李 芳，李長征，沈致淳，李雪梅，王 穎，劉 棟,李蓉娟

(大東港海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 丹東 118300)

“辣”是韓國飲食最具代表性的特點(diǎn)，韓國人以嗜好吃辣而出名，但辣椒并不是韓國土生土長的傳統(tǒng)作物。韓國是我國辣椒出口的重要目標(biāo)市場，目前中國生產(chǎn)的辣椒在韓國市場中的占有率呈逐年增長態(tài)勢。

目前，各國政府和組織采取日趨嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)藥的最大殘留限質(zhì)量分?jǐn)?shù)已降低到10-9水平，同時(shí)，限量標(biāo)準(zhǔn)中涉及農(nóng)藥的種類也在不斷增多。隨著農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)的日益嚴(yán)格，對農(nóng)藥殘留的樣品前處理和檢測方法也發(fā)生了巨大的變化，樣品前處理從傳統(tǒng)的液液萃取轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔噍腿?、基質(zhì)分散萃取和快速溶劑萃取、凝膠凈化(gel permeation chromatography,GPC)、凝膠凈化在線聯(lián)機(jī)系統(tǒng)等新方法，檢測方法也從傳統(tǒng)的幾種或1類農(nóng)藥殘留的分析趨向于多農(nóng)藥殘留的快速分析[1-5]。我國現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法[6-9]，這些方法可對已知目標(biāo)化物進(jìn)行檢測，但對未知化合物的檢測能力相對有限。

基于以上情況，本課題將采用先進(jìn)設(shè)備，實(shí)現(xiàn)檢測的全自動前處理[10]，減少隨機(jī)誤差。采用飛行時(shí)間質(zhì)譜SWATH(sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra)采集模式，用自動解卷積的方法，實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留的快速篩查。該方法的自動化程度及準(zhǔn)確度和靈敏度均較高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取10 g攪碎的辣椒樣品于40 mL萃取池，加入硅藻土至填滿萃取池，在100 ℃、10 MPa的條件下用乙腈萃取2次，收集提取液，待凈化。

1.2.2 樣品凈化

由于提取溶劑為乙腈，因而需進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換方可進(jìn)行GPC凝膠凈化。設(shè)定在線方法為EVA-GPC-EVA(預(yù)溶劑濃縮-凝膠凈化-溶劑濃縮)，預(yù)濃縮設(shè)定為蒸干，用5 mL乙酸乙酯+環(huán)己烷(1∶1，體積比)定容，供在線GPC上樣凈化，去除色素、脂肪等大分子雜質(zhì)，收集時(shí)間為12～26 min。收集液經(jīng)濃縮后，用乙腈定容至1 mL，直接上機(jī)檢測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：SB-C18，2.1 mm×100 mm，2.7 μm；流動相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水；流動相B：乙腈；洗脫梯度見表1；流量：0. 4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫

1.2.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜分析采用ESI離子源，正離子模式掃描。IS電壓為5 500 V(+)，離子源溫度為550 ℃，氣簾氣CUR：30 pis，碰撞氣CAD：7，霧化氣GAS1：55 psi，輔助氣GAS2：55 psi，碰撞能量： (35±15)V (CE±CES)。

1.2.5 數(shù)據(jù)采集

四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜具有超快的采集速率、智能化的TOF MS-SWATH-MS/MS采集模式以及穩(wěn)定耐用的離子源，非常適合復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析，可通過1針進(jìn)樣即可采集到全面和高質(zhì)量的一級與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而通過一級質(zhì)量化合物、化合物同位素峰形、保留時(shí)間和高質(zhì)量精度的二級譜這“四大關(guān)”進(jìn)行目標(biāo)化合物篩查，快速高效地提供最準(zhǔn)確的定性篩查結(jié)果。本研究中要進(jìn)行定量分析的27種農(nóng)藥的具體信息見表2。

表2 27種農(nóng)藥化合物的色譜質(zhì)譜信息

1.2.6 定性篩查

采用儀器自帶分析軟件對市售辣椒樣品進(jìn)行農(nóng)藥殘留測定。在軟件中調(diào)用數(shù)據(jù)庫，并設(shè)置Mass Error(1×10-6)、Retention Time(min)、Isotope、Library Hit、Fonmula、Finder的相關(guān)權(quán)重，通過給出各檢索參數(shù)的實(shí)測值和理論值的偏差，利用匹配結(jié)果來確定篩查結(jié)果。

1.2.7 定量分析

本實(shí)驗(yàn)利用基質(zhì)液為溶劑配置混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的 標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍為0.000 5～0.100 0 μg/mL，由于各種農(nóng)藥在儀器上的響應(yīng)有差別，所以每種農(nóng)藥的線性范圍不一致，針對篩查結(jié)果為陽性的樣品要選用合適的曲線濃度范圍，確保計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選用快速溶劑萃取提取方法，嘗試優(yōu)化提取溫度和提取壓力，在100 ℃時(shí)，比較8、9、10、11 MPa壓力下的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：壓力低于10 MPa時(shí)，回收率相對較低；10 MPa和11 MPa時(shí)，提取效果幾乎沒有差異。所以選擇10 MPa為提取壓力。同時(shí)，在10 MPa時(shí)，比較90、100、110、120 ℃的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)溫度低于100 ℃時(shí)，回收率相對較低；當(dāng)溫度為110、120 ℃時(shí)，提取溶劑較渾濁，雜質(zhì)較多，回收率與100 ℃相比幾乎無差別。所以選擇提取溫度為100 ℃。

2.2 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)選擇Agilent的C18(100 mm×2.1 mm，2.1 μm)色譜柱對27種目標(biāo)化合物進(jìn)行分離分析，并比較甲醇-水和乙腈-水2種流動相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲醇-水體系只針對個(gè)別農(nóng)藥分離效果較好，和乙腈-水體系差別不大；但是由于甲醇-水為流動相體系，柱壓相對較高，所以本研究選用乙腈-水為流動相體系。在此基礎(chǔ)上又對乙腈-水和乙腈-質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水又會使部分農(nóng)藥響應(yīng)更高，所以最終確定以乙腈-質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水為流動相。

2.3 質(zhì)譜篩查模式的選擇

與IDA采集模式相比，SWATH技術(shù)基于高分辨系統(tǒng)，又綜合了IDA和MRM的優(yōu)勢，將母離子的質(zhì)量范圍分成多個(gè)質(zhì)量窗口，每個(gè)窗口內(nèi)的所有離子一起碰撞碎裂，從而得到整個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)的所有離子的碎片信息。SWATH技術(shù)所測得的二級碎片不同于IDA只測被選中觸發(fā)的離子，而是測所有相應(yīng)的離子，從而保證了所有離子碎片的連續(xù)性，可以實(shí)現(xiàn)SWATH二級定量并且可以保留更加完整的樣品信息，真正實(shí)現(xiàn)非靶向篩查，所以本研究選用SWATH采集方式。在對同一組數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析時(shí)，選用二級離子和一級離子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二級離子響應(yīng)較低，而且穩(wěn)定性較弱；而一級離子則相對穩(wěn)定，并且響應(yīng)較高。這主要是由于二級打碎離子的能量并不像MRM為固定值，而是在1個(gè)范圍內(nèi)打碎，所以本研究選用一級母離子作為定量離子。

2.4 前處理回收率

本實(shí)驗(yàn)選用快速溶劑萃取方法提取農(nóng)藥，F(xiàn)reestyle全在線凝膠凈化/定量濃縮聯(lián)機(jī)系統(tǒng)凈化提取液，因該方法具有高自動化、高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，因而可被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測中。結(jié)果顯示辣椒中27種農(nóng)藥的回收率為65.8%～100.5%(回收率以檢出限添加濃度計(jì)算)，每種農(nóng)藥以基質(zhì)液為溶劑配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)。重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)的回收率及我國對于辣椒樣品的最大殘留限量值見表3。

表3 27種農(nóng)藥在辣椒中的最大殘留量、回收率、檢出限、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

由表3結(jié)果可知，本方法的檢出限均低于GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中的限量標(biāo)準(zhǔn)，可滿足國內(nèi)市場檢測的要求。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用快速溶劑萃取法[11]，實(shí)現(xiàn)提取的全面高效性；Freestyle全在線凝膠凈化/定量濃縮聯(lián)機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行凈化，去除色素、脂肪等大分子雜質(zhì)[12]，應(yīng)用HPLC-QTOF-MS的SWATH采集模式對辣椒樣品中的農(nóng)藥進(jìn)行非靶向篩查[13]，同時(shí)完成27種常用農(nóng)藥的定量分析。該方法的線性關(guān)系良好、自動化程度高、準(zhǔn)確度高，具有一定的實(shí)用性。從長遠(yuǎn)看，該方法可以延伸應(yīng)用到更多種類樣品的農(nóng)藥篩查，可以由農(nóng)藥檢測向獸藥檢測、毒素檢測、添加劑檢測等多方面擴(kuò)展。