徐菁岐，莊科勤，張 涵，盧殿杰，孟雨晴，付連軍，沙萬(wàn)里，董文龍

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林吉林 132109)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogen)是一種重要的條件致病菌，又名化膿放線(xiàn)桿菌、化膿棒狀菌，屬于隱秘桿菌屬[1]。該菌常分布于牛、羊、豬等動(dòng)物的黏膜上，可引起乳房炎、肝周炎、子宮炎等，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，且對(duì)人也有一定的致病性[2-4]。有關(guān)研究表明，其主要毒力基因有溶血素基因(plo)、神經(jīng)氨酸酶基因(nanH與nanP)以及膠原結(jié)合蛋白基因(cpbA)[5]。近年來(lái)，化膿隱秘桿菌在我國(guó)上海、廣東、四川、天津等地均有報(bào)道，該細(xì)菌病范圍不斷擴(kuò)大，并且在日本、約旦等國(guó)家均有致病性方面的研究[6-7]。當(dāng)前，青霉素、氨基糖苷類(lèi)藥物、桿菌肽等抗生素是臨床治療的首選藥物，均能夠?qū)撾[秘桿菌有殺滅作用[8]。但是由于抗菌藥物的長(zhǎng)期使用，容易導(dǎo)致化膿隱秘桿菌耐藥性及多重耐藥性的發(fā)生而影響治療效果。本文綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外化膿隱秘桿菌的耐藥情況，并對(duì)化膿隱秘桿菌的耐藥機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)，以期為臨床用藥提供科學(xué)參考。

1 化膿隱秘桿菌對(duì)6類(lèi)常用抗生素以及抗菌藥物的耐藥性及耐藥機(jī)制

目前，研究人員對(duì)化膿隱秘桿菌進(jìn)行耐藥試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、四環(huán)素類(lèi)抗生素、磺胺類(lèi)藥物、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素以及酰氨醇類(lèi)抗生素有耐藥性?；撾[秘桿菌的耐藥性與染色體基因有關(guān)，同時(shí)也可通過(guò)質(zhì)粒、整合子-基因盒系統(tǒng)等可移動(dòng)元件從外界得到耐藥基因，從而使化膿隱秘桿菌產(chǎn)生耐藥性。

1.1 對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥性及耐藥機(jī)制

氨基糖苷類(lèi)抗生素是臨床上常用的抗生素之一，對(duì)化膿隱秘桿菌有抑菌效果。但隨著氨基糖苷類(lèi)抗生素的不合理使用，細(xì)菌的耐藥問(wèn)題也隨之出現(xiàn)[9]。2017年，Rezanejad M等[10]在患有乳腺炎和子宮炎的產(chǎn)后奶牛中共分離得到73株化膿隱秘桿菌并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)慶大霉素產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，且分離于奶牛乳腺炎的菌株對(duì)鏈霉素具有較高耐藥率，對(duì)不同臨床表現(xiàn)的化膿隱秘桿菌病的防治提供了數(shù)據(jù)支持。研究證明，在該菌中檢出率較高的Ⅰ類(lèi)整合子中的基因盒存在5種可以誘導(dǎo)化膿隱秘桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥的基因aadA1、aadA2、aadA5、aacA4與aad(6 ')-Ib，并且發(fā)現(xiàn)rbsB表達(dá)形成的核糖體結(jié)合蛋白(ribosomal protein，RbsB)可以通過(guò)影響生物膜形成等生理過(guò)程導(dǎo)致化膿隱秘桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥[5]。另有研究表明，Kwiecien E等[11]對(duì)在分離株中發(fā)現(xiàn)的Ⅰ類(lèi)整合子基因盒進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)aadA9、aadA11兩種基因，分別編碼了AadA9和AadA11，這兩種蛋白介導(dǎo)化膿隱秘桿菌對(duì)鏈霉素和新霉素的耐藥性，同時(shí)檢測(cè)到其他未由基因盒攜帶的氨基糖苷類(lèi)抗性基因，如strA-strB和aph(3')-Ⅲa。

1.2 對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的耐藥性及耐藥機(jī)制

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素通過(guò)降低病原50S核糖體中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，從而阻止其分裂，并影響胞內(nèi)代謝反應(yīng)的進(jìn)行，達(dá)到抑菌作用。Zastempowska E等[12]對(duì)從患有乳腺炎的奶牛分離得到的89株化膿隱秘桿菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示其中1株菌株對(duì)紅霉素有耐藥性，其MIC值≥256 mg/mL，具有高耐藥性，同時(shí)在五個(gè)分離株都檢測(cè)到了耐藥基因ermB。2019年，Galan-Relano N等[13]對(duì)從西班牙采集到的96株化膿隱秘桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明有22%的分離株對(duì)紅霉素表現(xiàn)為不同程度的耐藥。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有化膿隱秘桿菌對(duì)紅霉素類(lèi)衍生物及乙酰螺旋霉素等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素具有多重耐藥性。例如，劉耀川等[14]對(duì)化膿隱秘桿菌分離株的相關(guān)耐藥基因msrA、mefA、ermX和ermB進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并分析其核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素耐藥的化膿隱秘桿菌中攜帶msrA(72.7%)及mefA(18.2%)。Tamai A T等[15]在從產(chǎn)后母牛分離到的65株化膿隱秘桿菌中,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因ermB和ermX的檢出率分別為27.7%和38.5 %。

1.3 對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的耐藥性及耐藥機(jī)制

Zhang D X等[16]對(duì)可能存在于化膿隱秘桿菌中的耐藥基因tetK、tetO、tetL以及tetM進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并研究其在32株化膿隱秘桿菌分離株中的分布狀況，發(fā)現(xiàn)在所有分離株中都攜帶tetK，其在染色體和質(zhì)粒中存在率頗高，分別為53.1%和46.9%；在分離株中僅發(fā)現(xiàn)低量tetT(在染色體和質(zhì)粒的存在率分別為9.4%和12%)和tetM(在染色體和質(zhì)粒的存在率分別為12.5%和9.4%)；在所有分離株中未發(fā)現(xiàn)tetO以及otrA。2016年，Rzewuska M等[17]進(jìn)行相關(guān)研究表明化膿隱秘桿菌中的毒力因子與耐藥性存在一定的相關(guān)性，nanP可以使分離株對(duì)四環(huán)素的耐藥性降低3倍。Kwiecien E等[18]對(duì)用四環(huán)素耐藥基因rpp的通用引物擴(kuò)增得到的15個(gè)基因片段進(jìn)行檢測(cè)，分析結(jié)果表明，所有擴(kuò)增子都被識(shí)別為tet，該基因可能通過(guò)影響復(fù)制來(lái)介導(dǎo)耐藥。而在通過(guò)對(duì)所有分離株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)不同分離株攜帶不同的tetW基因，如從豬上分離得到的化膿隱秘桿菌攜帶4種不同的tetW變體(包括tetW-1、tetW-2、tetW-3和tetW-4)，而畜用牛和歐洲野牛的分離株中只攜帶tetW-3，對(duì)豬源以及牛源化膿隱秘桿菌的耐藥機(jī)制的區(qū)分提供了啟示。

1.4 對(duì)磺胺類(lèi)抗菌藥物的耐藥性及耐藥機(jī)制

磺胺類(lèi)藥物可與對(duì)氨基苯甲酸(PABA)競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶，阻礙二氫葉酸的合成，從而影響核酸的生成，抑制化膿隱秘桿菌的生長(zhǎng)繁殖。2018年，Iradi A T等[15]對(duì)從德黑蘭的產(chǎn)后奶牛分離得到的16株化膿隱秘桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)甲氧芐啶-磺胺異惡唑(trimothoprim-surfacethoxazde，TMP-SMX)有高耐藥性(72.3%)。張素輝等[19]對(duì)在山羊分離得到的化膿隱秘桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明其對(duì)磺胺異惡唑表現(xiàn)出明顯的耐藥性。2019年，Galan-Relano N等[13]對(duì)從西班牙采集到的96株化膿隱秘桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明有89%的分離株對(duì)甲氧芐啶-磺胺甲基異惡唑不敏感，耐藥現(xiàn)象較為普遍。Zhao K L等[20]在16株化膿隱秘桿菌檢測(cè)到有部分菌株攜帶磺胺類(lèi)耐藥基因dfr2a。

1.5 對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性及耐藥機(jī)制

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素可以抑制胞壁轉(zhuǎn)肽酶，使細(xì)胞壁合成障礙，也可以增加細(xì)胞壁自溶酶活性，產(chǎn)生自溶或胞壁質(zhì)水解，是用于治療化膿隱秘桿菌病最常見(jiàn)、最廣泛的抗生素之一。2013年，劉耀川等[21]對(duì)32株化膿隱秘桿菌進(jìn)行了β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥性研究，所有分離株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥率從高到低依次為頭孢噻夫(75.0%)、氨芐西林(71.9%)、青霉素(68.7%)、苯唑西林(56.2%)以及阿莫西林(53.1%)。2017年，Rezanejad M等[10]研究表明，在取樣的患有子宮炎和乳腺炎的奶牛中分離得到的菌株對(duì)青霉素和阿莫西林都有嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象。Liu M C等[22]對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜進(jìn)行取樣并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明大約有37.5%至71.9%的化膿隱秘桿菌分離株對(duì)頭孢菌素類(lèi)抗生素有耐藥性。Zhao K L等[20]在16株化膿隱秘桿菌檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaP1(28.6%)。Santos T M A等[23]對(duì)從子宮液分離得到的化膿隱秘桿菌進(jìn)行藥物敏感性分析，發(fā)現(xiàn)有至少50%的分離株表現(xiàn)出對(duì)阿莫西林的耐藥性。

1.6 對(duì)酰氨醇類(lèi)抗生素的耐藥性及耐藥機(jī)制

氯霉素可作用于細(xì)菌核糖核蛋白體的50S亞基，阻撓蛋白質(zhì)的合成，屬抑菌性廣譜抗生素。董文龍等[24]對(duì)我國(guó)吉林省8株豬源化膿隱秘桿菌進(jìn)行MIC藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示有2株對(duì)氯霉素耐藥。Santos T M A等[23]對(duì)從子宮分離得到的化膿隱秘桿菌進(jìn)行MIC藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明所有分離株表現(xiàn)出對(duì)氯霉素不同程度的耐藥。Liu M C等[22]對(duì)化膿隱秘桿菌中的Ⅰ類(lèi)整合子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中還有關(guān)于引起對(duì)氯霉素耐藥的基因cmlA6。

2 其他耐藥機(jī)制

在化膿隱秘桿菌抗生素耐藥性的傳播過(guò)程中，多種可移動(dòng)元件發(fā)揮了重要作用。Dong W L等[25]發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)化膿隱秘桿菌耐藥的基因島TGI1，此基因島攜帶的1類(lèi)整合子與化膿隱秘桿菌的多重耐藥有關(guān)。Zhao K L等[20]通過(guò)PCR擴(kuò)增得到Ⅰ類(lèi)整合子內(nèi)部攜帶的耐藥基因盒，其中包括編碼氨基糖苷類(lèi)耐藥基因(aacC、aadA1、aadA2)、編碼β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因(blaP1)、編碼磺胺類(lèi)耐藥基因(dfr2a)以及未知功能的基因(orfE)，表明Ⅰ類(lèi)整合子的存在與化膿隱秘桿菌耐藥性普遍一致，且整合子在其耐藥性的傳播中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)，插入序列(insetion sequence，IS)還可以獲取外源性耐藥基因，如四環(huán)素耐藥基因tet(33)可以通過(guò)IS6100水平轉(zhuǎn)移獲取[26]。韓雪在化膿隱秘桿菌分離株中檢測(cè)出tnpA(41.18%)、IS26(61.76%)和tnp513(17.65%)3種轉(zhuǎn)座子，且發(fā)現(xiàn)隨著化膿隱秘桿菌耐藥譜的擴(kuò)大，轉(zhuǎn)座子tnpA的陽(yáng)性率亦增加，說(shuō)明化膿隱秘桿菌耐藥性產(chǎn)生或增加可能與轉(zhuǎn)座子tnpA存在密切關(guān)系[27]。Duse A等[28]對(duì)從瑞典乳腺炎奶牛分離得到的化膿隱秘桿菌進(jìn)行研究，其單峰MIC表明，該菌通常不會(huì)發(fā)生獲得性耐藥，說(shuō)明化膿隱秘桿菌的耐藥機(jī)制存在地區(qū)性差異。

3 展望

化膿隱秘桿菌的耐藥性產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜多樣，其與染色體基因有關(guān)，同時(shí)也通過(guò)質(zhì)粒、整合子-基因盒系統(tǒng)等可移動(dòng)元件從外界獲得耐藥基因，從而使化膿隱秘桿菌產(chǎn)生耐藥性。其中對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、四環(huán)素類(lèi)抗生素、磺胺類(lèi)抗生素、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素以及酰氨醇類(lèi)抗生素耐藥現(xiàn)象最為嚴(yán)重。

化膿隱秘桿菌是牛呼吸道綜合征和壁纖維蛋白性腹膜炎(Parietal fibrinous peritonitis，PFP)的主要致病菌之一，同時(shí)可以感染豬、羊、林麝等重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，并且能夠感染人與伴侶動(dòng)物[29-31]?，F(xiàn)有抗生素品種有限，長(zhǎng)期大量或不合理使用抗菌藥物是造成不同種類(lèi)抗生素的耐藥性上升，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部出臺(tái)了各項(xiàng)政策，如何進(jìn)行重要病原菌的無(wú)抗替抗防治成為科研工作者的研究重點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，能夠侵染化膿隱秘桿菌的噬菌體vB-ApyS-JF1，該噬菌體適用于化膿隱秘桿菌的防控[32]。高翔對(duì)木犀草素消減化膿隱秘桿菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素耐藥性的機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)木犀草素對(duì)耐四環(huán)素類(lèi)抗生素的化膿隱秘桿菌仍具有良好的體外抗菌活性，亞抑菌濃度(1/2 MIC)木犀草素能夠消減化膿隱秘桿菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的耐藥性，同時(shí)木犀草素還可以通過(guò)抑制MsrA外排泵增加對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的敏感性[33-34]。徐登峰等[35]進(jìn)行了化膿隱秘桿菌候選抗原的免疫保護(hù)效果研究，確定免疫鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體重組SBP的小鼠能抵御致死劑量的化膿隱秘桿菌攻擊，表明該SBP是免疫原性良好的保護(hù)性抗原，可用于化膿隱秘桿菌亞單位疫苗的研發(fā)。Huang T等[36]研究出了以PLO聯(lián)合免疫白細(xì)胞介素(IL-1β)為基礎(chǔ)的DNA疫苗，用于增強(qiáng)易感動(dòng)物對(duì)化膿隱秘桿菌的免疫力。抗菌肽具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，希望可以更多的應(yīng)用到化膿隱秘桿菌病的防治[37]。

國(guó)內(nèi)對(duì)于化膿隱秘桿菌的各類(lèi)耐藥性相關(guān)基因研究并不多，因此，更加系統(tǒng)、全面地開(kāi)展化膿隱秘桿菌耐藥機(jī)制的研究，將對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展具有重要的意義。