張 蕊，于 丹，李 東，徐金彪，時 坤，2，李健明，2，宗 穎，2，曾范利，2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春 130118；2.吉林省梅花鹿高效養(yǎng)殖和產(chǎn)品開發(fā)技術工程研究中心，吉林長春 130118；3.長春市動物疫病預防控制中心，吉林長春 130061)

結核病(Tuberculosis，TB)是一種嚴重的人畜共患病[1]。從家畜到馴養(yǎng)野生動物，結核病的發(fā)病率居高不下，嚴重影響著畜牧業(yè)的發(fā)展[2]。而目前對于動物的有效治療手段也是以抗結核藥物聯(lián)合廣譜抗生素，并以不科學的藥物劑量治療患病家畜[3]。這也導致了結核分支桿菌獲得性耐藥，而耐藥結核分支桿菌也是目前結核病的主要致病菌[4]。長期的耐藥會誘發(fā)菌體的外排泵的改變，外排泵不僅維持菌體正常代謝，影響藥物對菌的致死性，同時，在菌體生長致病力等方面均有發(fā)現(xiàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)菌體外排泵家族主要有4大區(qū)域，即ABC家族、MFS家族、RND家族和SMR家族。本文將從結核分支桿菌耐藥現(xiàn)狀，結核分支桿菌外排泵與耐藥、外排泵抑制劑對耐藥結核病的治療等方面，通過外排泵結構功能及其相關的最新研究，闡述外排泵與耐藥的相關性。

1 結核分支桿菌耐藥現(xiàn)狀

結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)耐藥性的產(chǎn)生是目前治療結核病的一大障礙，世界衛(wèi)生組織(WHO)將耐藥類型分為單耐藥、耐多藥、多耐藥、廣泛耐藥和利福平耐藥5大類，并將耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)確定為對人類公共健康的主要威脅[6]。MDR-TB是由至少對異煙肼和利福平耐藥的Mtb引起的。據(jù)統(tǒng)計，2017年全球報告的55.8萬結核病例為利福平耐藥，其中82%為MDR-TB。目前，針對Mtb的感染與致病機理所研發(fā)的藥物包括一線藥物利福平、異煙肼、乙胺丁醇，吡嗪酰胺和鏈霉素以及二線藥物喹諾酮類等[7]。在一線藥物中，利福平、異煙肼和吡嗪酰胺具有殺菌作用，乙胺丁醇具有抑菌作用。臨床上用以上4種一線藥物治療藥物敏感性結核病，該方案治愈率達85%以上。盡管多種藥物在體外非常有效，但是需要長時間的藥物治療，而濫用或錯誤使用結核病藥物常常會導致菌株耐藥從而進一步混淆治療。有研究顯示，用藥時Mtb會引起自發(fā)的染色體突變，而不同藥物作用機理不同，從而引起的耐藥基因及變異率不同，在細菌復制期間，耐利福平或者異煙肼的概率高達1×108-9[8]。引起廣泛耐藥結核病(extensive drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的Mtb除了對異煙肼和利福平等一線藥物耐藥，對氟喹諾酮類等二線藥物同樣耐藥，因此在大多數(shù)情況下XDR-TB無法治愈[9]。除通過改變藥物靶標或前藥激活酶的自發(fā)性染色體突變實現(xiàn)耐藥外[10]，研究發(fā)現(xiàn)，在許多低水平抗性分離株中未發(fā)現(xiàn)這些突變，表明還可能涉及其他抗性機制，例如細胞壁提供的通透性屏障和外排系統(tǒng)活性的機制[11]。

2 結核分支桿菌外排泵與耐藥

現(xiàn)有研究顯示，耐藥基因突變并不能完全解釋分支桿菌耐藥機制，Mtb中存在藥物外排泵的表達可能是另一種重要的機制，并對細菌在巨噬細胞內(nèi)的存活也很重要，它可以使細胞內(nèi)的細菌免受酸化、有毒金屬積累和氮氧反應中間產(chǎn)物的影響[12]。在耐藥性的演變中發(fā)揮重要作用[13]。

外排在細菌中普遍存在，并負責原核和真核細胞的先天性和獲得性耐藥，是一種阻止藥物分子進入細菌細胞的主動外排機制[14]。Mtb中存在大量的藥物外排泵，并導致Mtb對許多抗結核藥物產(chǎn)生內(nèi)在耐藥性，如氟喹諾酮類、四環(huán)素類、氨基糖苷類等。多藥外排泵還可以排出多種化合物，如細菌代謝產(chǎn)物，植物產(chǎn)生的化合物，群體感應分子和毒力因子[15]。另一方面，許多證據(jù)表明外排泵在細菌中還具有生理功能，其表達受到各種環(huán)境和生理信號的嚴格調(diào)節(jié)，在細菌的新陳代謝、生理、營養(yǎng)物質(zhì)、毒素、廢物和信號分子的運輸中起著重要作用[15]。

研究表明MDR外排泵通過多種方式促進細菌對藥物的耐藥性:①對一類藥劑的固有耐藥性；②對特定藥劑的固有耐藥性；③外排泵過表達而產(chǎn)生的阻力。并根據(jù)氨基酸序列同源性和底物特異性，一般將這些外排泵分為5大類[16]，即ATP結合盒家族(ATP binding cassette，ABC)、主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、耐藥性結節(jié)化細胞分化分子家族(resistance nodulation cell division，RND)、小多重耐藥轉(zhuǎn)運分子家族(small multidrug resistance family，SMR)和多藥及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)。所有的外排泵家族均由質(zhì)粒或染色體編碼，具有不同的結構形態(tài)與底物特異性，其中ABC、MFS、SMR、RND家族已經(jīng)證實在Mtb中均存在。但RND家族多數(shù)存在于陰性菌中，在Mtb中較少[17]。

2.1 ATP結合盒家族外排轉(zhuǎn)運蛋白

ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白主要以ATP為能量進行底物的轉(zhuǎn)運，其成員是主要的活性轉(zhuǎn)運蛋白，并利用ATP水解來擠出細胞毒性化合物。編碼ABC轉(zhuǎn)運體的基因占Mtb基因組的2.5%。至少有37個完整或不完整ABC轉(zhuǎn)運體已經(jīng)在Mtb中被發(fā)現(xiàn)。目前，已經(jīng)證實ABC轉(zhuǎn)運蛋白與藥物耐受和病原菌的固有耐藥具有很大的關聯(lián)，并且負責氨基酸、糖類、金屬離子、陰離子等的運輸。氨基酸作為碳源和氮源，是細胞必不可少的組成部分，ATP結合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族發(fā)揮作用將促進Mtb對氨基酸的吸收，滿足生長過程中的代謝需要。他們在宿主和病原體之間的代謝中起著重要作用[18]。例如，Rv1280c-Rv1283c為寡肽轉(zhuǎn)運蛋白，其中Rv1281c的失活降低了細胞凋亡誘導能力和細胞因子IL-1b、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。Rv3666c-Rv3663c為二肽轉(zhuǎn)運蛋白。Flores-Valdez等報道了Rv3666c-Rv3662c轉(zhuǎn)運系統(tǒng)還參與并支持宿主體內(nèi)Mtb存活的細胞內(nèi)信號通路的調(diào)控。在Mtb的碳水化合物ABC輸入系統(tǒng)的評估表明，它有4個碳水化合物ABC轉(zhuǎn)運蛋白，即甘油磷酸膽堿的轉(zhuǎn)運Rv2832c-Rv2835c、海藻糖的轉(zhuǎn)運Rv1235-Rv1238、氨基糖轉(zhuǎn)運Rv2316-Rv2318和Rv2038c-Rv2041c蛋白[19]。其中Rv2038c-Rv2041c蛋白包含一種預測是會引入碳水化合物的糖結合脂蛋白(SBP)，但尚未確定其確切的底物特異性[20]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白參與Mtb中必需營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，將有望在營養(yǎng)物質(zhì)的運輸途徑中進行更多的研究，另外，ABC轉(zhuǎn)運蛋白中還存在許多有價值的潛在表位Rv0986-Rv0987、SugA-B-C和Rv2937[21]，這最終將揭示出治療這種破壞性疾病的新穎治療策略[18]。

2.2 主要易化子超家族外排轉(zhuǎn)運蛋白

MFS家族大多數(shù)成員為400個～600個氨基酸殘基，由兩種不同的蛋白結構域構成，即12碳和14碳跨膜結構，14碳跨膜結構由12碳跨膜結構與輸水中央環(huán)組成[22]?？蛇M行不同底物的轉(zhuǎn)運，比如藥物、有機陽離子和陰離子、糖等等[23]。用質(zhì)子原動力(proton motive force，PMF)作為能源對底物同向、單向和反向連接中進行操做，大部分蛋白仍未鑒定，但其中一些蛋白已被證明具有多藥物轉(zhuǎn)運蛋白的功能。隨后研究證明Rv1410c(p55)是一個射流泵，并對四環(huán)素和氨基糖苷類耐藥。其他參與多藥耐受的外排泵Rv0849、Rv1258c、Rv1877、Rv2459等也陸續(xù)被鑒定出來。Tap外排泵(Rv1258c)具有耐氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的能力。許多Mtb中MFS成員的轉(zhuǎn)運功能可在抗生素、化學試劑或金屬離子條件下上調(diào)，如Rv1877、Rv3239c和Rv3728對四環(huán)素轉(zhuǎn)運速率上調(diào)，Rv2846對異煙肼轉(zhuǎn)運速率上調(diào)，Rv2994和Rv0037c對纈氨霉素轉(zhuǎn)運速率上調(diào)，Rv0849對聯(lián)吡啶轉(zhuǎn)運速率上調(diào)，Rv0876c對ZnSO4轉(zhuǎn)運速率上調(diào)等[24]，其中MFS轉(zhuǎn)運蛋白Rv1258c和Rv0849還參與了耐多藥[25]。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來看，MFS家族轉(zhuǎn)運蛋白在多種藥物壓力下都會發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的變化，但是這些影響MFS轉(zhuǎn)運蛋白的抗菌物質(zhì)是否為其底物還有待進一步的驗證。

2.3 小多重耐藥轉(zhuǎn)運分子和耐藥性結節(jié)化細胞分化分子家族等外排轉(zhuǎn)運蛋白

SMR和RND家族是較小的家族，為次級運輸工具，通常由質(zhì)子動力供能。SMR轉(zhuǎn)運蛋白是獨立的最小的外排泵，具有100個～120個氨基酸和4個跨膜螺旋，它只有4個跨膜區(qū)，是H+偶聯(lián)外排泵，前3個跨膜區(qū)具有雙親性，含有許多保守的氨基酸殘基。這些殘基的側鏈與底物的疏水區(qū)直接作用來介導底物的跨膜轉(zhuǎn)運。RND外排泵起質(zhì)子/藥物反轉(zhuǎn)運蛋白的作用，主要存在于革蘭氏陰性細菌中，盡管它們也存在于革蘭氏陽性細菌[26]。與MFS相比，RND家族外排蛋白有更廣泛的外排底物，對Mtb基因組研究發(fā)現(xiàn)，有13個跨膜蛋白被推測屬于RND家族。由于這些蛋白僅限于在Mtb中發(fā)現(xiàn)，最終將它們命名為結核分支桿菌膜蛋白(MmpL)[27]。據(jù)報道，MmpL3、4、5、7、8、10和11參與細胞膜的生物合成[28-29]，此外，MmpL5和MmpL7有相關的抗結核藥[30-31]。

3 外排泵抑制劑對耐藥結核病的治療

對外排泵的深入研究也促進了藥物外排泵抑制劑的廣泛研究與應用。通過對Mtb藥物外排泵的功能鑒定和藥物外排泵抑制劑的研發(fā)將有利于耐藥性結核病的干預和治療[24]。高效外排泵抑制劑(EPIs)可用作輔助治療，基本上，外排泵的抑制作用可用于改善外排泵底物向細胞的轉(zhuǎn)運，以及藥物輸送。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制外排泵基因表達實現(xiàn)外排抑制，從根源干擾藥物外排泵的轉(zhuǎn)錄或翻譯是抑制藥物外排泵活性的有效策略[32]?；诟偁幮缘亟Y合到藥物外排泵的底物結合位點上并且外排出菌體，而原始的底物則留在菌體中實現(xiàn)殺菌作用的原理，研究開發(fā)了一大類肽模擬物，它們具有外排泵抑制劑的特性。該家族的第一個成員是MC-207-110，也稱為苯丙氨酸精氨酸β-萘酰胺(PAβN)，但由于其毒性而在臨床試驗中失敗。隨后發(fā)現(xiàn)了喹啉衍生物，這些化合物成功的使耐藥菌株對氯霉素、四環(huán)素和諾氟沙星敏感。根據(jù)相同的原理，具有多種側鏈的衍生物，如烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、氯喹啉等，在結構活性關系分析中顯示出積極的結果。通過與相對應的抗生素競爭性抑制實現(xiàn)藥物外排抑制。它們還具有有效藥代動力學特征以及對透化和膜功能改變的最小副作用的優(yōu)點[33]。

迄今為止，已顯示出許多化合物可以作為Mtb外排系統(tǒng)的潛在抑制劑，EPIs來源目前大致分為三類，包括化學合成、微生物代謝和天然產(chǎn)物。也有大量離子通道阻滯劑的研究，例如吩噻嗪，硫代噠嗪和氯丙嗪以及苯烷基胺維拉帕米[34]。目前各種來源于化學合成、微生物代謝以及天然產(chǎn)物的各類第三代外排泵抑制劑有的已開發(fā)到Ⅱ/Ⅲ臨床研究階段，但多數(shù)還處于臨床前階段或體外試驗，仍有難題需要去攻克。

4 展望

目前治療結核病的一大難點就是耐藥菌株的感染，在新藥研發(fā)進展緩慢的局面下，僅靠重復使用現(xiàn)有藥物很容易導致耐藥菌株的產(chǎn)生，深入研究結核菌耐藥機理及尋找新的藥物靶標迫在眉睫。外排泵作為研究的一大熱點，不僅僅參與物質(zhì)代謝，在阻止藥物進入菌體，保護菌體在宿主細胞中生存也至關重要。大量針對多藥外排泵的研究有益于加深人們對細菌多藥耐藥性機制的認識，對外排泵結構功能的研究為后期更好地理解外排泵及與其他耐藥機制之間的相互作用和開發(fā)安全有效的EPIs提供基礎，這對提高抗菌藥物的抗菌活性和改善臨床治療細菌感染疾病的現(xiàn)狀具有重要的意義。期望隨著對外排泵家族的深入研究，未來可以開發(fā)出用于臨床控制耐藥結核菌的藥物，解決困擾人類健康的一大難題。