孫春濤盛優(yōu)靜楊霞郭翠

1寧夏回族自治區(qū)婦幼保健院（寧夏回族自治區(qū)兒童醫(yī)院）（銀川 750001）

2北京淦江生物技術(shù)有限公司(北京 100176）

耳聾位居我國各類殘疾之首，也是常見的出生缺陷之一，新生兒耳聾的發(fā)病率大約為1-3‰。耳聾的致病原因復(fù)雜，包括遺傳因素和環(huán)境因素，其中遺傳因素約占60%[1]，包括常染色體隱/顯性遺傳、X-連鎖顯/隱性遺傳、線粒體母系遺傳[2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)GJB2、SLC26A4、MT-RNR1等基因?yàn)橹袊巳撼Ｒ娭旅@基因[3]。針對我國常見耳聾基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)進(jìn)行基因篩查以及采用物理學(xué)檢測技術(shù)進(jìn)行新生兒常規(guī)聽力學(xué)篩查是耳聾出生缺陷的三級預(yù)防手段，在降低耳聾出生缺陷方面具有重要作用。

寧夏回族自治區(qū)深處內(nèi)陸，位于中國西北部的黃河中上游地區(qū)，是我國回族長居人口最多的地區(qū)。為了解寧夏地區(qū)新生兒聽力篩查未通過新生兒耳聾基因突變特點(diǎn)以及本地區(qū)漢族、回族間耳聾基因突變差異，本研究對寧夏地區(qū)960例聽力篩查未通過新生兒進(jìn)行4個常見耳聾基因的15個突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，結(jié)果分析如下：

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

2017年9月-2019年12月期間，從銀川市婦幼保健院、寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院、吳忠市婦幼保健院、中衛(wèi)市婦幼保健院、石嘴山市婦幼保健院、固原市婦幼保健院等95家助產(chǎn)機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)診至寧夏回族自治區(qū)婦幼保健院（寧夏回族自治區(qū)兒童醫(yī)院）的960例聽力初篩、復(fù)篩均未通過的新生兒為研究對象，這些新生兒的父母雙方或一方為寧夏戶籍，漢族600例，占62.5%，回族342例，占35.6%，其他民族（滿族、蒙古族）18例，占1.9%。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

充分告知所有受檢新生兒父母或監(jiān)護(hù)人本次耳聾基因篩查的目的、意義、條件、方式、靈敏度等情況，并簽署知情同意書，由專業(yè)人員采集新生兒足跟末梢血，制成含有三個直徑大于8mm血斑的干血片，血斑上血液需要滲透均勻。血片需在常溫條件下自然晾干，避免紫外照射，并用自封袋獨(dú)立包裝，檢測之前放4℃保存。

1.2.2 遺傳性耳聾基因檢測

（1）核酸提取

采用打孔器在干血片上打取1個直徑為6mm的血片置于1.5ml離心管中，采用干血斑核酸提取試劑盒(產(chǎn)品編號：DP334，成都博奧晶芯生物科技有限公司)進(jìn)行核酸提取，具體操作參照《干血斑基因組DNA提取標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（十五項(xiàng)耳聾）》。采用賽默飛公司的Nanodrop對提取的DNA進(jìn)行濃度測定，被檢基因組DNA需滿足濃度為3-25ng/μL，OD260/OD280為1.8-2.0。

（2）耳聾基因檢測

采用十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（微陣列芯片法，產(chǎn)品貨號：30068，成都博奧晶芯生物科技有限公司），對4個常見遺傳性耳聾基因的15個突變熱點(diǎn)進(jìn)行芯片檢測，包括GJB2基因（c.35 del G、c.176 del 16、c.235 del C和c.299_300 del AT）、SLC26A4基因（c.2168 A>G、c.1174 A>T、c.1226 G>A、c.1229 C>T、c.1975 G>C 、c.2027 T>A、c.1707+5 G>A和 c.919-2 A>G）、GJB3基因（c.538C＞T）和MT-RNR1（m.1555A＞G、m.1494C＞T）。本方法以提取的人類基因組DNA為模板，采用帶有Tag標(biāo)簽序列的基因位點(diǎn)特異性引物對檢測位點(diǎn)所在基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和熒光生物素標(biāo)記，再經(jīng)過磁珠純化、堿變性，然后與帶有檢測位點(diǎn)標(biāo)簽序列的通用基因芯片進(jìn)行雜交，再對芯片洗滌，最后通過對芯片進(jìn)行掃描和軟件結(jié)果判讀獲取檢測結(jié)果。主要用到的儀器有：PCR儀（S1000，Bio-Rad），芯片洗干儀（晶芯?SlideWasherTM 洗干儀，博奧生物集團(tuán)有限公司），晶芯?微陣列芯片掃描儀（LuxScan 10K/B，博奧生物集團(tuán)有限公司），具體操作參照《晶芯?十五項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測盒（微陣列芯片法）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，漢族與回族新生兒遺傳性耳聾基因突變檢出率組間比較采用χ2檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4個常見遺傳性耳聾基因突變總體檢測結(jié)果

960例聽力初篩、復(fù)篩均未通過新生兒中，102例新生兒檢出常見遺傳性耳聾基因熱點(diǎn)位點(diǎn)突變，檢出率為10.63%（102/960），其中攜帶GJB2基因突變61例，檢出率6.35%（61/960），包括純合突變或復(fù)合雜合突變10例，檢出率1.04%（10/960），雜合突變48例,檢出率5.00%（48/960）；SLC26A4基因突變31例，檢出率3.23%（31/960），包括純合突變6例，檢出率0.63%（6/960），雜合突變25例，檢出率2.60%（25/960）；GJB3基因雜合突變4例，檢出率0.42%（4/960）；MT-RNR1均質(zhì)突變1例，檢出率0.10%（1/960）；雙基因突變5例，檢出率0.52%（5/960），包括GJB2基因復(fù)合雜合以及線粒體異質(zhì)突變1例（見表1）。

表1 102例檢出耳聾基因突變的基因型分布Table 1 The genotype of 102 positively detected newborns

2.2 4個常見遺傳性耳聾基因突變在回、漢族中的檢測結(jié)果

960例聽力篩查未通過新生兒中，漢族600例，檢出4個常見遺傳性耳聾基因突變59例，總檢出率9.83%（59/600）；回族342例，檢出4個常見遺傳性耳聾基因突變42例，總檢出率12.28%（42/342），其他民族（滿族、蒙古族）18例，檢出4個常見遺傳性耳聾基因突變1例，總檢出率5.56%（1/18），由于寧夏地區(qū)滿族、蒙古族人群較少，本研究不對其檢測結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)分析。漢族與回族的遺傳性耳聾基因突變檢出率分別是9.83%、12.28%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;GJB2基因在漢族、回族新生兒中的檢出率分別是4.83%、9.06%，回族高于漢族，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.53，P<0.05）（見表2）。

表2 回、漢族中4個常見遺傳性耳聾基因突變檢測結(jié)果Table 2 Detection results of 4 common genetic mutations of deafness Hui and Han nationalities

2.3 4個常見耳聾基因突變位點(diǎn)在回、漢族中分布特點(diǎn)

在聽力篩查未通過的600名漢族新生兒中，2例（0.33%）攜帶GJB2:c.235delC純合突變，1例（0.17%）攜帶GJB2:c.176del16/c.235delC復(fù)合雜合突變，19例（3.17%）攜帶GJB2:c.235delC單雜合突變，6例（1.00%）攜帶GJB2:c.299delAT單雜合突變；4例（0.67%）攜帶SLC26A4:c.919-2A>G純合突變，1例（0.17%）攜帶SLC26A4:c.1174A>T純合突變，10例（1.67%）攜帶SLC26A4:c.919-2A>G單雜合突變；3例（0.50%）攜帶SLC26A4:c.2168A>G單雜合突變，4例（0.67%）新生兒攜帶GJB3:c.538C>T雜合突變，5例（0.83%）攜帶雙基因突變。

表3 回、漢族中4個常見遺傳性耳聾基因突變位點(diǎn)分布Table 3 Distribution of 4 common genetic deafness gene mutation sites in Hui and Han nationalities

在聽力篩查未通過的342例回族新生兒中，4例（1.17%）攜帶GJB2:c.235delC純合突變，1例（1.17%）攜帶GJB2:c.299delAT純合突變，2例（0.58%）攜帶GJB2:c.235delC/c.299delAT復(fù)合雜合突變，14例（4.09%）攜帶GJB2:c.235delC單雜合突變，6例（1.75%）攜帶GJB2:c.299delAT單雜合突變；1例（0.29%）攜帶SLC26A4:c.919-2A>G純合突變，6例（1.75%）攜帶SLC26A4:c.919-2A>G單雜合突變；1例（0.29%）攜帶SLC26A4:c.2168A>G單雜合突變，1例（0.29%）新生兒攜帶MT-RNR1：m.1555A>G均質(zhì)突變。

3 討論

耳聾是一種嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的出生缺陷，也是臨床上最常見的遺傳性疾病之一。我國每年新增6-8萬耳聾患兒，其中60%左右是由于遺傳因素導(dǎo)致，GJB2、SLC26A4、MT-RNR1、GJB3是我國常見致聾基因，這4個基因?qū)е碌亩@占所有遺傳性耳聾的70%左右[4]，因此，通過開展常見耳聾基因檢測以明確分子病因，對于耳聾的預(yù)防至關(guān)重要。

研究表明，北京朝陽區(qū)以及山東菏澤聽力復(fù)篩未通過的新生兒中，4個常見耳聾基因檢出率分別為21.91%[5]、6.85%[6]，本研究發(fā)現(xiàn) 4個常見致聾基因15個熱點(diǎn)突變位點(diǎn)在960名聽力篩查未通過新生兒中的總體檢出率為10.63%，與文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)不一致，可能與聽力篩查手段、篩查人數(shù)、篩查基因突變位點(diǎn)數(shù)量有關(guān)，也不能排除耳聾基因突變位點(diǎn)存在民族與地域差異，此外，部分新生兒可能由于胎脂或羊水堵塞外耳道導(dǎo)致聽力篩查“假陽性”導(dǎo)致耳聾基因檢出率差異較大，需進(jìn)一步研究。本研究中，GJB2、SLC26A4、MT-RNR1、GJB3的檢出率分別為6.35%、3.23%、0.42%、0.10%，主要以GJB2基因c.235delC突變?yōu)橹?，其次是SLC26A4基因c.919-2A>G突變?yōu)橹?，與文獻(xiàn)報道一致[6,7]。本研究發(fā)現(xiàn)61例新生兒攜帶GJB2基因突變，其中純合突變或復(fù)合雜合突變10例，檢出率1.04%（10/960），雜合突變48例,檢出率5.00%（48/960）；SLC26A4基因突變31例，檢出率3.23%（31/960，包括純合突變6例，檢出率0.63%（6/960），雜合突變25例，檢出率2.60%（25/960），研究表明GJB2、SLC26A4基因突變的患者病變部位主要在耳蝸，采用人工耳蝸植入術(shù)的預(yù)后及康復(fù)效果較好[8]，因此，建議盡快對檢測發(fā)現(xiàn)的純合突變或復(fù)合雜合突變新生兒進(jìn)行聽力學(xué)診斷，并采用適當(dāng)?shù)闹委煾深A(yù)手段避免影響語言發(fā)育障礙。研究表明，SLC26A4基因上迄今為止已發(fā)現(xiàn)170多種以上的突變與大前庭導(dǎo)水管綜合癥密切相關(guān)[9]，但單雜合突變出現(xiàn)耳聾的概率與正常人一致[3]，GJB2基因中也已經(jīng)鑒定了100多種不同的致病突變[http://davinci.crg.es/deafness/]，且不同突變類型可能出現(xiàn)不同聽力表型，因此為進(jìn)一步預(yù)測本研究發(fā)現(xiàn)的73例雜合突變（GJB2基因雜合突變48例、SLC26A4基因雜合突變25例）新生兒的未來聽力狀況并為患者提供精準(zhǔn)的遺傳咨詢指導(dǎo)，建議對雜合突變新生兒進(jìn)行相應(yīng)基因全序列測序。本研究發(fā)現(xiàn)4例新生攜帶GJB3基因突變、1例新生兒攜帶線粒體MT-RNR1:m.1555 A>G均質(zhì)突變，GJB3基因突變與顯性遺傳高頻聽力下降有關(guān)，建議對新生兒進(jìn)行聽力診斷以及基因突變家系分析，明確致聾原因并進(jìn)一步進(jìn)行聽力學(xué)干預(yù)；線粒體MT-RNR1基因突變患者對氨基糖甙類抗生素高度敏感，可能因攝入此類藥物引起永久性耳聾，建議詳細(xì)了解母親孕期用藥史，以明確孩子致聾原因，并采用聽力學(xué)干預(yù)手段對孩子進(jìn)行及時干預(yù)治療。

研究表明，不同地區(qū)、不同種族人群攜帶的耳聾基因熱點(diǎn)突變存在差異[10]，本研究發(fā)現(xiàn)，寧夏地區(qū)漢族、回族中4個常見遺傳性耳聾基因總檢出率分別為9.83%、12.28%，回族突變率高于漢族，與文獻(xiàn)報道一致[11]，但漢族、回族間耳聾基因檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與篩查樣本量有關(guān)，經(jīng)進(jìn)一步研究。本研究中，GJB2基因在回族中的檢出率顯著高于漢族，與文獻(xiàn)報道一致[11]，說明寧夏地區(qū)常見耳聾基因突變具有其獨(dú)特的民族特點(diǎn)，本研究結(jié)果能進(jìn)一步指導(dǎo)回族人群耳聾防治工作。

本研究中，漢族與回族人群GJB2基因突變均以c.235delC雜合突變?yōu)橹?，其次c.299delAT雜合突變，與文獻(xiàn)報道一致[12]，漢族新生兒中未檢出GJB2基因c.35delG突變位點(diǎn)，回族新生兒中檢出2例，可能是由于回族中有較大比例的高加索人種的混雜所致[13-14]。本研究中，SLC26A4基因在回族和漢族新生兒中均以c.919-2 A>G突變位點(diǎn)為主，與文獻(xiàn)報道一致[15]，本研究對SLC26A4基因上共8個熱點(diǎn)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在漢族和回族新生兒中均未檢測到c.2027T>A、c.IVS15+5G＞A位點(diǎn)，漢族新生兒中未檢測出c.1226G>A，回族新生兒中未檢測出c.1975G>C、c.1174A>T，可能與檢測樣本量有關(guān)。本研究中，漢族人群檢出GJB3:c.538C>T雜合突變4例以及5例雙基因雜合突變，回族人群未檢出該類型突變，可能種族或檢測人數(shù)有關(guān)，需進(jìn)一步分析。

綜上所述，寧夏地區(qū)新生兒聽力篩查未通過新生兒中，GJB2基因突變檢出率最高，其次是SLC26A4基因，且GJB2基因在回族新生兒中的突變檢出率顯著高于漢族，漢、回民族新生兒中均以GJB2基因c.235delC以及SLC26A4基因c.919-2A>G突變?yōu)橹?，四個常見耳聾基因其他突變位點(diǎn)也呈現(xiàn)出一定的地域與民族特點(diǎn)。本研究結(jié)果能在一定程度上指導(dǎo)該地區(qū)耳聾基因診斷和遺傳咨詢，為政府制定有效的針對性的防聾治聾的政策提供依據(jù)。