中國是世界上最大的食用菌生產(chǎn)國，年產(chǎn)量超過3 500 萬噸，占世界食用菌總產(chǎn)量的80%以上[1-2]。據(jù)相關研究顯示，每生產(chǎn)1 kg 食用菌，約會產(chǎn)生5 kg 菌糠[3]，因此實際產(chǎn)生的菌糠數(shù)量極其龐大。金針菇作為工廠化生產(chǎn)的主要食用菌品種，不受自然環(huán)境制約，可常年生產(chǎn)，因此每天都會產(chǎn)生大量的菌糠[4]。新鮮菌糠水分含量高，易腐敗變質(zhì)，目前食用菌生產(chǎn)行業(yè)中對菌糠的利用非常粗放，大量廢棄處理會造成嚴重的環(huán)境問題和資源浪費，因此對菌糠的飼料化利用研究具有非常重要的現(xiàn)實意義。

菌糠的本身適口性差、粗纖維含量較高、營養(yǎng)價值較差且不易保存，通常不直接用來制備畜禽飼料。通過微生物發(fā)酵可以改善菌糠適口性，延長菌糠的保藏時間，且能提高菌糠的營養(yǎng)價值，將其轉(zhuǎn)化為有用的飼料原料。微生物生長過程中分泌的纖維素酶將原料中較難被利用的粗纖維分解成易于被機體吸收利用的小分子物質(zhì)，此外還有菌體在不同生長階段分泌產(chǎn)生出一些活性物質(zhì)[5]。周靜鵬等[1]研究發(fā)現(xiàn)，杏鮑菇菌糠飼料經(jīng)過微生物發(fā)酵后營養(yǎng)水平提高，霉菌毒素下降，發(fā)酵后粗蛋白含量平均提升27.12%，粗纖維平均降低19.52%，粗脂肪平均提升38.92%[4]。

以往的發(fā)酵菌糠研究多致力于從碳源、氮源等角度通過復配營養(yǎng)物質(zhì)來探索最佳的發(fā)酵條件，雖發(fā)酵程度高，對菌糠的品質(zhì)尤其是營養(yǎng)物質(zhì)提升明顯，但是存在條件復雜、步驟繁瑣、操作便利性不佳等問題，難以推廣應用。本試驗針對新鮮金針菇菌糠高水分、低養(yǎng)分、易霉變特點，以發(fā)酵劑、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為變量設計試驗，建立一種易發(fā)酵、易操作、活菌含量高且耐儲存的金針菇菌糠厭氧固態(tài)發(fā)酵工藝，并進行營養(yǎng)價值評價，為菌糠的飼料化利用提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌糠：選用金針菇生產(chǎn)過程中采集鮮菇后的新鮮菌渣，由上海光明森源生物科技有限公司提供。

發(fā)酵劑：發(fā)酵劑由酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌組成（見表1），發(fā)酵劑由上海源耀農(nóng)業(yè)股份有限公司提供。

表1 發(fā)酵劑組成

1.2 發(fā)酵工藝與處理

以采摘當天新鮮金針菇菌糠為發(fā)酵原料，以不同發(fā)酵劑、發(fā)酵溫度（25、30、35 ℃）、發(fā)酵時間（3、5、7 d）組合不同的發(fā)酵處理，每處理設5個重復。將金針菇菌糠用手持式電動粉碎機粉碎后過20目篩，以1%接種發(fā)酵劑，攪拌均勻，裝入密封的錫箔袋（250 g/袋），盡可能排除空氣，密封，放入培養(yǎng)箱進行固體厭氧發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后放入-20 ℃冰箱中保存待測。具體發(fā)酵參數(shù)如表2所示。

表2 金針菇菌糠的發(fā)酵條件

1.3 測定指標與方法

1.3.1 飼料感官分析

菌糠發(fā)酵飼料無專用感官評價方法，故參考德國農(nóng)業(yè)協(xié)會（Deutsche Lan Dwirtschafts Gesellschaft，DLG）青貯飼料品質(zhì)評分法，根據(jù)氣味、質(zhì)地、色澤3項進行評分，然后再按得分分為優(yōu)良（16～20 分）、尚可（10～15分）、中等（5～9分）、腐?。?～4分）4個等級進行感觀評價[6]。具體評分標準見表3。

表3 發(fā)酵金針菇菌糠感官評定標準

1.3.2 常規(guī)營養(yǎng)成分

水分含量的測定采用恒溫干燥法；粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法；粗脂肪含量測定采用索氏提取法；粗纖維含量測定采用酸堿消煮法；粗灰分含量測定采用灼燒法；中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量測定按照GB/T 20806—2006；鈣含量測定采用高錳酸鉀法；總磷含量的測定采用鉬酸銨分光光度法；無氮浸出物含量由計算求出，由光明牧業(yè)有限公司檢驗測試中心測定。

1.3.3 pH、乳酸、活菌數(shù)

取5 g發(fā)酵菌糠樣品于50 mL試管中，加入45 mL去離子水，攪拌均勻靜置過夜，取上清液測pH、乳酸、活菌數(shù)量。以酸度計測定pH，以乳酸測試試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定乳酸含量，活菌數(shù)按照GB/T 13093—2006 進行測定、乳酸菌數(shù)按照GB/T 14699.1進行測定。

1.3.4 保藏試驗

金針菇菌糠按照篩選的發(fā)酵條件（發(fā)酵劑A1、發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度30 ℃）厭氧固態(tài)發(fā)酵后，分別密封在錫箔袋（T1）、暴露于空氣(T2) 置于室溫條件下保存，另取未發(fā)酵菌糠暴露于空氣中(T3)保存，從第1 d開始連續(xù)7 d每天觀察菌糠的感官和霉變情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016軟件對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），以Duncan’s 法進行多重比較，以P<0.05 作為差異顯著性標準，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料感官分析（見表4）

表4 發(fā)酵金針菇菌糠感官評定

由表4結(jié)果可知，發(fā)酵菌糠的感官評價明顯優(yōu)于未發(fā)酵菌糠，且發(fā)酵時間對于飼料感官的影響明顯高于發(fā)酵溫度和發(fā)酵劑，其次是發(fā)酵溫度，發(fā)酵劑的影響最小。按照評分標準綜合來看，第7組和第11組的發(fā)酵條件最佳。

2.2 營養(yǎng)成分分析（見表5）

表5 發(fā)酵金針菇菌糠養(yǎng)分含量

由表5 結(jié)果可知，發(fā)酵能改善金針菇菌糠粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分和無氮浸出物等指標，但與對照組無顯著性差異（P>0.05）。與對照組相比，發(fā)酵組中性洗滌纖維最高可降低12.79%（P<0.05），發(fā)酵組酸性洗滌纖維最高可降低16.88%（P<0.05）。

2.3 pH和乳酸含量（見表6）

由表6 結(jié)果可知，發(fā)酵對pH、乳酸有顯著影響。與對照組相比，發(fā)酵組pH平均下降21.89%（P<0.05），乳酸有顯著性增加。發(fā)酵處理組的發(fā)酵品質(zhì)明顯好于對照組，且時間對pH 和乳酸的影響明顯高于溫度和發(fā)酵劑，其次是發(fā)酵溫度，發(fā)酵劑的影響最小。以pH、和乳酸含量來評價，以第11 組效果最好，第7 組和第8組效果次之。

表6 發(fā)酵菌糠pH和乳酸含量

2.5 總菌數(shù)和乳酸菌含量（見表7）

表7 發(fā)酵菌糠總菌數(shù)和乳酸菌含量（CFU/g）

由表7 結(jié)果可知，發(fā)酵后可以顯著提升菌糠的總菌和乳酸菌含量。其中以第7 組和第8 組的活菌含量和乳酸菌含量最高。與對照組相比總菌數(shù)和乳酸菌總數(shù)均提升了4 個數(shù)量級，達到了109級別（P<0.05）。

綜合以上結(jié)果可知，第7、8組和第11組的各項綜合發(fā)酵指標較好，但由于第8 組具有刺鼻的難聞異味，感官評價結(jié)果相對較差，第7 組的感官評價和活菌數(shù)含量都優(yōu)于第11組，因此最終選擇第7組的發(fā)酵條件作為最優(yōu)發(fā)酵條件。

2.6 保藏試驗（見表8）

表8 各處理組不同保藏天數(shù)下感官變化

由表8可知，發(fā)酵菌糠的感官評價和保藏效果明顯優(yōu)于未發(fā)酵。發(fā)酵菌糠在前5 d中感官評價都是優(yōu)良，而未發(fā)酵組感官評價始從剛開始的中等更是跌落到腐敗級別。發(fā)酵菌糠至保藏第7 d發(fā)酵飼料均未發(fā)生霉變，而未發(fā)酵T3組第3 d開始已經(jīng)發(fā)霉，到第5 d的時候已經(jīng)嚴重霉變。

3 討論

新鮮金針菇菌糠采用本試驗發(fā)酵工藝直接發(fā)酵，不僅能夠改善菌糠的感觀評價，而且可以延長菌糠的保質(zhì)期。發(fā)酵后的金針菇菌糠質(zhì)地較好，顏色以黃色為主，呈現(xiàn)酸香味，感官評價良好，且發(fā)酵后至少可密閉保存7 d 不發(fā)生霉變，這與前人的研究結(jié)果一致?，斃锾m·畢克塔依爾等[7]研究發(fā)現(xiàn)玉米秸稈經(jīng)過發(fā)酵后呈淡黃色，有芳香果味，感官評價良好，且保存期可延長至3 個月。乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的風味物質(zhì)，因而能改善菌糠的感官評價。飼料霉變是微生物（主要是霉菌）生長繁殖的結(jié)果[8]。酵母菌在好氧發(fā)酵過程中，通過空間占位、氧氣競爭和產(chǎn)生乙醇等抑菌物質(zhì)，可有效抑制霉菌的生長。乳酸菌在厭氧發(fā)酵階段大量繁殖，產(chǎn)生大量的乳酸，導致pH迅速降低，而富含的乳酸所生成的低pH環(huán)境能夠抑制雜菌的生長，延長菌糠保存時間[9]。

通常的發(fā)酵菌糠研究多致力于從碳源、氮源等角度通過復配營養(yǎng)物質(zhì)來探索最佳的發(fā)酵條件，通過提高發(fā)酵程度，提升菌糠的常規(guī)營養(yǎng)價值（如粗蛋白），如李志濤等[10]響應面分析白靈菇菌糠∶玉米粉比例、酵母菌∶乳酸菌比例、初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等9 種因素探索白靈菇菌糠發(fā)酵飼料最佳蛋白發(fā)酵條件，結(jié)果發(fā)酵后粗蛋白含量提高了78.6%；楊榮玲等[11]通過正交試驗研究碳源、氮源以及發(fā)酵時間3個因素對雙孢菇菌糠營養(yǎng)價值的影響，研究發(fā)現(xiàn)在采用葡萄糖、蛋白胨等優(yōu)質(zhì)碳源和氮源后發(fā)酵時間可以明顯縮短，在發(fā)酵3.5 d后即可達到最佳效果，發(fā)酵后粗蛋白含量提高了73.1%。但這些發(fā)酵方法存在條件復雜、步驟繁瑣、操作便利性不佳等問題，因而也是限制食用菌菌糠產(chǎn)業(yè)化的重要因素，因此也有一部分學者采取較為簡單的菌糠發(fā)酵方式，嘗試為食用菌菌糠的產(chǎn)業(yè)化應用提供另一種思路。陳炳鈿等[12]在研究金針菇菌糠發(fā)酵時采取了室溫發(fā)酵7、15 d和30 d，結(jié)果表明采用外加乳酸菌（添加量為發(fā)酵原料鮮重的108CFU/g）室溫發(fā)酵7 d 能改善發(fā)酵平菇菌糠的pH和乳酸等指標，但粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維等常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)提升幅度不高；孟碟方等[13]在研究平菇菌糠發(fā)酵時也得到了類似的結(jié)果。這些研究表明在額外添加乳酸菌發(fā)酵時，簡單的發(fā)酵工藝也具備改善菌糠品質(zhì)的可行性，但對粗蛋白等常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)提升幅度不大，這與本試驗結(jié)果一致。在本試驗中，未外加碳源和氮源，推薦的發(fā)酵工藝為由釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌組成的發(fā)酵劑、發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度30 ℃。在此條件下發(fā)酵菌糠的乳酸含量最高、pH最低，活菌含量最高。有研究表明[12-14]，嗜酸乳桿菌產(chǎn)乳酸能力強，可有效降低pH，發(fā)酵產(chǎn)物活菌數(shù)高。微生物最適合的生長溫度通常為28～40 ℃。溫度過低時，菌種生長與代謝緩慢，不利于發(fā)酵作用；當溫度過高時，菌種的種群發(fā)生變化，也不利于發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定[15]。在本試驗中，發(fā)酵溫度為30 ℃時效果最好，這與李佳騰等[16]研究混菌發(fā)酵杏鮑菇菌糠和楊榮玲等[11]研究雙孢菇菌糠發(fā)酵采用的溫度相同。發(fā)酵時間是保證發(fā)酵菌糠品質(zhì)的一項重要因素，最適的發(fā)酵時間受菌種、底物、料液比等因素影響[10]。在本試驗中，最適發(fā)酵時間是7 d，這也與陳炳鈿等[12]和孟碟方等[13]得出的時間相似，這可能是因為添加的乳酸菌能夠加快pH 的下降，可縮短發(fā)酵菌糠的發(fā)酵過程[13]。

4 結(jié)論

綜上所述，新鮮金針菇菌糠發(fā)酵參數(shù)為發(fā)酵劑由釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌組成，發(fā)酵時間7 d，發(fā)酵溫度30 ℃；與對照組相比，發(fā)酵后的金針菇菌糠粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分和無氮浸出物等指標無顯著性差異（P>0.05），中性洗滌纖維最高可降低12.79%（P<0.05），酸性洗滌纖維最高可降低16.88%（P<0.05），發(fā)酵后的金針菇菌糠乳酸含量6.03 g/kg，pH 4.52；乳酸菌數(shù)達到1.68×109CFU/g；在常溫下可密閉保存1周以上。