崔雪雯，郭志鵬，毛 月，牛軍鵬，隋 欣，徐 楠，王佺珍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

據(jù)統(tǒng)計，中國鹽堿地總面積達(dá)9.913×10hm，約占國土面積的1/10。土地鹽漬化是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的重要環(huán)境因素之一，鹽脅迫會導(dǎo)致種子萌發(fā)推遲、生長發(fā)育緩慢、產(chǎn)量降低，進(jìn)而嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前，全世界鹽堿地改良利用已形成兩類主導(dǎo)技術(shù)，一是通過灌排技術(shù)改良土壤，二是發(fā)展耐鹽植物利用鹽堿土。

與多數(shù)農(nóng)作物相比，牧草的質(zhì)量受土壤和水分的影響相對較小，是發(fā)展耐鹽植物、利用鹽漬化土地較好的材料。紫花苜蓿(L.)作為全球性栽培的多年生豆科牧草，其高產(chǎn)穩(wěn)定、適應(yīng)性廣、營養(yǎng)價值高、適口性好，是優(yōu)良草種的典型代表。紫花苜蓿還可以有效降低土壤鹽分，改善土壤環(huán)境，為其他經(jīng)濟(jì)作物的種植創(chuàng)造良好的條件。國外的苜蓿產(chǎn)業(yè)較為發(fā)達(dá)，培育出了許多優(yōu)質(zhì)的苜蓿品種。但由于國內(nèi)外氣候、土壤、耕作方式差異較大，篩選合適的商業(yè)品種尤為重要。中國鹽堿地面積大，篩選出適宜的耐鹽品種并有效利用鹽堿地，將會極大地促進(jìn)中國苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

前人在紫花苜蓿耐鹽性篩選和鑒定時期的選擇方面已有研究。于卓等、McCoy和Babakhani等均認(rèn)為在早期進(jìn)行耐鹽篩選最為合適。紫花苜蓿在發(fā)芽期和苗期對鹽分比較敏感，而隨著苜蓿的生長，其根部延伸較長，使得苜蓿受地表鹽脅迫的影響逐漸減少。苜蓿作為一種深根植物，而鹽漬土多存在于土地表層，所以僅會在萌發(fā)期和幼苗期受鹽脅迫影響較大。本研究以33份國內(nèi)外紫花苜蓿品種為材料，用NaCl 溶液模擬鹽脅迫，鑒定其在萌發(fā)期的耐鹽性，探討紫花苜蓿耐鹽性鑒定的適宜鹽濃度，并篩選出耐鹽性品種，為鹽堿地的有效利用和耐鹽性紫花苜蓿新品種的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的33個紫花苜蓿品種(表1)由北京正道種業(yè)有限公司(1～20)、百綠(天津)國際草業(yè)有限公司(21～31)和酒泉大業(yè)種業(yè)有限責(zé)任公司(32～33)提供。

表1 33個紫花苜蓿品種信息Table 1 Information of 33 alfalfa cultivars

1.2 試驗設(shè)計

以NaCl 溶液為培養(yǎng)液，各處理質(zhì)量體積濃度分別為0(蒸餾水，CK)、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%，每個處理重復(fù)3次。每個重復(fù)選取大小均勻、籽粒飽滿的種子50粒，用5%的次氯酸鈉消毒10 min，后用蒸餾水反復(fù)沖洗4～5次，均勻放置于培養(yǎng)皿中，采用紙上發(fā)芽法，在PGX-80A光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d(光照16 h，25 ℃；黑暗8 h，20 ℃)，定期補(bǔ)加蒸餾水，每天記錄種子發(fā)芽個數(shù)，并在第10天測定根長芽長。

1.3 測定指標(biāo)

發(fā)芽勢(Germination potential，GP)=第4天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

發(fā)芽率(Germination rate，GR)=第10天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

在第10天測定苜蓿根長、芽長：隨機(jī)選取10株幼苗，重復(fù)3次，用游標(biāo)卡尺測定苜蓿幼苗的根長和芽長。

指標(biāo)相對值=鹽脅迫下的測定值/對照的平均測定值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和初步分析，用SPSS 23.0對相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對根長和相對芽長進(jìn)行方差分析。用SPSS 23.0對各測試指標(biāo)相對值和鹽濃度進(jìn)行一元二次回歸分析：=++，(、、為方程系數(shù))。

根據(jù)得到的一元二次回歸方程計算各相對指標(biāo)為0.5(=0.5)時的值，即半致死()條件下的鹽濃度，將得到的值進(jìn)行聚類分析，確定不同品種在半致死條件下的耐鹽級別。將計算得到的各值進(jìn)行算數(shù)平均，得到鑒別濃度。將均值帶回一元二次方程中，得到各指標(biāo)在鑒別濃度條件下的計算值。

利用各指標(biāo)在鑒別濃度條件下的計算值為原始數(shù)據(jù)，采用隸屬函數(shù)對各數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。隸屬函數(shù)公式為

式中：表示第個指標(biāo)值；、分別表示第個指標(biāo)的最小值和最大值。利用得到的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

利用各指標(biāo)的相對值為原始數(shù)據(jù)，采用隸屬函數(shù)對各數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。得到每個指標(biāo)在不同鹽濃度下的隸屬函數(shù)值后，求得其平均值，再利用此平均值進(jìn)行聚類分析。通過對比3種聚類分析結(jié)果，確定計算得到的鑒別濃度是否合理，同時確定不同品種的耐鹽性等級。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對種子發(fā)芽的影響

由表2可知，種子的相對發(fā)芽勢隨NaCl濃度的增大而降低。當(dāng)鹽濃度為0.9%時：游客+等6個品種的相對發(fā)芽勢均高于0.90；Claudia等6個品種均低于0.20，顯著低于前面6個品種(<0.05)。當(dāng)鹽濃度為1.2%時：WL525HQ等6個品種的相對發(fā)芽勢高于0.50；WL363HQ等5個品種低于0.05，顯著低于上述6個品種(<0.05)。當(dāng)鹽濃度為1.5%時：只有阿羅拉等 4個品種的相對發(fā)芽勢高于0.20；皇后等8個品種沒有萌發(fā)。從相對發(fā)芽勢來看， WL525HQ、游客+和天馬3個品種的耐鹽性強(qiáng)，WL712等9個品種的耐鹽性較強(qiáng)，其余21個品種的耐鹽性較弱。

表2 鹽脅迫對苜蓿種子相對發(fā)芽勢的影響Table 2 Effects of salt stress on the relative germination potential of alfalfa seeds

由表3可知，大部分品種紫花苜蓿種子的相對發(fā)芽率隨著NaCl濃度的增長而降低。低濃度的鹽脅迫(0.3%和0.6%)對相對發(fā)芽率的抑制作用較小，對部分品種還有促進(jìn)作用；當(dāng)鹽濃度升至1.5%時，相對發(fā)芽率受到嚴(yán)重抑制。當(dāng)鹽濃度為0.9%時：WL168HQ等5個品種的相對發(fā)芽率均大于1；賽迪10等9個品種高于0.90；三得利等6個品種低于0.70，顯著低于以上14個品種(<0.05)，其中，艾禾1號的相對發(fā)芽率低于0.20。當(dāng)鹽濃度為1.2%時：WL168HQ等6個品種的相對發(fā)芽率高于0.85；WL440HQ等9個品種低于0.50，顯著低于上述6個品種(<0.05)。當(dāng)鹽濃度為1.5%時：WL525HQ等5個品種的相對發(fā)芽率高于0.70；三得利等8個品種低于0.20，其中，艾禾1號的相對發(fā)芽率最低，僅為0.01。從相對發(fā)芽率來看，Claudia等8個品種的耐鹽性強(qiáng)，Blue moon等17個品種的耐鹽性較強(qiáng)，其余8個品種的耐鹽性較弱。

表3 鹽脅迫對苜蓿種子相對發(fā)芽率的影響Table 3 Effects of salt stress on relative germination rate of alfalfa seeds

2.2 鹽脅迫對種子幼苗生長的影響

由表4可知，隨著鹽濃度的增長，大部分品種幼苗的相對根長先增后減。當(dāng)鹽濃度為0.3%和0.6%時：分別有19和9個品種的相對根長高于對照組。當(dāng)鹽濃度為0.9%時：Bara 420YQ等4個品種的相對根長高于對照；Bara 416WET等3個品種略低于對照；WL366HQ等7個品種低于0.50，顯著低于上述7個品種(<0.05)。當(dāng)鹽濃度為1.2%時：WL298HQ等3個品種的相對根長高于0.75；WL440HQ等10個品種低于0.20，顯著低于上述3個品種(<0.05)。當(dāng)鹽濃度為1.5%時：WL168HQ的相對根長最高，為0.86，顯著高于其余32個品種(<0.05)；WL343HQ等12個品種低于0.10，其中Blue moon和艾禾1號的相對根長為0。從相對根長來看，WL168HQ的耐鹽性強(qiáng)，Bara 218TR等4個品種的耐鹽性較強(qiáng)，其余28個品種的耐鹽性較弱。

表4 鹽脅迫對苜蓿幼苗相對根長的影響Table 4 Effects of salt stress on relative root length of alfalfa seedlings

由表5可知，對于部分紫花苜蓿品種來說，其幼苗相對芽長隨鹽濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。當(dāng)鹽濃度為0.3%和0.6%時，分別有21和11個紫花苜蓿品種的幼苗芽長高于對照組。當(dāng)鹽濃度為0.9%時，WL168HQ等5個品種的相對芽長高于對照組；WL353HQ等11個品種低于0.70，顯著低于上述5個品種(<0.05)；鹽濃度為1.2%時，Central的芽長高于對照；皇后的相對芽長最低，為0.30；當(dāng)鹽濃度為1.5%時，WL252HQ和WL903的相對芽長高于0.70；艾禾1號和Blue moon兩個品種未長出幼芽。從相對芽長來看，Claudia和WL168HQ的耐鹽性強(qiáng)，Paola等14個品種的耐鹽性較強(qiáng)，其余17個品種的耐鹽性較弱。

表5 鹽脅迫對苜蓿幼苗相對芽長的影響Table 5 Effects of salt stress on relative shoot length of alfalfa seedlings

2.3 一元二次方程回歸分析

根據(jù)各指標(biāo)的相對值與鹽濃度進(jìn)行一元二次回歸分析得到方程及其系數(shù)(表6)。根據(jù)一元二次方程的特性，可以得出，所有系數(shù)a為負(fù)數(shù)的品種，出現(xiàn)了在低濃度鹽脅迫促進(jìn)其生長的情況。WL343HQ等4個品種在萌發(fā)初期對鹽脅迫更為敏感。WL343HQ等6個品種在第10天系數(shù)a的絕對值明顯減小，說明其在持續(xù)的鹽脅迫下恢復(fù)、適應(yīng)能力較好。在根長擬合曲線中也有許多X2的系數(shù)絕對值較大，表明紫花苜蓿根受鹽脅迫的影響遠(yuǎn)大于芽。

表6 一元二次回歸方程系數(shù)表Table 5 Coefficients of unitary quadratic regression equation

2.4 篩選濃度的鑒定

半致死濃度常常應(yīng)用于植物的抗逆篩選。根據(jù)得到的一元二次回歸方程計算各相對指標(biāo)半致死條件下的鹽濃度結(jié)果表明，33個紫花苜蓿品種的耐鹽半致死濃度()均值為1.24%(表7)。總的來看,在各指標(biāo)中，不同耐鹽指標(biāo)的間存在較大差異，在選擇指標(biāo)時應(yīng)區(qū)別對待。

表7 苜蓿種子的耐鹽半致死濃度Table 7 The half-lethal NaCl concentrations of alfalfa seeds

2.5 耐鹽性聚類分析

將各項指標(biāo)的作為依據(jù)，進(jìn)行聚類分析，得到圖1a。根據(jù)聚類分析結(jié)果，可將33個品種根據(jù)耐鹽性分為4類。WL903的為1.52，耐鹽性最強(qiáng)；WL363HQ等9個品種的耐鹽性較強(qiáng)；Bara 420YQ等14個品種的耐鹽性一般；先行者等9個品種的為1.03，為鹽敏感品種。

以相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長和相對芽長作為依據(jù)，采用隸屬函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。然后采用標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析得到圖1b。結(jié)果顯示，在歐式距15處，33個品種的紫花苜蓿分為4組，WL168HQ的耐鹽性最強(qiáng)；WL343HQ等13個品種的耐鹽性較強(qiáng)；WL252HQ等11個品種耐鹽性一般；WL366HQ等8個品種為鹽敏感品種。

圖1 NaCl脅迫下33個品種紫花苜蓿耐鹽性聚類分析a. S50聚類分析；b. 所有鹽濃度脅迫下聚類分析；c. 1.24% NaCl脅迫下聚類分析Fig. 1 Clustering analysis of salt-tolerance of 33 alfalfa varieties under NaCl stressa. The S50 cluster analysis; b. The cluster analysis under all salt concentration stress;c. The cluster analysis under 1.24% NaCl stress

將分析得到的適宜篩選濃度1.24%帶入回歸方程，得到在篩選濃度下的各項指標(biāo)的相對值。用此相對值進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，用得到的隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析得到圖1c。結(jié)果表明，WL168HQ等11個品種的耐鹽性較強(qiáng)；WL903等10個品種的耐鹽性一般；皇后等12個品種對鹽最敏感。

3 討 論

鹽脅迫對植物生長發(fā)育和生理代謝有著重要影響，主要表現(xiàn)在種子發(fā)芽、苗期生長、光合作用、呼吸作用以及蛋白質(zhì)合成等方面。種子在鹽脅迫狀態(tài)下能否快速高效地吸收周圍環(huán)境中的水分，也是檢驗種子耐鹽性的一項重要指標(biāo)。種子通過吸脹作用從外界吸收足夠的水分后，才能開始發(fā)芽，形成新的植株；吸脹作用直接影響著種子的萌發(fā)。從總體來看，本研究中，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率隨鹽濃度的增高而降低，這與高立杰等在高丹草上的研究結(jié)果一致。在0.3%和0.6%的NaCl處理下，分別有13個和10個紫花苜蓿品種的種子發(fā)芽率高于對照組，當(dāng)鹽濃度到達(dá)1.2%時，各品種紫花苜蓿種子發(fā)芽率顯著低于對照組(<0.05)，在1.5% NaCl脅迫中，大部分紫花苜蓿品種的種子發(fā)芽率極低，甚至不萌發(fā)，這與徐曼等在長穗偃麥草種子耐鹽性研究的結(jié)果一致。同時，通過本次試驗發(fā)現(xiàn)，在低鹽濃度的條件下，仍有20個紫花苜蓿品種的種子未表現(xiàn)出促進(jìn)作用，這種情況也出現(xiàn)于堿茅和黑麥、無芒雀麥等牧草種子和番茄、苦瓜等經(jīng)濟(jì)作物種子中，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

在對比幼苗根長時，有20個紫花苜蓿品種的根長均值在低鹽濃度時高于對照組，隨著鹽濃度的逐步增加，鹽脅迫對幼根呈現(xiàn)出抑制作用。而在鹽脅迫增加的過程中，幼芽受抑制的程度較輕。馬洪雨在對大豆進(jìn)行耐鹽性分析時發(fā)現(xiàn)，根中的蛋白組比葉的蛋白組更敏感。上述結(jié)果意味著，在鹽脅迫下，根部的受損情況要更加嚴(yán)重，這與本次試驗得出的結(jié)果一致。

進(jìn)行植物種質(zhì)耐鹽性鑒定時，鹽濃度的選擇是非常重要的一步，其既要滿足供試材料在該濃度下顯示出顯著的脅迫性狀，又要保證不能使供試材料瀕臨死亡，以免導(dǎo)致出現(xiàn)試驗誤差。半致死濃度常常作為逆境篩選濃度應(yīng)用于植物的抗逆篩選。根據(jù)表2到表5，鹽濃度在0.9%及以下時，部分品種的各指標(biāo)與對照無顯著差異；鹽濃度在1.5%時，部分品種受抑制程度過重，無法作為實際依據(jù)。由表7可得，本次試驗半致死鹽濃度均值為1.24%，即本次試驗中苜蓿耐鹽性鑒定的理論最佳NaCl濃度應(yīng)為1.24%。這與李明雨等和劉卓等在紫花苜蓿種子耐鹽性研究的結(jié)果相近。也和其他人在高粱、狗牙根和偃麥草的耐鹽性鑒定研究中1.2%的NaCl作為篩選濃度的結(jié)果相近。

聚類分析廣泛應(yīng)用于遺傳性追蹤和分析、抗性研究以及多樣性分析。在本次數(shù)據(jù)處理中采用的三次聚類分析的結(jié)果基本相同。通過三次聚類分析可以得出，本次試驗中耐鹽性強(qiáng)的品種有WL16HQ和WL298HQ，適宜在高鹽土壤種植。本研究結(jié)果可為今后鹽堿地的有效利用和耐鹽性紫花苜蓿新品種的選育提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

紫花苜蓿幼苗根部比芽部對鹽脅迫更為敏感；適宜于紫花苜蓿耐鹽性篩選的鹽濃度為1.24% NaCl；紫花苜蓿耐鹽品種為WL16HQ和WL298HQ，鹽敏感品種為皇后、隴南1號、艾禾1號、可汗和WL366HQ。