付旭陽(yáng)，孫健淇，郭 裕，楊淋斐，劉澤儒，賈曉山，孫 玲，崔麗霞，石瑞麗，5，6

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院；3.包頭醫(yī)學(xué)院烏蘭察布臨床醫(yī)學(xué)院；4.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院圖書館；5.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所；6.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

腦卒中是由腦血管梗阻或腦血管破裂導(dǎo)致的一系列腦損傷疾病，根據(jù)發(fā)病原因分為缺血性卒中及出血性卒中，其中缺血性卒中占64.9 %[1]。由于缺血性卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及的靶點(diǎn)眾多，導(dǎo)致以單一靶點(diǎn)為目標(biāo)的治療手段難以達(dá)到理想的療效。近年來，隨著組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的組學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)被應(yīng)用于數(shù)據(jù)挖掘，從眾多組學(xué)數(shù)據(jù)中篩選與腦卒中發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，可能為后續(xù)抗腦缺血新藥開發(fā)提供重要依據(jù)。瓜子金皂苷己(Polygalasaponin F, PGSF)是從瓜子金中分離得到的齊墩果烷型三萜皂苷單體，既往研究表明，PGSF具有神經(jīng)保護(hù)作用，該化合物可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn) PGSF 能夠在整體水平對(duì)抗大鼠腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)，但其作用機(jī)制不夠清晰。本研究擬使用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus, GEO)篩選CIRI中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并通過分子對(duì)接工具計(jì)算PGSF與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能力，從而預(yù)測(cè)PGSF在治療CIRI中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以“Cerebral ischemia-reperfusion injury”為檢索詞，下載GSE97537大鼠腦組織芯片數(shù)據(jù)集矩陣文件。該數(shù)據(jù)集內(nèi)包含假手術(shù)對(duì)照組，和大鼠中動(dòng)脈梗死模型組的數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1差異基因篩選及可視化 本研究的基因差異表達(dá)分析應(yīng)用R語(yǔ)言limma包進(jìn)行。下載R語(yǔ)言limma包，將1.1中下載得到的Count數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語(yǔ)言，以丨LogFC丨≥1與P<0.05 為條件進(jìn)行差異表達(dá)靶點(diǎn)篩選。應(yīng)用R語(yǔ)言limma包繪制火山圖，并對(duì)符合丨LogFC丨≥1與P<0.05條件的差異表達(dá)基因繪制熱圖。

1.2.2蛋白-蛋白相互作用分析 腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，存在多種病理過程，而這些病理過程由多種不同蛋白參與介導(dǎo)。蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction, PPI)分析能夠挖掘多個(gè)蛋白間復(fù)雜的作用關(guān)系，從而發(fā)現(xiàn)藥物發(fā)揮作用的間接靶點(diǎn)。為了探究差異靶點(diǎn)在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用，本研究應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，設(shè)定“Multiple proteins”模式，將差異表達(dá)靶點(diǎn)導(dǎo)入，下載分析結(jié)果。將上述PPI分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)并應(yīng)用CytoHubba插件根據(jù)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)篩選出其中的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。

1.2.3分子對(duì)接 為了驗(yàn)證蛋白和PGSF的結(jié)合親和力，利用AutoDock Tools軟件(Version 1.5.6)進(jìn)行蛋白和化合物的修飾，利用AutoDock Vina軟件(Version 1.1.2)[2]進(jìn)行分子對(duì)接，得到對(duì)接分?jǐn)?shù)結(jié)果，之后使用LigPlot軟件[3]進(jìn)行2D可視化處理。

2 結(jié)果

2.1差異靶點(diǎn)篩選 應(yīng)用R語(yǔ)言plot數(shù)據(jù)包對(duì)GSE97537芯片數(shù)據(jù)表達(dá)矩陣進(jìn)行差異分析，繪制火山圖(圖1)。篩選得到125個(gè)上調(diào)基因，12個(gè)下調(diào)基因?；贑ount微陣列數(shù)據(jù)繪制137個(gè)差異表達(dá)的靶點(diǎn)熱圖(圖2)，總體數(shù)據(jù)取Log10，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

圖1 差異基因火山圖

2.2蛋白-蛋白相互作用 為明確靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，本研究將137個(gè)差異表達(dá)的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得蛋白-蛋白相互作用關(guān)系。應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖 3)，靶點(diǎn)大小由自由度決定，上調(diào)靶點(diǎn)為紅色，下調(diào)靶點(diǎn)為藍(lán)色。應(yīng)用CytoHubba根據(jù)靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)篩選靶點(diǎn)，排名前五的靶點(diǎn)為：白細(xì)胞介素6(Interleukin-6, IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metallopeptidase 9, MMP9)、CC型趨化因子配體2(C-C motif chemokine 2, CCL2)、細(xì)胞間黏附分子1(Intercellular adhesion molecule, ICAM1)和前列腺素G/H合酶2(Prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)，均為上調(diào)靶點(diǎn)。

圖2 差異基因熱圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3分子對(duì)接 分子對(duì)接中配體與受體構(gòu)象結(jié)合能越低，結(jié)合越穩(wěn)定。將關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白和化合物PGSF進(jìn)行分子對(duì)接(圖 4)，結(jié)果顯示PGSF與PTGS2、CCL2等靶點(diǎn)結(jié)合能較高(表 1)，表明PGSF與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白有較強(qiáng)的親和性，PGSF可能通過與其結(jié)合發(fā)揮抗腦缺血作用。

圖4 PGSF和關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用二維圖

表1 瓜子金皂苷己與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合得分

3 討論

腦卒中是由腦血管供血絕對(duì)或相對(duì)不足導(dǎo)致的復(fù)雜腦損傷疾病。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，腦組織中存在興奮性毒性、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血腦屏障破壞、炎癥損傷等。由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致目前尚無(wú)能夠完全治愈缺血性腦卒中的理想藥物。本研究借助生物信息學(xué)方法，對(duì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選得到上調(diào)靶點(diǎn)125個(gè)，下調(diào)靶點(diǎn)12個(gè)。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，確定了IL-6、MMP9、CCL2、ICAM1和PTGS2靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，可應(yīng)用于疾病的診斷或治療中。

MMP9作為MMPs家族重要成員，可通過降解基底膜成分，破壞內(nèi)皮的屏障功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，炎癥反應(yīng)增加MMP9表達(dá)從而破壞了血腦屏障，加重腦水腫[4]。在發(fā)病早期，腦水腫程度是影響腦卒中死亡率的重要因素。腦水腫根據(jù)病因分為血管源性水腫及細(xì)胞毒性水腫，MMP9是血管源性水腫形成的重要成因之一，該蛋白通過上述分子機(jī)制促進(jìn)體液進(jìn)入腦組織，因此MMP9可作為治療腦水腫、降低CIRI死亡率的靶點(diǎn)。

腦缺血后的炎癥反應(yīng)是重要的病理過程，介導(dǎo)神經(jīng)元的早期損傷及后期修復(fù)作用。炎癥反應(yīng)是由促炎性前列腺素、細(xì)胞因子和趨化因子等因素驅(qū)動(dòng)，這些因素趨化免疫細(xì)胞浸入腦組織，并引起急性期反應(yīng)物的釋放[5]。PTGS2和IL-6作為常見的炎性因子，在缺氧腦組織中大量表達(dá)，目前已有大量研究證明以PTGS2和IL-6為治療靶點(diǎn)可明顯緩解腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷[6,7]。此外，炎性因子ICAM-1介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞黏附在腦卒中的病理生理中起重要作用[8]。在敲除ICAM-1基因小鼠的實(shí)驗(yàn)中，白細(xì)胞黏附明顯減少，同時(shí)可改善腦血流量以及腦缺血和再灌注后的死亡率[9]。臨床研究表明，大腦中的ICAM-1表達(dá)在缺血性卒中后顯著升高，可溶性ICAM-1和腦脊液ICAM-1的循環(huán)水平同樣增加，且血清中ICAM-1表達(dá)水平與神經(jīng)功能損傷程度相關(guān)[10,11]。所有上述研究表明，ICAM-1可能參與了缺血性中風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。

CCL2是一種趨化因子，其受體是CC型趨化因子受體2(C-C chemokine receptor type 2, CCR2)。在腦組織中，CCL2生理狀態(tài)下表達(dá)量極低，在腦缺血發(fā)生后，其表達(dá)量明顯增加。CCL2不僅具有趨化單核細(xì)胞作用，還能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞從而加重炎癥反應(yīng)。在敲除CCL2的實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物腦梗死體積明顯降低，證明降低CCL2表達(dá)可作為治療CIRI的途徑之一[12]。

瓜子金皂苷己是由遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物瓜子金中提取的齊墩果烷型三萜皂苷類化合物。在神經(jīng)保護(hù)方面，PGSF可抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型中IL-1β的表達(dá)，主要的作用機(jī)制與下調(diào)NLRP3炎性小體及半胱氨酸蛋白酶11的激活相關(guān)[13]。PGSF還可以通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2/Bax)表達(dá)，起到抗凋亡作用[14]。這些實(shí)驗(yàn)證明PGSF在體外實(shí)驗(yàn)中具有良好的抑制神經(jīng)炎癥作用，但在整體水平的抗炎作用目前尚未研究。本研究應(yīng)用分子對(duì)接驗(yàn)證了PGSF與IL-6、MMP9、CCL2、ICAM1、PTGS2有良好的結(jié)合能力，預(yù)測(cè)PGSF可能通過CCL2抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低炎性因子IL-6、ICAM1、PTGS2表達(dá)，從而發(fā)揮良好的抗炎作用；此外PGSF可能通過降低MMP9抑制血腦屏障破壞，緩解腦水腫程度。本研究為PGSF發(fā)揮抗炎、神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，為后續(xù)的研究提供了理論線索。